通过VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性的基因

摘要

病毒诱导的基因沉默是鉴定植物非寄主抗性相关基因的有效工具。我们展示了利用表达 GFPuv 的细菌病原体来鉴定基因沉默后对非寄主病原体敏感的植物。该方法简便、快速，有利于大规模筛选，类似的实验方案也可应用于研究多种其他植物-微生物互作关系。

摘要

植物对细菌病原菌的非寄主抗病性由复杂的防御通路调控。阐明这一机制对于培育能够抵抗多种病原菌的持久抗病植物具有重要意义。基于病毒诱导基因沉默（VIGS）的正向遗传学筛选是鉴定赋予非寄主抗性的植物防御基因的有效方法。Tobacco rattle virus（TRV）为基础的VIGS载体是目前最高效的VIGS载体，已在Nicotiana benthamiana中成功用于沉默内源性靶基因。

在本研究中，我们展示了一种正向遗传学筛选方法，通过在本氏烟草（N. benthamiana）中对cDNA文库中的单个克隆进行基因沉默，并评估这些基因沉默植株对非寄主病原菌——丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato T1）、丁香假单胞菌大豆致病变种（P. syringae pv. glycinea）和野油菜黄单胞菌辣椒致病变种（X. campestris pv. vesicatoria）——的非寄主抗性是否受损。这些细菌病原菌经基因工程改造后可表达GFPuv蛋白，在接种非寄主病原菌的植株中，若被沉默的目标基因参与了非寄主抗性的建立，则可在紫外光下肉眼观察到其绿色荧光菌落。该方法有助于快速、可靠地鉴定出对非寄主病原菌敏感的基因沉默植株。此外，通过测序TRV载体中插入的植物基因片段，可获得有潜力的候选基因信息。本文中，我们展示了利用VIGS介导的正向遗传学方法高效鉴定参与非寄主抗性相关基因的能力。大约100个cDNA可在约两到三周内逐一实现沉默，随后一周内即可研究其在抵抗多种非寄主细菌病原菌中的作用。本文详细列举了该筛选过程中的各个步骤。VIGS介导的正向遗传学筛选策略不仅可用于鉴定参与非寄主抗性的基因，还可拓展应用于研究多种植物物种中赋予生物和非生物胁迫耐受性的相关基因。

引言

非寄主抗性是指所有植物物种对某种特定病原菌小种的抗性^1,2。这种抗性赋予植物广谱且持久的抗病能力^2,3。然而，其作用机制，尤其是针对细菌性病原菌的机制，尚不十分清楚⁴。筛选破坏非寄主抗性的突变体或基因沉默植株，以及通过高通量转录谱分析鉴定非寄主抗性过程中差异表达的基因^5-9，是以往解析细菌非寄主抗性的两种主要方法。由于非寄主抗性受一个或多个复杂机制⁴调控，并涉及多个基因的参与，因此采用高通量功能基因组学方法进行基因鉴定，对于深入理解非寄主抗性机制至关重要。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）已成功用于在多种植物中沉默内源性植物基因^10,11。Nicotiana benthamiana 是最适合进行 VIGS 的植物之一^10,12，其基因组草图序列现已公布¹³。基于烟草脆裂病毒（TRV）的 VIGS 已被广泛用作反向遗传学工具，以鉴定参与非寄主抗性的基因^2,4,14。这些 VIGS 载体及其衍生载体现可通过拟南芥生物资源中心（ABRC，http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html）获得。VIGS 也被用作正向遗传学工具，用于鉴定参与植物免疫的基因^15-17，尤其是非寄主抗性相关基因^6,18。评估植物针对特定非寄主病原菌诱导的超敏反应（HR）介导的细胞死亡，以及评估病原菌致病引起的细胞死亡，是鉴定感病基因沉默植株的两种主要检测方法。然而，HR 细胞死亡仅在应对 II 型非寄主病原菌时被诱导，而不会在应对 I 型非寄主病原菌时发生²。因此，HR 检测不能普遍用于鉴定植物所采用的非寄主抗性机制，特别是针对广泛存在的 I 型非寄主病原菌。此外，基因沉默植株中非寄主抗性的部分丧失并不总是导致明显的病害症状⁶，因此病害评分法无法用于鉴定非寄主抗性受损的植株。相反，检测非寄主病原菌在基因沉默植株中的生长情况，是研究基因沉默植株中非寄主抗性丧失的更优方法。

