自动化、定量的小鼠认知/行为筛选：用于遗传学、药理学、动物认知研究及本科教学

摘要

一种完全自动化的系统，用于测量介导空间定位、时间定位、持续时间、速率 和概率估计、风险评估、冲动性以及记忆准确性和精确性的机制中具有生理意义的特性，以评估基因和药物干预对小鼠认知基础机制的影响。

摘要

我们描述了一种高通量、大容量、完全自动化的、可让小鼠长期居住的24/7行为测试系统，用于评估基因和药物干预对小鼠认知与学习基本机制的影响。该系统通过一个丙烯酸管将标准的聚丙烯小鼠饲养管与一个商用标准小鼠测试箱相连。测试箱内设有3个取食口，其中两个连接颗粒饲料喂食器。所有取食口内部均配有LED照明，并通过红外（IR）光束监测小鼠头部进入情况。小鼠长期生活在该环境中，从而在筛选过程中无需人为抓取。它们通过执行操作式（工具性）和巴甫洛夫式（经典）行为范式，在每日两次或更多次的喂食时段内获取食物。我们为此开发了实验范式控制软件，以及准实时数据处理与绘图软件。数据处理与绘图程序采用一种基于MATLAB的语言编写，可极大简化对大规模带时间戳的行为与生理事件记录的分析，并在一个统一的数据结构中完整保留从原始数据、中间分析到最终发表的图表与统计结果的全部数据轨迹。数据分析代码每天多次采集数据，并进行统计与图形化分析，结果自动存储于"云端"及实验室计算机中。因此，每只小鼠的实验进展均可实现每日可视化与量化。数据分析代码与范式控制代码相互通信，可实现对个体动物自动推进至下一实验范式。目前已实现的行为范式包括匹配任务、自动成形、定时取食口切换、定时取食口切换中的风险评估、冲动性测量，以及对食物供应时间的昼夜节律性预期。开源的范式控制与数据分析代码使得新增实验范式变得简便。一个48英寸×24英寸×78英寸 的机柜可容纳8个测试环境；两台此类机柜（共16个环境）可由一台计算机统一控制。

引言

为了将遗传学、分子遗传学、分子生物学和神经药理学的强有力技术应用于阐明介导认知基本机制的细胞与分子机制，我们需要高通量、高通量的心理物理学筛选方法，以量化具有生理学意义的认知机制特性。一种可心理物理学测量且具有生理学意义的机制定量特性，是指可通过行为学方法以及电生理学或生物化学方法进行测量的特性。例如视紫红质的吸收光谱、昼夜节律钟的自由运行周期，以及内侧前脑束中奖赏性轴突的不应期。^1,2心理物理学测量结果若能与细胞和分子水平的测量结果进行比较，则可通过定量对应关系，为将细胞与分子机制同心理机制相联系奠定基础。例如，以下事实表明 原位 视杆细胞外节中视紫红质的吸收光谱与人眼暗视觉光谱敏感性函数高度重合，是视紫红质光致异构化为暗视觉起始步骤的有力证据。复杂行为模式的定量特征在行为遗传学中运用数量性状位点（QTL）方法时同样具有核心意义。^3,4.

小鼠（和大鼠）在已建立的工具性学习和经典条件反射学习范式中的表现依赖于大脑机制，这些机制能够测量时间、数量、持续时间、频率、概率、风险和空间位置等抽象量。例如，经典条件反射反应的习得速度取决于强化事件之间平均间隔（通常为食物递送）与信号出现后到强化发生之间的平均潜伏期的比值^5-7。再如，在匹配范式中，动物对两个取食孔的平均访问持续时间之比，大致等于在这两个取食孔处获得强化的频率之比^8-10。

目前，神经科学家在研究潜在机制时广泛使用的行为测试方法大多通量低、效率低且耗费大量人力²⁶。此外，这些方法所测量的指标无法与电生理学和生物化学方法所测得的指标进行直接比较；例如，通过行为学方法测得的昼夜振荡器的周期和相位，应能与电生理学和生物化学方法测得的昼夜周期和相位相对应。现有的行为测试方法主要关注学习的类别，例如空间学习、时间学习或恐惧学习，而非其背后的机制。广泛应用的空间学习水迷宫测试^11-15正是这类局限性的典型例子。空间学习是一个类别，该类别中的学习依赖于多种机制，其中一种便是路径积分（dead reckoning）机制^16,17。而路径积分又依赖于里程计机制，即测量动物行走距离的机制¹⁸。类似地，时间学习也是一个类别。昼夜节律钟是该类别学习所依赖的机制之一，因为动物需要一个周期约为24 hr的振荡器，才能学会事件发生的具体时间^17,19。然而，介导食物预期行为的生物钟至今尚未被发现¹⁹。

