从胚胎前脑中分离和培养内皮细胞

摘要

本视频展示了一种在10至12天内从胚胎前脑分离纯培养内皮细胞的简便且可靠的策略，将有助于针对脑血管生成多个方面的研究。

摘要

胚胎脑内皮细胞可作为研究血管生成以及神经血管发育和相互作用的重要工具。胚胎前脑的两个血管网络——软脑膜血管网络和室管膜周围血管网络——在空间上彼此分离，具有不同的起源和生长模式。来自软脑膜和室管膜周围血管网络的内皮细胞具有独特的基因表达谱和功能。本文中，我们提供了一种逐步分离、培养和鉴定胚胎前脑（端脑）室管膜周围血管网络（PVECs）中纯内皮细胞群体的实验方案。该方法中，取胚胎第15天小鼠的端脑组织（去除软脑膜），将其切碎后用胶原酶/分散酶消化，并通过机械方法分散成单细胞悬液。利用与MicroBeads偶联的抗CD31/PECAM-1抗体，通过强磁性分离法从细胞悬液中纯化PVECs。纯化后的细胞接种于胶原蛋白1 包被的培养皿中，在内皮细胞培养基中培养至融合后进行传代。通过相差显微镜和荧光显微镜观察，本方案获得的PVECs呈现铺路石样和纺锤形表型。通过内皮细胞标志物检测确认了PVEC培养物的纯度。在我们的实验条件下，该方法能够稳定、可靠地获得高纯度的PVEC群体。本方案将有助于深入理解前脑血管生成的分子机制、PVEC与其他细胞类型的相互作用及信号交流，并在治疗性血管生成研究中具有巨大潜力。

引言

血管生成、神经发生和神经元迁移是中枢神经系统（CNS）发育、修复和再生过程中的关键事件。多项精巧的研究表明，内皮细胞通过释放可溶性因子以及直接接触的方式，能够促进神经元增殖，反之亦然。我们注意到，在大多数此类研究^1-3中，尽管神经前体细胞/神经干细胞来源于胚胎脑组织，却通常与来自成年脑组织、其他成年组织来源的内皮细胞或内皮细胞系进行共培养。这可能部分归因于从胚胎脑组织中分离并培养纯内皮细胞群体所面临的技术困难。然而，血管生成、神经发生和神经元迁移在胚胎脑中的发生强度远高于正常成年脑，并且这些过程在时间上是同步进行的。胚胎前脑（端脑）的室周血管网络起源于基底神经节原基内的一条血管，并在胚胎第11天（E11）之前以有序的梯度形式从端脑腹侧向背侧发育^4,5。该室周血管网络的血管在起源、解剖位置、生长模式及发育调控方面均不同于软脑膜血管^4,5。室周血管生成梯度的扩展方向与端脑横向神经发生梯度一致。在端脑内部，室周血管生成梯度与GABA能神经元的切向迁移梯度在空间上也存在重叠⁶。在时间上，血管生成梯度比神经发生梯度和GABA能神经元迁移梯度提前约一天。因此，室周内皮细胞在空间和时间上均处于有利位置，可为端脑神经发生和神经元迁移提供关键的调控信号^4,6。因此，在神经前体细胞和/或神经元的共培养实验中使用胚胎期室周内皮细胞，将为研究神经血管相互作用，以及开发治疗神经退行性疾病或缺血性/创伤性脑损伤的新途径提供更为理想的模型。

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方案

1. 试剂与溶液的配制

1. 35 mm 培养皿的包被：I 型胶原蛋白溶液以溶于 20 mM 乙酸的水溶液形式提供（~100 mg 蛋白/瓶）。使用无菌组织培养级水将适量胶原蛋白溶液稀释至工作浓度 0.01%。每皿加入 1 ml 胶原蛋白溶液，在室温（RT）或 37 °C 下孵育 3–4 小时，或在 2–8 °C 下过夜孵育。吸除包被后多余的溶液，并使其过夜干燥。在加入培养基前，用组织培养级水或 PBS 洗涤培养皿。包被后的培养皿可在 4 °C 保存一个月。
2. 制备完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）：向 DMEM（500 ml）中添加 10% 胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌素溶液（1× 浓度；1 ml/100 ml）。完全 DMEM 可在 4 °C 保存两个月。
3. 制备一份 DMEM 分装液（50 ml），其中加入 DNase I（0.001 mg/ml）（称为 DMEM-DNase I）。
4. 制备另一份 DMEM 分装液（10 ml），其中加入胶原酶和分散酶（1 mg/ml）（称为 DMEM-胶原酶/分散酶）。
5. 制备内皮细胞培养基（ECCM，500 ml），添加 EGF（5 μg）、ECGS（100 mg）和 5 μl 抗生素-抗真菌素溶液。ECCM 可在 4 °C 保存两个月。
6. 使用前将所有培养基预热。
7. 制备纯化缓冲液：含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.....

