右心室结构和功能的肺动脉缩窄经胸超声小鼠模型的评估

Summary

右心室（RV）的功能障碍是心血管疾病的发病机制中的关键的，但有限的方法可用于它的评估。在超声成像的最新进展提供了一种无创，准确的选择纵向房车研究。在此，我们用详细的RV压力超负荷小鼠模型一步一步的超声心动图的方法。

Abstract

新兴的临床数据支持这一概念，RV功能障碍是心血管疾病和心脏衰竭^1-3的发病机制是至关重要的。另外，RV被显著肺疾病如肺动脉高压（PAH）的影响。另外，RV是显着敏感的心肌病变，包括左心室（LV）功能不全，心脏瓣膜病或RV梗死^4。了解RV的心脏疾病的发病机制中的作用，可靠和非侵入性的方法，在结构上和功能上访问RV是必不可少的。

无创性经胸超声心动图（TTE）的方法建立和验证在成年小鼠监测RV结构和功能的动态变化。施加压力的RV，我们采用的肺动脉收缩（PAC）手术模型，并采用了高频率的超声显微成像测量超过7天期间的房车响应制度。假手术小鼠作为对照。图片是在浅麻醉小鼠获得的基线（手术前），第0天（马上手术后），3天，第7天（手术后）。数据是用软件离线分析。

几个声窗（B，M，及彩色多普勒模式），它可以在小鼠体内进行持续获得，允许RV结构（包括房车壁厚度，舒张末期和收缩末期尺寸）的可靠和可重复的测量，和功能（面积变化率，短轴缩短率，PA峰值速度和峰值压力梯度）在正常小鼠和下面的PAC。

使用这种方法时，压力梯度从PAC得到的是精确地测量在实时使用彩色多普勒模式和媲美用Millar的高保真微尖导管进行直接的压力测量。总而言之，这些数据表明，从各种并发症得到RV测量使用超声心动图imentary意见是可靠，重复性好，可以提供关于房车的结构和功能的见解。这种方法将有助于更好地了解房车心功能不全的作用。

Introduction

从历史上看，心脏衰竭预后评估的重点是LV的，这是通过超声心动图容易想像。使用超声心动图左室结构和功能众多的研究已经导致建立对左室结构正常价值和功能^1,5,6。从二维及彩色多普勒图像获得左室大小和收缩功能的测量是非常重要的，因为它们允许车厢和几何形状非常详细的视觉划分为LV ^7。 M-模式通常用于在小鼠中测定的LV尺寸和短轴缩短率（FS）。跨观察员和内部观察员变异较低，使用这种模式的直径测量，但壁厚测量往往是相当变量^7。脉冲多普勒彩色（PW或彩色多普勒）已经被用来评估瓣膜返流^8,9。

类似于LV，右室起着重要的作用，是一个显著predictor发病率和死亡率在患者患有心肺疾病^1,7,10的。然而，房车的超声心动图评价本质上是具有挑战性的，由于其形状复杂^5,11和胸骨位置，阻止了超声波^8,9。 RV是围绕着LV的一个月牙形状的结构包裹，并具有复杂的解剖结构壁薄是习惯于低的压力和阻力，以肺血管^6。以克服升高的血管阻力（PVR），右心室第一尺寸增大并发生肥大。在慢性疾病，如肺动脉高压或肺血管疾病，房车经过逐步扩张，最终导致心脏收缩和舒张功能^4,5,10的恶化。

超声心动图起着筛选和PAH的诊断具有重要的作用，尽管目前在临床诊断能力一定的局限性。的主要优点TTE在于它是无创性，并且它可以进行对轻度镇静，甚至是有意识的动物^9。 TTE还提供了PA的压力的合理估计，以及改变在房车的结构和功能^12,13的持续评估。由于TTE的技术进步，其中包括高频机械探针的发展，使得在5-12毫米，高帧率（大于300帧/秒），和高采样率的深度约50微米的轴向分辨率，超声心动图是一种选择工具，成像快速萎缩小型小鼠心脏^8,11。

纵向监测使用多个视图，包括二维（2D）和短长轴，M型和多普勒声学窗口右心室功能的提供房车解剖结构和功能的补充信息。总的来说，这种方法允许在生理和病理的设置RV血流动力学的完整的纵向评估 ^4,7。