时钟是一种测量时间的机制。具有广泛周期范围的内源性振荡器能够通过记录这些时钟的相位，使大脑定位事件发生的时间。定位时间位置的能力使得持续时间的测量成为可能，即时间上两个位置之间的距离。关联学习依赖于大脑对持续时间的测量^{16,175,6,20,21}。计数器是一种测量数量的机制。数量测量能够实现概率估计，因为概率是子集的数量与全集数量之间的比例。数量测量和持续时间测量共同支持速率估计，因为速率是某一时间段内发生的事件数量除以该时间段的持续时间。对持续时间、数量、速率和概率的测量使行为能够根据变化的风险进行调整^22,23。我们的方法聚焦于测量这些基础机制的准确性和精确性。准确性是指大脑测量值与客观测量值相符的程度。精确性是指大脑对某一固定客观值（例如，固定的持续时间）进行多次测量时的变异程度或不确定性。韦伯定律是心理物理学中最古老且最确凿的发现，它指出大脑对某一数量的测量精确性是该数量的一个固定比例。韦伯分数即统计学中分布的变异系数（σ/μ），用于衡量精确性。心理物理平均值（例如 主观判断的平均持续时间）与客观平均值（客观平均持续时间）之间的比值，用于衡量准确性。

本文所述方法在最大限度利用实验空间（即在特定实验空间内同时筛选的动物数量）和提高通量（获得的信息量除以单只动物平均筛选时间）的同时，尽量减少测量所需的人工劳动，并最大限度地加快筛选结果的获取速度。

本文介绍的数据分析软件架构能够自动将原始数据以及从中导出的所有汇总结果和统计信息整合到一个单一的数据结构中，并通过字段标题使其中包含的大量数字变得清晰可读。该分析软件仅对这一结构中的数据进行操作，并始终将其运算结果存储在同一结构的字段内。这确保了从原始数据到最终发表的摘要和图表之间具有完整可追溯的记录链条。

该软件会自动将控制实验的程序写入结构中，以管理完全自动化的测试，并自动标明哪些原始数据来自哪个程序。因此，它能够保留无可挑剔的数据轨迹，明确无误地显示在测试过程中每个时间点每只动物所处的实验条件，以及从原始数据推导出汇总统计结果的具体方法。这种数据保存方式极大地促进了标准化行为筛选数据库的建立，使其他实验室能够对这些丰富的数据集进行进一步分析。

该方法最大限度地降低了其所依赖的固件和软件失去支持的风险。测试装置由长期成熟的商用产品简单改装而成。编程语言采用硬件制造商提供的专用语言，用于协议控制；数据分析与绘图则使用一种专门开发的、非商业性的开源工具箱（TSsystem），该工具箱基于一种广泛支持的商用科学编程、数据分析与绘图语言编写。该工具箱包含高级命令，可用于从长时间的时间戳事件记录中提取结构化信息和汇总统计量。实现协议的程序与数据分析程序均为开源，并配有详尽的文档说明。

筛选系统的示意图见图1。在一个10英尺 × 15英尺 的实验室房间内，可设置10个机柜，每个机柜包含8个测试环境，从而可同时对80只小鼠进行实验。穿过隔墙端口的电缆应将各测试环境连接至另一房间内的电子/电气接口卡和计算机。计算机运行协议控制程序。每2个机柜（16个测试环境）需配备一台计算机。这些计算机必须通过局域网连接至运行数据分析与绘图软件的服务器。

