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方法文章

从胚胎前脑中分离和培养内皮细胞

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DOI：

10.3791/51021

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2014年1月23日

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

本文内容

摘要

本视频展示了一种在10至12天内从胚胎前脑分离纯培养内皮细胞的简便且可靠的策略，将有助于针对脑血管生成多个方面的研究。

摘要

胚胎脑内皮细胞可作为研究血管生成以及神经血管发育和相互作用的重要工具。胚胎前脑的两个血管网络——软脑膜血管网络和室管膜周围血管网络——在空间上彼此分离，具有不同的起源和生长模式。来自软脑膜和室管膜周围血管网络的内皮细胞具有独特的基因表达谱和功能。本文中，我们提供了一种逐步分离、培养和鉴定胚胎前脑（端脑）室管膜周围血管网络（PVECs）中纯内皮细胞群体的实验方案。该方法中，取胚胎第15天小鼠的端脑组织（去除软脑膜），将其切碎后用胶原酶/分散酶消化，并通过机械方法分散成单细胞悬液。利用与MicroBeads偶联的抗CD31/PECAM-1抗体，通过强磁性分离法从细胞悬液中纯化PVECs。纯化后的细胞接种于胶原蛋白1 包被的培养皿中，在内皮细胞培养基中培养至融合后进行传代。通过相差显微镜和荧光显微镜观察，本方案获得的PVECs呈现铺路石样和纺锤形表型。通过内皮细胞标志物检测确认了PVEC培养物的纯度。在我们的实验条件下，该方法能够稳定、可靠地获得高纯度的PVEC群体。本方案将有助于深入理解前脑血管生成的分子机制、PVEC与其他细胞类型的相互作用及信号交流，并在治疗性血管生成研究中具有巨大潜力。

引言

血管生成、神经发生和神经元迁移是中枢神经系统（CNS）发育、修复和再生过程中的关键事件。多项精巧的研究表明，内皮细胞通过释放可溶性因子以及直接接触的方式，能够促进神经元增殖，反之亦然。我们注意到，在大多数此类研究1-3中，尽管神经前体细胞/神经干细胞来源于胚胎脑组织，却通常与来自成年脑组织、其他成年组织来源的内皮细胞或内皮细胞系进行共培养。这可能部分归因于从胚胎脑组织中分离并培养纯内皮细胞群体所面临的技术困难。然而，血管生成、神经发生和神经元迁移在胚胎脑中的发生强度远高于正常成年脑，并且这些过程在时间上是同步进行的。胚胎前脑（端脑）的室周血管网络起源于基底神经节原基内的一条血管，并在胚胎第11天（E11）之前以有序的梯度形式从端脑腹侧向背侧发育4,5。该室周血管网络的血管在起源、解剖位置、生长模式及发育调控方面均不同于软脑膜血管4,5。室周血管生成梯度的扩展方向与端脑横向神经发生梯度一致。在端脑内部，室周血管生成梯度与GABA能神经元的切向迁移梯度在空间上也存在重叠6。在时间上，血管生成梯度比神经发生梯度和GABA能神经元迁移梯度提前约一天。因此，室周内皮细胞在空间和时间上均处于有利位置，可为端脑神经发生和神经元迁移提供关键的调控信号4,6。因此，在神经前体细胞和/或神经元的共培养实验中使用胚胎期室周内皮细胞，将为研究神经血管相互作用，以及开发治疗神经退行性疾病或缺血性/创伤性脑损伤的新途径提供更为理想的模型。

我们强调去除软脑膜的重要性，不仅是为了减少上皮细胞的污染，也是为了分离分子和功能上不同于脑室周围血管网络内皮细胞的软脑膜内皮细胞4,6（为区别于软脑膜ECs，后者称为PVECs）。在此，我们描述了实验室常规使用的一种方法，用于获得丰富且高纯度的PVECs。这些内皮细胞来源于单只定时妊娠小鼠胚胎的前脑组织。它们可被成功扩增、传代并冻存，以供后续使用。