结果

通过相差显微镜观察，展示了第1至12天PVEC的表型特征（图2）。第1天贴壁的细胞呈现出具有细胞分裂特征的形态（图2A）。在第5至8天期间，PVEC从铺路石样形态转变为典型的内皮细胞纺锤形形态，更接近其体内状态（图2B和图2C）。至第12天，PVEC培养物达到完全汇合（图2D）。PVEC易于传代培养以扩增细胞群体（图2E-G）。通过内皮细胞标志物——Isolectin B4、CD-31/PECAM-1、血管性血友病因子（vWF）和VE-Cadherin鉴定内皮细胞培养物的纯度，传代后确定纯度达到百分之百（图2H-K）。

来自CD1胚胎和Tie2-GFP胚胎的PVECs高倍镜图像⁴ （其内皮细胞表达GFP）如图所示图3）。除了常见的鹅卵石状和纺锤形形态外（图3A.......

讨论

与成年脑内皮细胞及其他组织来源的内皮细胞相比，PVEC在研究神经血管相互作用方面具有更高的生理相关性，并且具有治疗潜力。在PVEC制备过程中，从解剖开始就需迅速操作，以获得较高的细胞活力，因为死细胞可能会非特异性地结合到CD31 MicroBeads上。此外，如果在磁性标记步骤之前未能获得单细胞悬液，则会导致问题，因为细胞团块会堵塞层析柱。该方法的一个优势在于，无需使用胰蛋白酶孵育来使细胞从磁珠上解离，而这一过程在其他基于磁珠分离内皮细胞的方法中常见，且耗时、操作困难^4,7。此外，该分离技术不需要大量胚胎脑组织。通常仅需一只定时交配的孕鼠，在约12天内即可稳定地制备PVEC，可进行传代培养，并广泛应用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）实验。

分离后肺血管内皮细胞（PVECs）的纯度超过90%，而传代后的PVECs纯度可达100%。除了内皮细胞外，PECAM-1也存在于单核细胞/巨噬细胞表面。然而，与出生后或成年小鼠脑组织相比，胚胎小鼠脑中作为中枢神经系统巨噬细胞群体的小胶质细胞含量极低⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNase I	Sigma	D-4527
大鼠尾来源I型胶原溶液	Sigma	C3867
DPBS	Quality Biologicals	114057-131
EDTA	Fisher Scientific	M4055
BSA	Sigma	A2058
MS 柱	Miltenyi Biotech	130-042-201
CD31 磁珠	Miltenyi Biotech	130-097-418
MACS 分离器	Miltenyi Biotech	130-042-102
MACS 多管架	Miltenyi Biotech	130-042-303
70 µm 细胞滤筛	BD Bioscience	352350
抗生素与抗真菌溶液	Sigma	A5955
FBS	Sigma	F4135
胶原酶/分散酶	Roche	10269638001
DMEM	Lonza	12-604F
35 mm 培养皿	BD Bioscience	353001
15 ml Falcon 管	BD Bioscience	352097
50 ml Falcon 管	BD Bioscience	352098
ECCM 试剂盒	BD Bioscience	355054	试剂盒包含内皮细胞生长补充剂、EGF 和大豆胰蛋白酶抑制剂
内皮细胞生长补充剂（ECGS）	BD Bioscience	354006
RBECGM	Cell Applications	R819-500
DMEM F12	Life Technologies	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
细胞培养级水	Life Technologies	15230162
0.25% 胰蛋白酶	Life Technologies	15050
大豆胰蛋白酶抑制剂	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 细胞标记试剂盒	Life Technologies	Q25021
CellLight 质膜-RFP，BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
生物素标记的Isolectin B4抗体	Sigma	L2140
抗血管性血友病因子抗体	Sigma	F3520
抗CD31/PECAM-1抗体	BD Pharmingen	550274
含DAPI的VECTASHIELD Hardset封片剂	Vector Laboratories	H-1500
氯胺酮	Butler Schein Animal Health Supply	44028
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	1009
体视显微镜	Motic	SMZ-168
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
倒置显微镜	Olympus CK-40	CK-40
荧光显微镜	Olympus FSX-100	FSX-100
精细镊子	Roboz Surgical Instrument	7 inox
精细微头剪刀	Roboz Surgical Instrument	RS5611