方案

TSsystem 中的三种完全自动化方案（匹配、趋性操作性条件反射和经典条件反射）以及转换方案均已获得罗格斯大学新布朗斯维克分校动物护理与设施委员会的批准。

1. 搭建物理系统

1. 在机柜中设置测试环境（见图1）。
2. 在协议控制计算机上安装随测试环境提供的实验控制软件。
   注意：请勿将这些计算机用于其他任何用途！

2. 设置软件系统

1. 设置局域网（LAN），使安装了数据分析软件的服务器能够访问控制测试环境的计算机的硬盘（参见图1）。
2. 在"云端"建立一个用于数据存储的文件同步账户。
3. 将TSsystem文件夹及其子文件夹放置于云同步文件夹中，并将其添加到商业编程语言的搜索路径中。
   注意：TSsystem是一个软件工具箱，即包含30多个高级函数的函数库，可简化复杂的数据分析和数据绘图代码的编写，当从实验控制程序生成的输出文件中获取数据时，能够自动处理这些数据。所有命令均作用于“Experiment”结构体字段中的数据，并将结果存入同一结构体的其他字段中（参见图2）。这些开源命令使用一种最广泛使用的商业科学编程与绘图语言编写，该语言还包含许多其他"工具箱"，其中最有用的是统计工具箱。

3. 开始实验

1. 调用 TSbegin（参见 图3).
   注意： TSbegin 是一个交互式图形用户界面（GUI）G图表 U血清 I在TSsystem工具箱中，界面将引导用户创建分层数据结构，原始数据及由TSsystem工具箱中其他函数生成的所有结果将被存入该结构中。
2. 调用 TSaddprotocol（参见 图4).
   注意： TSaddprotocol 是 TSsystem 工具箱中的一个图形用户界面（GUI）。它引导用户完成实验方案控制参数的设定，设定用于自动判断终止当前方案并进入下一个方案的决策代码，以及指定所使用的决策标准。
3. 将小鼠放入24/7全天候测试环境，每个环境中放置一只小鼠。
   注意事项： 注意记录进入每个编号实验环境（Box 1、Box 2）的小鼠的编号 等等。）。同时，注意标识局域网（LAN）中实验-对照计算机的字母及其IP地址。
4. 调用 TSstartsession (图5).
   注意： TSstartsession 是 TSsystem 工具箱中的一个图形用户界面（GUI），用于引导用户启动实验会话。实验会话通常持续一至两周，在此期间会运行多个不同的行为测试方案。TSstartsession 存储了宏所需的信息，这些信息会被方案控制软件在启动会话时读取。所包含的内容有：方案控制软件所读取的代码文件的路径及其文件名。TSsystem 的分析软件会将该代码读入分层数据结构中，从而确保在任何时刻都能明确知晓正在执行的具体方案。
5. 前往控制计算机并调用写入 MedPC 文件夹的宏，以启动实验会话 由该控制器控制的盒子 计算机

4. 数据分析

1. 如果您创建了新方案，请使用 TSsystem 工具箱中的命令编写适当的数据分析与绘图代码，这将极大简化复杂数据分析的创建过程。
   注意： 用于分析和绘图的代码已包含在TSsystem工具箱中，对应于下文所述三个实验方案的结果。由于这些代码是开源的，因此可随意修改。这些分析代码包含大量注释，便于用户编写用于分析自定义实验方案结果的代码。
2. 实验期间（24 小时） 数周时间），通过电子邮件监控服务器发出的设备故障警报（如断电、控制计算机意外重启、颗粒饲料机故障等） 等等。），TSsystem 数据分析程序可检测到该信号。
3. 研究每次由分析计时器调用（通常每天 2-4 次）TSsystem 中编写的用于数据分析的代码所生成的性能图表。
   注意： 分析计时器会按照用户设定的时间间隔调用数据处理与绘图程序。该程序使用TSsystem中的函数编写，读取由协议控制软件写入文件的原始数据，并将其导入分层数据结构中。随后，程序对数据进行分析，并绘制分析结果的图表。包含分层数据结构的文件被存储在云端的文件同步文件夹中，从而实现自动的异地备份。自动文件同步功能会将该结构文件的副本保存在所有被授权访问的人员及合作者的计算机上。指定的图表会自动通过电子邮件发送给指定的人员与合作者。主要研究者可随时随地监控实验进展，并在必要时远程在线修改小鼠实验地点以外的实验方案。
4. 使用 TSbrowser 在数据及其分层数据结构中的汇总统计量以准实时方式呈现时对其进行研究（参见 图2).