在此，我们提供了使用无创TTE表征房车和解剖小鼠继发PAC功能变化的详细一步一步的方法。

Protocol

外科手术

1. 获得8个周龄雄性C57BL / 6小鼠，并适应了一个星期的任何实验程序执行之前。
2. 在此之前成像，肺动脉闭塞为依据AVMA指引先前描述¹⁴执行并通过IACUC协议。
   超声心动图图像采集与测量
   所用的所有缩写都总结在表1中 。

1。胸骨旁长轴（PLAX）M模式查看获取RV真空室尺寸，短轴缩短率（FS），以及露营壁厚

1. 采用B模式设置，以获得一个完整的胸骨旁左室长轴切面。与动物躺在平台上的仰卧位置（见注6.1和6.2），逆时针方向上的动物的位置的40 MHz的超声波探头（MS550D）与约30°角，与槽口指向尾端方向的左胸骨旁线（ 图1D）的y轴以获得在屏幕中央一个完整的低压腔心切面调整探头角度。
2. 一旦正确的地标（RV，低压，中压，鳌，LA）所示图2A和2B清晰可见，切换到M模式。指示线会显示在M模式设定在屏幕上。该生产线应定位鳌使用为标志（ 图2A和B）要经过房车室的最宽部分。
3. 这种观点认为，房车壁和室间隔应清晰可见。请确保焦点深度在于RV室的中心。记录与电影存储的数据进行测量房车室的尺寸，FS和RV壁厚下线。的M模式图像的例子示于图2C和2D。 （见注6.3）。

2。胸骨旁短轴切面在中间乳头水平，以获得面积变化率（FAC）

1. 从上面（ 图1A）中描述的位置，切换到B模式，把探头顺时针旋转90°得到胸骨旁短轴切面（ 图1B）。尖探针稍微沿着探针的x轴，以防止胸骨阻塞性视图。
2. 晃动上下沿探针的y轴，以获得中等水平乳头状（见注6.4）。
3. 在此视图中，乳头肌通常位于在2和5时的位置（ 图3）。

3。胸骨旁短轴切面在主动脉瓣电平（右PSAX主动脉级）获取RV壁厚和PA峰值速度

1. 从上面（ 图1B）中描述的位置，移动探针在y轴朝向颅骨直到主动脉瓣剖面图显示在该窗口的中间。
2. 右室流出吨RACT（RVOT）应该是可见的顶部为一个月牙形的结构与三尖瓣分离RA的房车作为如图4A和2 B。用电影商店RV壁厚离线测量记录数据。 （见注6.5）。
3. 保持在相同的位置。 （见注6.6）。
4. 切换到彩色多普勒模式和位置​​PW-虚线平行于流动的容器中的方向上的黄色的线。注意，蓝色和红色的颜色表示流远离和朝向所述探针，分别为（ 图4C和图4 D）。
5. 将光标PW在肺动脉瓣叶尖端。用电影存储（见注6.7。）记录数据。测量PA的峰值速度下线。

4。修改胸骨旁长轴房车和PA的视图获取PA的峰值速度

1. 继续基于B模式设置，定位探头（MS550D或MS250）到右胸骨旁线（ 图1C），并慢慢标题探针约30-45在探头（ 图1D）对小鼠的胸部，以清楚地看到在PA跨越主动脉所示，在图的y轴°角5A和5 B。
2. 切换到彩色多普勒模式和位置PW-虚线平行于流动的容器中（ 图5C和5 D）的方向上的黄色的线。将光标PW在肺动脉瓣叶尖端。用电影存储（见注6.6。）记录数据和测量PA的峰值速度下线。

5。数据计算与分析

1. RV壁厚可从（协议3）如上述从房车PSAX主动脉水平得到B模式的数据进行计算。选择2D区域跟踪工具来跟踪RV墙的面积舒张（如图中红色区域， 如图6）。然后，使用该距离跟踪工具跟踪RVOT的壁的内圆周和外圆周（如图所示在图6的蓝线）。采取的内外周的平均值。用公式 ，我们计算RV墙（RVW）的厚度。 （见注6.8）。
2. 对于其他标准的参数，请参考手册从各自的制造商能够进行数据分析。

