利用SynVivo合成微血管网络生成剪切黏附图谱

摘要

黏附实验中使用的流动室通常包含线性流动通道，需要在不同流速下进行多次实验才能生成剪切黏附图谱。SynVivo-SMN 能够利用微升级体积通过单次实验生成剪切黏附图谱，从而显著节省时间和耗材。

摘要

细胞/颗粒黏附实验对于理解疾病病理生理过程中涉及的生化相互作用至关重要，并在探索开发新型治疗手段方面具有重要应用。采用静态条件的实验无法反映黏附对剪切力的依赖性，从而限制了其与实际生理情况的相关性。 体内 环境。用于在生理流体流动条件下量化黏附的平行板流动腔需要进行多次实验才能生成剪切黏附图谱。此外，它们无法真实代表 体内 尺度和形态，并且实验需要大量（约毫升级）试剂。在本研究中，我们利用基于微血管网络的微流控装置 SynVivo-SMN，通过单次实验展示了剪切黏附图谱的生成。该装置可重建复杂的 体内 血管系统，包括几何尺度、形态学结构、流动特征以及细胞间相互作用 体外 从而为细胞行为、药物递送和药物发现的基础与应用研究提供一个符合生物学特性的环境。本实验通过研究2 µm生物素包被颗粒与微芯片上链霉亲和素包被表面的相互作用进行了验证。单次实验即可覆盖微循环中所观察到的全部剪切力范围，从而在生理条件下获得颗粒的黏附力与剪切力关系图谱。

引言

目前研究细胞间及颗粒-细胞相互作用的常用方法通常采用静态的孔板形式，其中颗粒或细胞在蛋白基质或贴壁细胞上孵育。在指定的孵育时间结束后，通过显微镜定量黏附的颗粒或细胞数量¹。尽管这些方法能够深入揭示这些相互作用背后的生化过程，但一个关键的局限性在于缺乏生理性的流体流动（类似于微循环环境），以及无法评估流体剪切力对颗粒黏附的影响。

为了克服这一局限性， 体外 近年来已开发出多种流动室装置。这些流动室的共同特点是采用透明装置，在低雷诺数条件下灌注，以模拟血管中观察到的管壁剪切速率 体内²血管壁通过在流动腔室的一个表面涂覆生物分子或培养细胞来模拟³. 颗粒^4-7 或细胞^8-16 然后在所需的流速范围内注入流体，以量化不同剪切速率下黏附的颗粒数量。

然而，使用平行板流动腔来研究和验证生化现象成本较高且耗时较长。这主要是因为需要进行多次实验，以生成流体剪切力与黏附颗粒/细胞数量之间的关系图。此外，由于平行板流动腔尺寸较大（高度较高），需要消耗大量试剂。 > 250 µm 和宽度 > 1 mm）。最后，这些装置无法准确模拟几何特征（例如，分叉）和流动条件（例如，会聚流与发散流）的存在 体内.

基于光刻的微加工技术最新进展^17-19 推动了芯片实验室设备领域的发展^20-21这些装置在开发微型化平行板流动腔方面发挥了重要作用，其尺寸已达到微米量级。尺寸的缩小也显著减少了实验所需的试剂、细胞或颗粒的体积。然而，目前可用装置的一个关键局限在于采用线性通道来模拟微血管，无法真实再现所观察到的复杂微血管结构。 体内.

我们近期开发出一种新方法，可将微血管网络重建于一次性塑料基底上，从而形成微血管网络的合成模型 体内 条件。这些设备称为 SynVivo-合成微血管网络（SMN），采用基于 PDMS 的软光刻工艺制备。SynVivo-SMN 设备可用于获取细胞/颗粒黏附的剪切黏附图谱²²，研究靶向药物递送²³ 并已通过验证 在体 数据^24-25本文介绍了一种实验方案，可通过单次实验在低至1-5 µl的微小体积中生成剪切黏附力图谱，从而显著节省资源与时间。

方案

1. 启动 SynVivo-SMN 微流控装置

1. 该装置的每个端口（入口/出口）均由两个平行端口组成——一个用于引入表面涂层分子（黏附分子、生长基质等）和/或用于接种的细胞，另一个用于运行实验（图1A）。
2. 将SynVivo-SMN微流控装置（图1B）完全浸入盛有无菌去离子水（DI水）的培养皿中，并将培养皿放入真空干燥器内。启动干燥器，直至装置通道内的所有空气被完全排出，此过程大约需要15分钟。
3. 在将装置从水中取出之前，使用尖头镊子将已预充满水的Tygon管（外径0.06英寸，内径0.02英寸）插入装置的每个端口。管子长度约为1英寸。此时可将装置从水中取出。图1C展示了装置连接管路后的图像。

2. 用目标蛋白包被微流控装置例如，亲和素）

1. 使用移液器在其中一个入口端口管路的底部周围滴加一滴水（约 100 µl）。小心移除用于预润湿装置的管路。水滴可防止空气进入装置。
2. 准备一支装有浓度为 20 µg/ml 亲和素的 1 ml 注射器。将注射器连接至一根 24 G 不锈钢针头和管路。将管路插入装置的一个入口端口。用鳄嘴夹夹闭未使用的入口端口。
3. 以 1 µl/min 的流速注入亲和素，持续 10 分钟，以确保装置完全灌注。流注结束后，用鳄嘴夹夹闭管路，并将装置置于 4 °C 过夜。