结果

该系统可以且应当用于运行针对个体研究者或课堂教师目标量身定制的实验方案。然而，我们已开发出一套包含3种协议的组合，可用于基因操作小鼠的大规模筛选以及大规模药理学测试：匹配协议、双食槽自主条件化协议和转换协议。匹配协议用于测量小鼠在两个不同位置估计收入（单位时间内获得的食物颗粒数）的能力、记忆哪个位置对应何种收入的能力、将其平均访问时间的比例与收入比例相匹配的能力，以及检测收入比例变化并迅速作出调整的速度。双食槽自主条件化协议用于测量操作性条件反射和经典条件反射（即关联学习速率）的发生速率。转换协议用于测量时间间隔判断的准确性和精确性、估计概率（相对频率）的能力以及对概率变化作出适应的能力（风险评估），同时也可提供对冲动性的量化指标。

匹配。在每次递送食丸后，两个侧边料斗（采食料斗）中的进料器会以指数变化的延迟时间独立启动。当进料器启动后，小鼠通过探入料斗触发食丸释放，从而中断红外线（IR）光束，此时即递送一个食丸。下一次启动前的时间间隔从指数分布中随机抽取，其期望值由参数文件（表1）指定。在此方案中，小鼠很快开始在两个采食料斗之间...

讨论

本方法可在最短的时间内，以最少的人工操作，同时对多只小鼠在认知、学习和记忆等多个不同机制的功能方面，获得大量具有生理学意义的定量结果，且在数天、数周甚至数月的测试期间无需对实验对象进行人为干预。这些特点使其适用于基因和药物筛选项目。本方法仅需对现成设备（测试箱和巢穴管）进行最小程度的改造，相较于目前其他用于检测基因和/或药物干预小鼠认知能力的方法，可在更短时间内从更多小鼠获取更多关于基础认知功能的数据。

该系统依赖于两种开源软件，这些软件使用商业上可获得且得到良好支持的编程语言编写：1）由测试设备制造商提供的语言（参见材料部分），用于实验方案的实施和数据记录；2）一个开源工具箱TSsystem，用于在线、准实时的数据分析、绘图和决策。该工具箱采用一种应用最广泛且得到充分支持的专有科学数据分析与绘图语言编写（参见材料部分）。

TSsystem 工具箱可确保数据记录清晰且安全，因为控制实验方案的 实验控制代码、原始数据以及所有从原始数据导出的结果均保存在一个单一的数据结构中。该分层数据结构包含字段名，其功能类似于电子表格...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SmartCtrl 连接面板	Med Associates	SG-716B (115)	输入/输出控制面板
SmartCtrl 接口模块	Med Associates	DIG-716B (114)	每个实验舱的智能卡
通用电缆	Med Associates	SG-210CB (115)	从智能卡到控制面板的电缆
台式接口机柜	Med Associates	SG-6080C (109)	用于安放智能卡的机柜
机架式电源	Med Associates	SG-500 (112)	28 伏电源
宽型小鼠测试舱	Med Associates	ENV-307W (31)	测试舱
填充面板组件	Med Associates	ENV-307W-FP (32)	用于测试舱的不同尺寸面板
宽型小鼠模块化格栅地板	Med Associates	ENV-307W-GF (31)	测试舱地板格栅
头部进入探测器	Med Associates	ENV-303HDW (62)	头部进入/颗粒进入食槽的探测器
颗粒分配器	Med Associates	ENV-203-20 (73)	喂食器
颗粒接收器	Med Associates	ENV-303W (61)	食槽
颗粒接收器灯	Med Associates	ENV-303RL (62)	食槽灯
笼室灯	Med Associates	ENV-315W (43)	笼室灯
红外控制器	Med Associates	ENV-253B (77)	巢区与测试区之间管道的进入探测器
风扇	Med Associates	ENV-025F28 (42)	每个实验舱的排气风扇
聚丙烯巢箱			巢箱
丙烯酸连接管			连接巢区与测试区的管道
钢制机柜			用于安放测试舱的机柜（78"H, 48"W, 24"D）
Windows 计算机			运行 MedPC 实验控制软件
服务器			运行 Matlab，通过局域网与实验控制计算机连接
软件
MedPC 软件	Med Associates		专有的过程控制编程语言
Matlab 及统计工具箱	Matlab		专有的数据分析与绘图编程系统
TSsystem		见补充材料，由资深作者提供更新	开源 Matlab 工具箱
注：以上为一个机柜（包含 8 个测试环境）所需的设备。每个机柜需复制相应的硬件，但一台计算机可控制两个机柜（共 16 个测试环境）