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方案

1. 试剂与溶液的配制

  1. 35 mm 培养皿的包被：I 型胶原蛋白溶液以溶于 20 mM 乙酸的水溶液形式提供（~100 mg 蛋白/瓶）。使用无菌组织培养级水将适量胶原蛋白溶液稀释至工作浓度 0.01%。每皿加入 1 ml 胶原蛋白溶液，在室温（RT）或 37 °C 下孵育 3–4 小时，或在 2–8 °C 下过夜孵育。吸除包被后多余的溶液，并使其过夜干燥。在加入培养基前，用组织培养级水或 PBS 洗涤培养皿。包被后的培养皿可在 4 °C 保存一个月。
  2. 制备完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）：向 DMEM（500 ml）中添加 10% 胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌素溶液（1× 浓度；1 ml/100 ml）。完全 DMEM 可在 4 °C 保存两个月。
  3. 制备一份 DMEM 分装液（50 ml），其中加入 DNase I（0.001 mg/ml）（称为 DMEM-DNase I）。
  4. 制备另一份 DMEM 分装液（10 ml），其中加入胶原酶和分散酶（1 mg/ml）（称为 DMEM-胶原酶/分散酶）。
  5. 制备内皮细胞培养基（ECCM，500 ml），添加 EGF（5 μg）、ECGS（100 mg）和 5 μl 抗生素-抗真菌素溶液。ECCM 可在 4 °C 保存两个月。
  6. 使用前将所有培养基预热。
  7. 制备纯化缓冲液：含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.2。保持缓冲液低温（2–8 °C）。

2. 胚胎的取出与端脑的分离

所有使用实验动物的实验均经麦克莱恩医院动物护理与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南。

  1. 使用孕程同步的 CD1 小鼠（胚胎发育第 15 天）。以发现阴道栓的当天记为胚胎发育第 0 天（E0）。CD1 母鼠通常产仔数量较多，因此每只怀孕母鼠可获得 10–12 只胚胎。
  2. 进行剖宫术时，通过腹腔注射 Ketamine（100 mg/kg）/Xylazine（5 mg/kg）对怀孕小鼠进行麻醉。对于体重约为 20–30 g 的小鼠，给予 0.3 ml 浓度为 10 ml/kg 的 Ketamine/Xylazine 麻醉剂溶液，并确保在腹腔注射麻醉剂过程中疼痛和不适最小化。注射时使用手动固定。
  3. 通过脚趾夹捏法检测深度麻醉状态。从深度麻醉的小鼠体内取出胚胎，取出后立即对每只胚胎进行断头处理。将胚胎头部置于含冰上预冷 PBS 的无菌培养皿中。
  4. 剖宫术后，立即采用过量麻醉剂（戊巴比妥钠 130 mg/kg，腹腔注射）实施安乐死，该方法符合《动物安乐死 AVMA 指南：2013 年版》。
  5. 在体视显微镜下，使用精细的显微剪和精细镊子从头部取出脑组织。注意：高质量的解剖操作对于成功剥离胚胎脑组织的软脑膜至关重要，需通过练习掌握。精细镊子和显微剪也是实现良好解剖的关键工具。
  6. 使用镊子牢固夹住脑组织，并用显微剪剥离软脑膜。去除中脑和后脑，分离出端脑。将所有胚胎的无软脑膜端脑转移至含有 2 ml 冰上预冷 PBS 的 35 mm 培养皿中。

3. 细胞分离

  1. 用手术刀片将端脑切碎成 1-2 mm 的组织碎片，并将组织收集到含有 2 ml 完全 DMEM 培养基的 15 ml Falcon 管中。
  2. 用 1 ml 移液枪轻柔但充分地吹打组织，直至团块消失，形成乳白色悬液。
  3. 在室温下以 800-1,000 × g 离心 5 分钟，分离解离后的细胞。
  4. 小心吸去上清液，将沉淀重悬于 DMEM-DNase I 溶液中。再次使用 1 ml 移液枪轻柔地解离细胞，然后在室温下以 800-1,000 × g 离心 5 分钟。
  5. 将沉淀重悬于预热的完全 DMEM 培养基中，通过无菌 70 μm 尼龙筛网过滤细胞。收集滤过的细胞并置于冰上保存。
  6. 收集滞留在筛网上的细胞部分，加入 DMEM-胶原酶/分散酶溶液（2 ml），在室温下继续消化 1-2 分钟。用 DMEM-DNase I 溶液洗涤细胞 3 次，每次在室温下以 800-1,000 × g 离心 5 分钟。将这些细胞与步骤 3.5 中收集的滤过细胞合并。用完全 DMEM 培养基洗涤总细胞一次。随后进行细胞计数和磁性标记操作。注意：磁性标记前必须获得单细胞悬液。