与传统的生长测定法^6,19相比，通过在基因沉默植株上快速评估非寄主细菌的生长 ，可缩短正向遗传学筛选所需的时间。我们此前曾报道一种利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌，在紫外光（UV）下通过肉眼观察细菌病原菌在叶片上生长的方法¹⁹。本文中，我们展示了利用表达GFPuv的非寄主细菌病原菌，可简便地识别在非寄主抗性方面功能受损的基因沉默植株。该方法在鉴定感病植株方面具有高准确性，并适用于高通量筛选。

方案

1. 植物生长与靶基因沉默

1. 植物生长条件：
   1. 将N. benthamiana种子播种于无土栽培基质Metro-Mix 350中，并在生长室中进行萌发。也可使用其他土壤或无土介质替代Metro-Mix。
   2. 将三周龄的幼苗移栽至单独的花盆中，在温室中于21±2 °C条件下培养，其他生长条件详见先前文献¹²。移栽后两到三天，植株即可用于TRV接种。
2. TRV2克隆的培养：
   TRV是一种双组分病毒，其基因组由RNA1和RNA2组成。RNA1编码RNA依赖性RNA聚合酶和运动蛋白^20,21。RNA2通过亚基因组RNA编码衣壳蛋白（CP）及两种非结构蛋白²¹。RNA1和RNA2均为成熟病毒颗粒的形成及其扩散所必需^20,21。TRV2载体中cDNA文库的构建方法已在先前文献中描述^22,23。简而言之，本研究中使用的VIGS文库是基于从经受多种生物和非生物诱导子处理的叶片组织中提取的RNA构建的。
   1. 从冰箱中取出含有TRV2载体中cDNA克隆的Agrobacterium（GV2260菌株）（96孔板），缓慢解冻。待菌液恢复至室温后，使用96针复制器将各Agrobacterium菌株分别接种至含利福平（10 μg/ml）和卡那霉素（50 μg/ml）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。
   2. 在28 °C下培养两天。通常每个克隆培养四个重复菌落，以确保针刺接种两株植物时有充足的Agrobacterium接种物。所有操作均需在无菌条件下进行。
3. VIGS实验：
   1. 在28 °C下，将携带TRV1的Agrobacterium（GV2260）于含上述抗生素的LB液体培养基中培养。通过离心收集过夜培养的菌体，重悬于接种缓冲液（10 mM MES，pH 5.5；200 μM乙酰丁香酮）中，并在室温下以50 rpm振荡孵育3小时。
   2. 再次离心收集菌体，重悬于5 mM MES缓冲液（pH 5.5）中，调整OD₆₀₀至0.3，使用无针头注射器将菌液接种至3-4片N. benthamiana叶片的远轴面。详细的接种步骤已在先前文献中展示²⁴。随后，在TRV1接种位点处，用牙签刺破叶片，接种相应的TRV2菌落。
   3. 为确保高效的VIGS效果，需为植株提供充足的营养并维持其旺盛生长¹²。接种约两周后，目标基因的转录水平开始下降；三周后，植株即可用于病原菌接种实验。

2. 非寄主病原菌培养物的制备与植物接种

1. 本研究中所用病原体的详细信息：
   Pseudomonas syringae pv. tabaci, P. syringae pv. 番茄 T1, P. syringae pv. glycinea 和 野油菜黄单胞菌 pv. vesicatoria 本研究中使用了。培养 P. syringae 在添加利福平（10 μg/ml）和卡那霉素（50 μg/ml）的King's B（KB）液体培养基中，于28 °C培养12小时。培养 X. campestris pv. vesicatoria 在LB液体培养基中培养16小时。所有病原菌均含有一个可表达的质粒 GFPuv 如先前文献所述¹⁹.
2. 植物接种用病原菌培养物的制备
   1. 通过离心收集细菌细胞，并在暗处使用长波长紫外灯确认绿色荧光的存在。用无菌水洗涤细胞两次，然后用无菌水重悬至所需浓度。
   2. 将相应的病原体接种到目标基因沉默叶片的远轴面（5^th 至 8^th）作为斑点（直径约1.5 cm）。可同时检测多种非寄主病原菌在目标基因沉默植株中的生长情况。同时接种寄主病原菌，作为观察的阳性对照 在植株中 细菌生长。同时接种空载体对照（TRV::00）植株。

3. 观察 在植株中 细菌病原体的培养

1. 在暗处用长波长紫外光照射接种过的叶片。细菌菌落可在叶片远轴面呈现为绿色荧光点，背景为叶表面发出的红色荧光。
2. 观察接种后第2天至第5天（dpi）的病原菌生长情况。在此期间需每天进行观察。
3. 初筛后，列出那些基因沉默导致一种或多种非寄主病原菌生长的克隆。
4. 对所选克隆重复进行VIGS，并再次检测基因沉默植株对非寄主病原菌的反应。此第二轮筛选旨在排除初筛中获得的假阳性结果。