3. 进行黏附实验时流动生物素标记的微粒

1. 让装置恢复至室温。将装置放置在配备有电动载物台和高性能相机的倒置荧光显微镜上。
2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 × 10⁶ 个颗粒/ml 的 2 µm 生物素化颗粒溶液。将颗粒溶液装入 1 ml 注射器中。另准备一支仅含 PBS 的 1 ml 注射器。将两支注射器分别安装到注射泵上，并连接针头和管路。
3. 使用移液器，在进样口管路底部周围滴加一滴水（约 100 µl）。小心移除用于包被装置的管路。水滴可防止空气进入装置内部。
4. 将步骤 3.2 中连接生物素化颗粒和 PBS 的管路小心插入各自的进样口。 图 2A 显示了该装置的示意图。
5. 以 2.5 µl/min 的流速开始注入生物素化颗粒。在显微镜下观察进样口。一旦观察到颗粒进入，立即启动计时器，并持续流动 3 分钟。
6. 3 分钟结束后，停止注入生物素化颗粒，同时以 2.5 µl/min 的流速开始注入 PBS。让 PBS 在装置中流动 3 分钟，以洗去未结合的颗粒。

4. 使用成像软件（NIKON Elements）获取图像并进行兴趣区域（AOI）测量

1. 使用成像软件中的“扫描大图像”功能获取整个装置的图像。
2. 对装置中的分叉结构进行依次编号，并创建直径为通道两倍的圆形感兴趣区域（AOI）。本例中，由于通道直径为 100 µm，因此将 AOI 直径设为 200 µm。
3. 使用成像软件中的自动计数功能，将每个 AOI 中的颗粒数量导出至 Microsoft Excel 表格。
4. 同样，使用自动计数功能将整个装置中的颗粒总数导出。

5. 使用计算流体动力学（CFD）模型进行颗粒通量分析

1. 使用商用软件（CFD-ACE+，ESI公司）对SynVivo-SMN装置的拓扑结构进行CFD模拟。模拟结果存储在数据库中，用于分析实验观察结果。模拟结果包含装置内壁面剪切速率、流速、颗粒通量和黏附信息。
2. 利用模拟结果，根据给定的入口颗粒浓度，确定进入每个感兴趣区域（AOI）的颗粒数量。

6. 生成剪切黏附力图谱

1. 通过将分叉处黏附的颗粒数除以流经分叉处的颗粒数来计算黏附百分比，如公式6.1所示。
   
   其中，黏附颗粒数和流动颗粒数分别来自实验步骤4.3和5.2。
2. 利用步骤(5.1)数据库中获得的各分叉网络的剪切速率，以及由公式6.1计算得到的%黏附值，绘制剪切黏附图谱。

结果

图1A展示了SynVivo-SMN装置的示意图及其明场图像。图1B显示了安装在玻璃载片上的SynVivo-SMN装置。图1C显示了在真空干燥器中用水预处理后连接管路的装置。

图2A展示了实验装置的图像。图2B显示了2 µm生物素化颗粒结合后典型的链霉亲和素包被的SynVivo-SMN芯片。请注意，颗粒优先黏附在网络的分叉区域附近。

图3A 显示 SynVivo-SMN 网络中的编号分叉点。 图3B 显示由该装置的CFD模型生成的样本壁面剪切力分布图。装置内的剪切速率变化范围为250 sec⁻¹^-1 至15秒^-1 如在微血管系统中所观察到的那样 体内请注意，这些不同的剪切速率无法在直线型微流控通道中同时获得，因为直线型通道在每一流速下...

讨论

平行板流动腔虽然为细胞间及细胞-颗粒相互作用提供了重要见解，但存在若干局限性，例如试剂消耗量大，且需要多次实验才能生成剪切黏附图谱。采用SynVivo-合成微血管网络（SynVivo-SMNs）可在模拟生理条件的单次实验中生成剪切黏附图谱 体内 条件。此外，显著的节约（>试剂的纯度也达到95%以上。

使用SynVivo-SMN进行颗粒黏附实验时，最重要的步骤是在实验开始前确保芯片内无气泡。气泡的引入会导致流动不稳定，并使芯片中“气锁”区域无法被液体通达。因此，在将管路插入或拔出装置端口时必须格外小心。若在预灌注阶段发现装置内有气泡，可重复预灌注步骤以去除气泡。或者，也可以低流速（0.1 µl/min 或更低）注入培养基/试剂，确保装置完成无气泡的预灌注。

该方案的主要局限在于，一旦芯片内出现无法去除的气泡，芯片即无法继续使用。然而，通过仔细的操作练习，实验成功率可接近100%。此外，剪切力黏附图的生成需要来自计算流体动力学（CFD）模型的信息。但通过预先计算不同流动条件下的CFD结果数据库，可轻松避免...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SynVivo-SMN	CFD Research	SMN-001	CFDRC 独家提供
CFD-ACE+	ESI Inc.	N/A
亲和素	Invitrogen	43-4401	本实验可使用任何来源的亲和素
生物素化微粒	Polysciences	24173-1	本实验可使用任何来源的生物素化微粒
Tygon 导管	VWR	63018-044	尺寸适用于 SynVivo-SMN 系统
NIKON Elements	NIKON Instruments	N/A	也可使用其他成像软件