4. 磁性标记

  1. 本方案展示了对 107 个细胞进行磁性标记的方法。对于少于 107 的细胞数量，使用相同的试剂体积；对于多于 107 的细胞数量，相应增加所有试剂和总体积（例如，对于总共 2 × 107 个细胞，使用所有指定试剂体积的两倍）。所有试剂和细胞均需保持在冰上。
  2. 使用血细胞计数板确定细胞数量。
  3. 在室温下以 300 × g 离心细胞悬液 10 分钟，彻底吸除上清液。
  4. 向细胞沉淀中加入 90 μl/107 个细胞的纯化缓冲液，随后加入 10 μl CD31 MicroBeads。制造商提供的 MicroBeads 已与单克隆抗小鼠 CD31 抗体偶联。
  5. 充分混匀后，在冰箱中孵育 15 分钟。注意：磁性标记过程中温度过高和/或孵育时间过长可能导致非特异性结合。
  6. 通过加入 1–2 ml/107 个细胞的纯化缓冲液洗涤细胞，然后在 300 × g 下离心 10 分钟。去除上清液，并将细胞重悬于 500 μl 纯化缓冲液中。随后进行磁性分离或纯化步骤。

5. 纯化

  1. 将 MS 柱置于 MACS 分离器的磁场中。
  2. 用 500 μl 纯化缓冲液冲洗柱子。
  3. 将细胞悬液加到柱子上。向 MS 柱中加入适量的细胞，细胞数量过多可能导致柱子堵塞。注意：每个 MS 柱最多可容纳 2 × 107 个细胞，若细胞数量更多，应使用多个柱子。
  4. 收集并弃去流穿液，其中含有未标记的细胞。
  5. 用 500 μl 纯化缓冲液洗涤柱子三次。洗涤过程中，每次添加下一份纯化缓冲液前，确保柱子储液器已排空。
  6. 从 MACS 分离器上取下柱子，并将其放置在 15 ml Falcon 管上。
  7. MS 柱配套提供一个推杆。用移液器将 1 ml 纯化缓冲液加到 MS 柱上，然后立即通过用力将推杆插入柱子，快速洗脱磁标记的细胞。
  8. 将细胞接种于预先包被 I 型胶原的 35 mm 培养皿中，在设定为 37 °C、95% O2 和 5% CO2 的培养箱中，用 ECCM 培养细胞。
  9. 每四天更换一次培养基。当培养皿中细胞长至融合状态后 10–12 天，即可用于实验或进行传代培养。

6. PV ECS 的传代培养

  1. 移除ECCM，并用1-2 ml无菌PBS冲洗PVECS单层细胞。
  2. 轻柔加入1.5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，覆盖细胞单层。
  3. 将培养皿放回培养箱。5-7分钟内，细胞将从培养皿表面脱落。
  4. 细胞脱落后，立即加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，并反复吹打数次。
  5. 将细胞转移至无菌15 ml Falcon离心管中，在500 × g下离心5分钟。
  6. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml预温的ECCM中。
  7. 接种细胞用于扩增培养、成像或其他检测。

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结果

通过相差显微镜观察，展示了第1至12天PVEC的表型特征（图2）。第1天贴壁的细胞呈现出具有细胞分裂特征的形态（图2A）。在第5至8天期间，PVEC从铺路石样形态转变为典型的内皮细胞纺锤形形态，更接近其体内状态（图2B和图2C）。至第12天，PVEC培养物达到完全汇合（图2D）。PVEC易于传代培养以扩增细胞群体（图2E-G）。通过内皮细胞标志物——Isolectin B4、CD-31/PECAM-1、血管性血友病因子（vWF）和VE-Cadherin鉴定内皮细胞培养物的纯度，传代后确定纯度达到百分之百（图2H-K）。

来自CD1胚胎和Tie2-GFP胚胎的PVECs高倍镜图像4 （其内皮细胞表达GFP）如图所示图3）。除了常见的鹅卵石状和纺锤形形态外（图3A...

