我们在此描述一种简单的荧光方法 原位 一种用于定位昆虫和植物组织中病毒与细菌的荧光原位杂交（FISH）方法。该方案可扩展用于整体标本及显微切片中 mRNA 的可视化。
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摘要
摘要
荧光原位杂交（FISH）是一系列常用技术的统称，广泛用于真核细胞中基因转录本的可视化，也可进一步改造用于观察细胞中的其他组分，例如病毒和细菌感染。在感染过程中对病毒和细菌进行空间定位与可视化，是响应不同刺激所开展的表达谱分析实验（如微阵列和RNA测序）的重要补充步骤。理解这些病原体在时空上的感染动态，有助于补充旨在揭示其与细胞组分相互作用的生物学实验。目前已有多种用于可视化病毒和细菌的技术，例如报告基因系统或免疫组织化学方法，但这些方法通常耗时较长，部分技术仅适用于模式生物 ，且涉及复杂的操作流程。而以细胞内RNA或DNA为目标的FISH技术，则是一种相对简便、快速的方法，可用于研究基因的时空定位以及诊断目的。当实验方案采用较短的、商业购买的探针时，该方法具有较强的稳健性且易于实施，且探针价格相对低廉。当样本制备、固定、杂交和显微观察等步骤不涉及复杂操作时，该方法尤为可靠。本文描述了一种用于昆虫和植物组织中细菌与病毒定位的实验方案。该方法基于对昆虫整体封片和解剖器官或手工制作的植物切片进行简单制备、固定和杂交，使用长度为20个碱基、在5'或3'端偶联荧光染料的短DNA探针。该方案已成功应用于多种昆虫和植物组织，可用于分析细胞内mRNA或其他RNA或DNA物种的表达情况。
引言
在研究植物病毒及其他病原体与其感染的植物寄主之间的相互作用时，无论这些病原体是否对寄主产生负面影响，重要的是要在原位（in situ）可视化这些病原体及其相应的核酸。这一点在研究病原体在植物细胞内及细胞间移动时尤为重要。in situ 定位病原体的基因产物是研究致病过程的重要补充手段。许多植物病原体，尤其是病毒，通过昆虫传播，并与传播媒介存在复杂而密切的相互作用。因此，将这些病毒在其媒介昆虫体内的定位对于研究其传播路径以及可能的体内相互作用位点具有重要意义。某些由昆虫传播的植物病毒的传播过程受到存在于这些昆虫体内的内共生细菌的促进。为了更深入地研究这些植物病毒通过媒介昆虫的传播机制，同样有必要对内共生细菌进行可视化，特别是那些参与病毒传播的内共生细菌。因此，期望实现病毒与内共生细菌的共定位，以探究这些生物在昆虫寄主体内的潜在关系。除了病毒传播外，内共生细菌还影响昆虫媒介生物学的多个方面，因此，这些细菌在昆虫体内的空间定位具有高度的研究价值和重要性。
番茄黄化曲叶病毒 （TYLCV）（Begomovirus，Geminiviridae）是全球栽培番茄最重要的病毒病害复合体1-4TYLCV 是一种局限于韧皮部的病毒，仅由烟粉虱传播。 烟粉虱 tabaci 5,6提出了一种描述双生病毒在其烟粉虱媒介中易位的模型6-9两个特定屏障在此循环传播过程中被主动穿越：中肠/血淋巴屏障和血淋巴/唾液腺屏障。该传播过程被认为由未知的受体介导，这些受体可识别病毒衣壳。TYLCV被认为能够穿越 B. tabaci 中肠6,10，并通过主要唾液腺吸收6 在注入植物之前，番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）会与烟粉虱血淋巴中由昆虫次生共生细菌产生的GroEL蛋白相互作用。 Hamiltonella 这种相互作用可确保TYLCV在血淋巴中的安全运输，并保护其免受昆虫免疫系统的攻击11. Hamiltonella 和 Portiera，粉虱的主要内共生菌，定殖于血淋巴中的细菌细胞（bacteriocytes）内，这类昆虫细胞用于容纳内共生细菌11. B. tabaci 还含有其他内共生细菌，包括 立克次体，Arsenophonus，Wolbachia, 和 Fritschea，可定位于 bacteriocytes 内部或外部，并对昆虫的生物学特性产生多种影响12.