6。笔记

1. 所有图像都使用VEVO 2100系统中收集。类似的图像，可以使用超声波成像系统其他制造商获得，以及各种超声仪器的相对利弊，先前已经比较^8,12,15。建议所有的图片应该以双盲的方式尽可能获得和分析。
2. 选择合适的麻醉，如短ð吸入异氟烷（2-3％诱导，和1.0％，以维持）的掩膜是至关重要的心脏跳动的维持在正常生理评分（大于500次/分钟），使我们能够检测可再现的和一致的基底和升高的肺动脉在这个研究中收缩压。
3. 确保收集在尽可能高的帧率可以将数据（> 200帧/秒）。
4. 寻找具有最大腔尺寸的视图。
5. 阻塞是由于肋骨和胸骨主要是由于房车的胸骨位置，是获得优良图像成像房车的这种方法的一个最大的障碍。通过重新定位的动物或探针，操作者可以克服胸骨块，将获得对RV的必要的视图。这可能需要从5-15分钟，这取决于动物的生理机能。
6. 您可能需要切换探头MS250因为MS550D探头可用于假和小鼠的PAC前和40 MHz的探头是能够记录峰值速度300-1500米/秒，而MS250是能够捕捉到园区速度可达4,000 mm /秒。
7. 可以接受的是具有一个探头角度小于20°，PA的峰值速度的精确测量。
8. RV墙厚度和面积/尺寸一致的测量是使用多个声窗制作，无论在长期和短轴。一些这些窗口的选择将取决于操作者的经验，并可以解释的变异可能是分担不同的统计结果。

Results

在这项研究中，基线超声心动图进行48小时前，手术。将小鼠随机分为两组。小鼠接受肺动脉闭塞（PAC）和假手术（Sham组）。在0天，第3和7以下的外科手术进行超声心动图。动物立即处死后，最后超声心动图和心脏标本进行组织学评估。导管是在亚组（n = 3时和2为0天和第7天，分别）PAC小鼠通过压力导管来测量RVSP的进行。

获得的所有图像数据进行分析脱机。重要的是，超声检查被蒙蔽的动物经历的过程。在本研究中提出的图像是由两个独立的成像器。间内和观察员变异进行了测试，并发现分别小于6％和11％。该测量是使用所有可用的声窗获得- 一起模式B，M模式和彩色多普勒图像，在房车的结构和功能评估。所有测量的平均值超过5个心动周期。每次测量，得到的平均值和标准偏差（SD）。常相似测量从不同的成像窗口执​​行取得的补充信息和多个数据点的准确性和可靠性的比较。

如图7A和7 B，右心室收缩功能，可在PLAX视图％FS或中旬乳头肌视图％FAC，分别测量。而在足总杯的减少已经在第0天...

Discussion

我们证明，TTE为RV的结构和功能在小鼠的常规评估一个敏感的和可再现的方法。 TTE的出现之前，房车的研究主要是通过正确的心脏导管插入术，终端和入侵的程序^6,9,11,17专注于右室收缩压测量。

此前报道已经描述了多种技术来执行正确的心脏测量^{3,4,11,17-19。}然而，大多数以往的研究报道房车大小，并在主要是定性而非定量的方式⁵的结构数据。房车评估的标准化因此还处于起步阶段，尽管在右心室功能中多环芳烃和疾病^9,19其他型号的情况下近期利益。

两者合计，这些数据提供的证据表明，成像无创方法可以对右心室功能不全早期评估一个可靠的和有价值的工具。我们establi流下的成像方法，以非侵入性可视化实时RV结构和功能改变使用多种互补成像窗户，基准的压力梯度反对导尿传统金本位右室收缩压测量我们的回声为主的方法。

当成像纵向，下面的急性损伤，如PAC，房车经历快速重构和动态变化可以重复地通过影像...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高频超声	FUJIFILM VisualSonics， Inc.	Vevo 2100
高频机械传感器	FUJIFILM VisualSonics， Inc.	MS250、MS550D、MS400
Millar Mikro 压力导管	Millar	SPR-1000