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讨论

与成年脑内皮细胞及其他组织来源的内皮细胞相比，PVEC在研究神经血管相互作用方面具有更高的生理相关性，并且具有治疗潜力。在PVEC制备过程中，从解剖开始就需迅速操作，以获得较高的细胞活力，因为死细胞可能会非特异性地结合到CD31 MicroBeads上。此外，如果在磁性标记步骤之前未能获得单细胞悬液，则会导致问题，因为细胞团块会堵塞层析柱。该方法的一个优势在于，无需使用胰蛋白酶孵育来使细胞从磁珠上解离，而这一过程在其他基于磁珠分离内皮细胞的方法中常见，且耗时、操作困难4,7。此外，该分离技术不需要大量胚胎脑组织。通常仅需一只定时交配的孕鼠，在约12天内即可稳定地制备PVEC，可进行传代培养，并广泛应用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）实验。

分离后肺血管内皮细胞（PVECs）的纯度超过90%，而传代后的PVECs纯度可达100%。除了内皮细胞外，PECAM-1也存在于单核细胞/巨噬细胞表面。然而，与出生后或成年小鼠脑组织相比，胚胎小鼠脑中作为中枢神经系统巨噬细胞群体的小胶质细胞含量极低8

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致谢

本工作获得了精神分裂症与抑郁症国家研究联盟（NARSAD）青年研究者奖以及美国国立卫生研究院资助项目R01NS073635（授予AV）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DNase ISigmaD-4527 
大鼠尾来源I型胶原溶液 SigmaC3867 
DPBSQuality Biologicals114057-131 
EDTAFisher ScientificM4055 
BSASigmaA2058 
MS 柱Miltenyi Biotech130-042-201 
CD31 磁珠Miltenyi Biotech130-097-418 
MACS 分离器Miltenyi Biotech130-042-102 
MACS 多管架Miltenyi Biotech130-042-303 
70 µm 细胞滤筛BD Bioscience352350 
抗生素与抗真菌溶液SigmaA5955 
FBSSigmaF4135 
胶原酶/分散酶Roche10269638001 
DMEM Lonza12-604F 
35 mm 培养皿BD Bioscience353001 
15 ml Falcon 管 BD Bioscience352097 
50 ml Falcon 管BD Bioscience352098 
ECCM 试剂盒BD Bioscience355054试剂盒包含内皮细胞生长补充剂、EGF 和大豆胰蛋白酶抑制剂
内皮细胞生长补充剂（ECGS）BD Bioscience354006 
RBECGMCell ApplicationsR819-500 
DMEM F12 Life Technologies10565-018 
GlutaMAXLife Technologies305050-061 
细胞培养级水Life Technologies15230162 
0.25% 胰蛋白酶Life Technologies15050 
大豆胰蛋白酶抑制剂BD Bioscience5425 
MatrigelBD Bioscience354234 
Qtracker 655 细胞标记试剂盒Life TechnologiesQ25021 
CellLight 质膜-RFP，BacMam 2.0Life TechnologiesC10608 
生物素标记的Isolectin B4抗体SigmaL2140 
抗血管性血友病因子抗体SigmaF3520 
抗CD31/PECAM-1抗体BD Pharmingen550274 
含DAPI的VECTASHIELD Hardset封片剂Vector LaboratoriesH-1500 
氯胺酮Butler Schein Animal Health Supply44028 
赛拉嗪Lloyd Laboratories1009 
体视显微镜MoticSMZ-168 
血细胞计数板Fisher Scientific267110 
倒置显微镜Olympus CK-40CK-40 
荧光显微镜Olympus FSX-100FSX-100 
精细镊子Roboz Surgical Instrument7 inox 
精细微头剪刀Roboz Surgical InstrumentRS5611 

参考文献

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