荧光原位杂交（FISH）用于植物和昆虫组织中病毒及内共生细菌的定位

摘要

我们在此描述一种简单的荧光方法 原位 一种用于定位昆虫和植物组织中病毒与细菌的荧光原位杂交（FISH）方法。该方案可扩展用于整体标本及显微切片中 mRNA 的可视化。

摘要

荧光原位杂交（FISH）是一系列常用技术的统称，广泛用于真核细胞中基因转录本的可视化，也可进一步改造用于观察细胞中的其他组分，例如病毒和细菌感染。在感染过程中对病毒和细菌进行空间定位与可视化，是响应不同刺激所开展的表达谱分析实验（如微阵列和RNA测序）的重要补充步骤。理解这些病原体在时空上的感染动态，有助于补充旨在揭示其与细胞组分相互作用的生物学实验。目前已有多种用于可视化病毒和细菌的技术，例如报告基因系统或免疫组织化学方法，但这些方法通常耗时较长，部分技术仅适用于模式生物 ，且涉及复杂的操作流程。而以细胞内RNA或DNA为目标的FISH技术，则是一种相对简便、快速的方法，可用于研究基因的时空定位以及诊断目的。当实验方案采用较短的、商业购买的探针时，该方法具有较强的稳健性且易于实施，且探针价格相对低廉。当样本制备、固定、杂交和显微观察等步骤不涉及复杂操作时，该方法尤为可靠。本文描述了一种用于昆虫和植物组织中细菌与病毒定位的实验方案。该方法基于对昆虫整体封片和解剖器官或手工制作的植物切片进行简单制备、固定和杂交，使用长度为20个碱基、在5'或3'端偶联荧光染料的短DNA探针。该方案已成功应用于多种昆虫和植物组织，可用于分析细胞内mRNA或其他RNA或DNA物种的表达情况。

引言

在研究植物病毒及其他病原体与其感染的植物寄主之间的相互作用时，无论这些病原体是否对寄主产生负面影响，重要的是要在原位（in situ）可视化这些病原体及其相应的核酸。这一点在研究病原体在植物细胞内及细胞间移动时尤为重要。in situ 定位病原体的基因产物是研究致病过程的重要补充手段。许多植物病原体，尤其是病毒，通过昆虫传播，并与传播媒介存在复杂而密切的相互作用。因此，将这些病毒在其媒介昆虫体内的定位对于研究其传播路径以及可能的体内相互作用位点具有重要意义。某些由昆虫传播的植物病毒的传播过程受到存在于这些昆虫体内的内共生细菌的促进。为了更深入地研究这些植物病毒通过媒介昆虫的传播机制，同样有必要对内共生细菌进行可视化，特别是那些参与病毒传播的内共生细菌。因此，期望实现病毒与内共生细菌的共定位，以探究这些生物在昆虫寄主体内的潜在关系。除了病毒传播外，内共生细菌还影响昆虫媒介生物学的多个方面，因此，这些细菌在昆虫体内的空间定位具有高度的研究价值和重要性。

番茄黄化曲叶病毒 （TYLCV）（Begomovirus，Geminiviridae）是全球栽培番茄最重要的病毒病害复合体^1-4TYLCV 是一种局限于韧皮部的病毒，仅由烟粉虱传播。 烟粉虱 tabaci ^5,6提出了一种描述双生病毒在其烟粉虱媒介中易位的模型^6-9两个特定屏障....

方案

1. 普通粉虱, 用于FISH分析的植物与病毒样本制备

1. 在棉苗上饲养B型和Q型烟粉虱Gossypium hirsutum L. cv. Acala）置于防虫笼和人工气候室中，在25±2 °C、相对湿度60%、14小时光照/10小时黑暗光周期的标准条件下培养。
2. 使用针对内共生菌的特异性引物，通过PCR检测内共生菌感染，方法如前所述^15-19.
3. 购买番茄幼苗（Solanum esculentum cv. 牛排）从商业苗圃购买或播种番茄种子。
4. 在上述相同的培养条件下继续培育，直至植株达到四片真叶期，此时期最适合进行烟粉虱介导的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）接种。¹⁵ （见下文第4.1节）。

2. 内共生菌FISH的昆虫处理、固定、探针设计、杂交与可视化

1. 从棉花植株上用负压吸取法采集10只成年粉虱，或选取10只3龄若虫^rd 或 4^th 从棉叶上采集的龄期若虫。
2. 立即将样本浸入Eppendorf管中的卡诺固定液（氯仿-乙醇-冰醋酸，6:3:1，体积比）中，固定2小时至过夜（建议过夜）。
3. 完全去除固定剂，并在6% H₂O_2....

结果

本文所研究的系统如图所示 图1 包括一株感染TYLCV的植物、一只成虫和一只若虫的烟粉虱 B. tabaci， 烟粉虱内部解剖结构，显示番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）在昆虫体内的转运路径。 图2 显示成年粉虱中初级共生菌的双重FISH检测 Portiera 以及次级共生菌 Arsenophonus 图3 显示双重FISH Portiera 和 哈密顿氏菌， 和 图4 显示双重FISH Portiera 和 立克次体， 两个图中的 B. tabaci 4^th 若虫龄期. 图5 显示烟粉虱解剖中肠中TYLCV的FISH检测及DAPI染色结果，以及 图6 显示烟粉虱解剖后的主唾液腺中TYLCV的FISH检测及DAPI染色结果。 图7

讨论

本文所述方法可用于植物病毒在其植物寄主和昆虫介体中的定位，以及内共生细菌在其特定烟粉虱寄主中的定位，该方法可进一步适用于其他植物病毒甚至动物组织中病毒的定位。此外，该方案也可用于植物和动物系统中内共生细菌、致病性细菌及其他微生物的定位。所描述的方法基于一个简单的原理，即使用短的、荧光标记的寡核苷酸DNA探针 与细胞内的靶标DNA或RNA分子进行杂交。结果可实现特异性杂交，背景信号极低，并可通过荧光显微镜或共聚焦显微镜检测到信号。可同时使用多种针对不同基因、带有不同荧光染料的探针，从而在同一细胞或组织中实现多个靶标的可视化。本方案所述操作步骤简便，样品处理时间极短。相较于其他方法常存在的高背景信号、标本处理耗时长以及需要大量昂贵试剂等问题，本方案均无此类限制。

本文所描述的实验方案使用了烟粉虱（B. tabaci）的B型和Q型生物型；然而，饲养条件适用于任何烟粉虱生物型，只需使用其相应的寄主植物即可。在所述条件下，烟粉虱的生命周期约为三周。本研究所用的B型种群个体均感染了初级内共生菌Portiera，以及次级内共生细菌Hamilt.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光标记探针	Metabion	20 bp，HPLC 纯化	序列由客户设计
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771	分子生物学级
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F9037	分子生物学级
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	分子生物学级
冰醋酸	Sigma-Aldrich	320099	分子生物学级
液体阻断剂	Ted Pella Inc.	22309