已有若干研究报告尝试通过耗时且昂贵的技术（如透射电子显微镜（TEM）、抗体检测以及对显微切片进行RNA原位杂交）来研究番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）在植物和烟粉虱体内的定位10,13；最近一项研究则描述了一种利用简单方法对植物病毒在其植物宿主及传播介体宿主体内进行定位的技术14。本文中，我们介绍一种简便的方法，用于检测TYLCV在烟粉虱（B. tabaci）解剖所得的中肠和唾液腺中的分布，以及在TYLCV侵染植株组织切片中的分布。我们还进一步描述了B. tabaci主要内共生菌Portiera及其次要内共生菌Hamiltonella、Rickettsia和Arsenophonus的定位。该方法基于使用在5'端荧光标记的短DNA探针，该探针可特异性地与病毒或细菌基因序列中的互补序列杂交。样品处理相对简便，且获得的信号具有高度特异性。本方法可用于病毒、细菌及其他病原体在植物、动物和昆虫宿主中的定位，也可用于任意组织中mRNA的定位研究。
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方案
1. 普通粉虱, 用于FISH分析的植物与病毒样本制备
- 在棉苗上饲养B型和Q型烟粉虱Gossypium hirsutum L. cv. Acala）置于防虫笼和人工气候室中，在25±2 °C、相对湿度60%、14小时光照/10小时黑暗光周期的标准条件下培养。
- 使用针对内共生菌的特异性引物，通过PCR检测内共生菌感染，方法如前所述15-19.
- 购买番茄幼苗（Solanum esculentum cv. 牛排）从商业苗圃购买或播种番茄种子。
- 在上述相同的培养条件下继续培育，直至植株达到四片真叶期，此时期最适合进行烟粉虱介导的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）接种。15 （见下文第4.1节）。
2. 内共生菌FISH的昆虫处理、固定、探针设计、杂交与可视化
- 从棉花植株上用负压吸取法采集10只成年粉虱，或选取10只3龄若虫rd 或 4th 从棉叶上采集的龄期若虫。
- 立即将样本浸入Eppendorf管中的卡诺固定液（氯仿-乙醇-冰醋酸，6:3:1，体积比）中，固定2小时至过夜（建议过夜）。
- 完全去除固定剂，并在6% H2O2 在乙醇中放置 2 小时。
- 将样本置于无水乙醇中，于室温下保存数天至数周，或直接进行下一步操作。
- 根据每种细菌的16S核糖体RNA基因设计互补的反向DNA引物作为探针。在设计探针时，应遵循与设计PCR引物相同的原则。使用以下寡核苷酸探针特异性靶向：BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3'、Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3'、BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3' 和 Ars2 5'-cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3' 沃尔巴克氏体，立克次氏体, Hamilonella, 和 Arsenophonus 分别。
- 在杂交缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.9 M NaCl，0.01% [wt/vol] 十二烷基硫酸钠，30% [vol/vol] 甲酰胺）中，加入每毫升含10 pmol荧光探针，于避光条件下过夜杂交。必要时可联合使用带有不同荧光染料的多个探针。以未感染且含有目标细菌的烟粉虱以及不加探针的样本作为阴性对照。
- 将样品整体置于载玻片上，加入含液体封闭剂的杂交缓冲液，盖上盖玻片，用指甲油封片，然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
3. 烟粉虱器官解剖、固定、杂交及TYLCV FISH的可视化
- 通过吸取法收集持续在感染TYLCV的番茄植株上饲养的成虫烟粉虱 ，并用浸有丙酮的滤纸条进行麻醉。丙酮暴露时间仅限1–2分钟，因过长暴露会导致烟粉虱组织固定。使用在未感染番茄植株上饲养的非带毒烟粉虱以及无探针样本作为对照，以确认杂交的特异性。
- 将烟粉虱置于凹面载玻片上，在体视显微镜下进行器官解剖。
- 将昆虫头部从前胸拉离，并在添加1%甲苯胺蓝染料的1×PBS中解剖唾液腺，以增强其微小结构的可视性。染色吸收时间为2–3分钟。
- 在胸腹部连接处将昆虫拉开，观察并挤出中肠。用镊子挤压腹部末端，排出腹部内容物。
- 轻轻移除成功解剖样本中的PBS和甲苯胺蓝溶液，再缓慢加入300 µl Carnoy固定液，固定器官5分钟。
- 从凹面孔的一侧加入固定液，避免从上方滴加，以防解剖后的器官发生不受控移动。一旦接触固定液，器官将粘附于玻璃表面，并在整个过程中保持固定不动。
- 去除固定液后，加入500 µl杂交缓冲液，并添加10 pmol的荧光DNA探针Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3'，该探针与TYLCV外壳蛋白基因中的某段序列互补。
- 将载玻片置于底部铺有湿润滤纸的小型塑料湿盒内，避光室温孵育过夜，完成杂交反应。