4. 非寄主抗性受损植物的确认

1. 如上所述，对筛选获得的cDNA克隆进行沉默处理。通过将植物浸入含有非寄主病原菌（或多种非寄主病原菌）并添加0.01% (v/v) Silwet L-77的培养液中，并对浸没的植物施加真空处理3–5分钟，从而对整株植物进行接种。按照下文所述方法，通过常规生长测定法^6,18,19定量检测细菌生长情况。
2. 在接种后0小时（hpi）、3天（dpi）和5天（dpi）时，使用叶盘打孔器（0.5 cm²）从每种接种了非寄主病原菌的植物中分别采集五组生物学重复样本，每组取两片叶片。研磨叶片样品后进行系列稀释，将汁液接种于添加适当抗生素的KB琼脂培养基上，于28 °C培养2天。使用菌落计数器计数菌落，并按照先前文献⁶所述方法计算叶片中的细菌生长量。
3. 对非寄主病原菌敏感的植物，其病原菌生长数量应高于载体对照组。

5. 插入片段的测序与目的基因的鉴定

1. 使用 attB1 和 attB2 引物，或使用 TRV2 载体中克隆位点两侧的引物，对所选克隆进行菌落 PCR。将 PCR 产物在凝胶上电泳，检测是否扩增出单一目的条带。
2. 可使用 attB 引物或克隆位点侧翼引物对 TRV2 载体中的植物基因插入片段进行测序。
3. 利用测序结果进行 BLAST 分析，确定基因的具体信息。
4. 获取包含非翻译区（UTRs）在内的全长基因序列。
5. 从序列的三个不同区域分别选取 300–400 bp 的片段，克隆至 TRV2 载体中。分别利用这三个 VIGS 构建体独立进行病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验，并验证在这三种基因沉默植株中非寄主抗性均受到破坏。

结果

本研究的主要目的是展示一种简便且准确的方法，用于鉴定基因沉默后丧失非寄主抗性的N. benthamiana植株。该方法包含四个主要步骤。第一步是利用TRV-VIGS技术分别对大量基因进行沉默。我们采用图1所示的方案，在约1.5年的时间内对约5,000个基因进行了沉默^6,18。部分基因沉默植株表现出多种表型变化，包括生长迟缓、黄化以及光漂白表型（图2）。

第二步是鉴定出基因沉默植株对非寄主病原菌表现出感病性的现象。我们使用了 GFPuv 表达细菌并追踪其生长 在植株内 (图3A-3C）。为了展示鉴定对非寄主病原菌敏感的基因沉默植株的过程，我们使用了三种非寄主病原菌， P. syringae pv. 番茄 T1 P. syringae pv. glycinea 和 X. campestris pv. ves...

讨论

植物免疫限制了非寄主病原菌的生长，因此在长波紫外光照射下，接种非寄主病原菌的载体对照植物叶片几乎不发出或完全不发出绿色荧光图3D）。然而，当参与非寄主抗性的基因被沉默后，基因沉默植株会促进非寄主病原菌的生长，并可观察到绿色荧光（图3E）。这是本文所述方法的基本原理。与基于HR的检测方法相比，该方法具有两个主要优势：其一，基于GFPuv的检测方法能够鉴定出对非寄主病原菌敏感的沉默植株，从而提高了准确性 在植株中 可以观察到生长情况。其次，该方法能够鉴定参与I型非寄主抗性的相关基因^2,26 （不导致可见的细胞死亡）以及II型非寄主抗性^2,26 （导致超敏反应性细胞死亡）。例如，我们先前鉴定出一个名为6C8的克隆，其基因沉默植株对Ⅰ型和Ⅱ型病原菌均表现出感病性。¹⁸.

此外，用于VIGS的两个或多个独立克隆可能恰好沉默了同一特定基因，从而导致基因沉默植株表现出相似的表型。这种冗余性具有重要意义，因为它可验证沉默表型的真实性。此类重...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔U型底板	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96针不锈钢复制器	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
高强度紫外检测灯，型号 B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	制造商编号 95-0127-01
Stuart SC6 菌落计数器	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
无土栽培混合物，Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
引物： attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	定制合成
MES，一水合物	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS 号 145224-94-8
乙酰丁香酮（二甲氧基-4’-羟基苯乙酮）	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff（Silwet L-77）	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30