- 杂交完成后，用精细解剖工具小心拾取器官，迅速转移至另一洁净载玻片上，该载玻片已预先加入30 µl含DAPI（0.1 mg/ml 溶于1×PBS）的新鲜杂交缓冲液，并含有液体阻断剂。
- 盖上盖玻片，用指甲油封片，随后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
4. TYLCV FISH 实验中的植物处理、徒手切片、固定与杂交
- 使用带毒烟粉虱介导接种法对番茄幼苗接种番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）。接种后一周，即使植株未表现出症状，也可通过本FISH方法检测到病毒。典型的病害症状通常在接种后三周出现。使用未感染的番茄植株和无探针样本作为对照，以确认杂交的特异性。
- 使用锋利的组织学剃刀刀片，手工切取2–4 cm长的番茄茎和叶的纵切面或横切面。
- 将切片置于Eppendorf管中，用Carnoy固定液在室温下固定2小时至过夜 。
- 去除固定液，将切片保存在无水乙醇中，室温下可保存数天至数周，或直接进行下一步操作。
- 用杂交缓冲液洗涤切片三次，每次1分钟。
- 在500 µl杂交缓冲液中加入10 pmol荧光寡核苷酸探针Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3'（该探针与TYLCV外壳蛋白基因的一段序列互补），将切片与此混合液进行杂交。
- 用杂交缓冲液洗涤切片三次，每次1分钟。
- 将切片整体封片于含有DAPI（0.1 mg/ml 溶于1x PBS）并添加液体封片剂的杂交缓冲液中，盖上盖玻片，用指甲油封边，然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
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结果
本文所研究的系统如图所示 图1 包括一株感染TYLCV的植物、一只成虫和一只若虫的烟粉虱 B. tabaci， 烟粉虱内部解剖结构，显示番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）在昆虫体内的转运路径。 图2 显示成年粉虱中初级共生菌的双重FISH检测 Portiera 以及次级共生菌 Arsenophonus 图3 显示双重FISH Portiera 和 哈密顿氏菌， 和 图4 显示双重FISH Portiera 和 立克次体， 两个图中的 B. tabaci 4th 若虫龄期. 图5 显示烟粉虱解剖中肠中TYLCV的FISH检测及DAPI染色结果，以及 图6 显示烟粉虱解剖后的主唾液腺中TYLCV的FISH检测及DAPI染色结果。 图7
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讨论
本文所述方法可用于植物病毒在其植物寄主和昆虫介体中的定位，以及内共生细菌在其特定烟粉虱寄主中的定位，该方法可进一步适用于其他植物病毒甚至动物组织中病毒的定位。此外，该方案也可用于植物和动物系统中内共生细菌、致病性细菌及其他微生物的定位。所描述的方法基于一个简单的原理，即使用短的、荧光标记的寡核苷酸DNA探针 与细胞内的靶标DNA或RNA分子进行杂交。结果可实现特异性杂交，背景信号极低，并可通过荧光显微镜或共聚焦显微镜检测到信号。可同时使用多种针对不同基因、带有不同荧光染料的探针，从而在同一细胞或组织中实现多个靶标的可视化。本方案所述操作步骤简便，样品处理时间极短。相较于其他方法常存在的高背景信号、标本处理耗时长以及需要大量昂贵试剂等问题，本方案均无此类限制。
本文所描述的实验方案使用了烟粉虱（B. tabaci）的B型和Q型生物型；然而，饲养条件适用于任何烟粉虱生物型，只需使用其相应的寄主植物即可。在所述条件下，烟粉虱的生命周期约为三周。本研究所用的B型种群个体均感染了初级内共生菌Portiera，以及次级内共生细菌Hamilt...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Ghanim 实验室的研究工作得到了德国-以色列基金会（GIF）提供的研究资助（项目编号 908-42.12/2006）、美国-以色列双边农业研究与发展基金（BARD）提供的资助（项目编号 IS-4062-07）以及以色列科学基金会（ISF）向 M.G. 提供的研究资助（项目编号 884/07）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光标记探针 | Metabion | 20 bp，HPLC 纯化 | 序列由客户设计 |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | 分子生物学级 |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F9037 | 分子生物学级 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | 分子生物学级 |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich | 320099 | 分子生物学级 |
| 液体阻断剂 | Ted Pella Inc. | 22309 |
参考文献
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