通过阿米巴共培养与阿米巴富集方法发现新的细胞内病原体

摘要

阿米巴共培养是一种利用贴壁阿米巴细胞的选择性培养系统，用于培养能够抵抗阿米巴和巨噬细胞等吞噬细胞的胞内病原体。因此，该方法是发现新病原微生物的关键工具。通过阿米巴富集，可发现新的阿米巴物种及其特异性的胞内细菌。

摘要

军团菌、分枝杆菌和类衣原体等胞内病原体难以分离，因为它们通常在用于培养细菌的选择性培养基上生长不良或完全不生长。因此，许多此类病原体直到最近才被发现，或仅在重大疫情暴发后才被识别。这些病原体常与阿米巴原虫相关，后者作为宿主细胞，支持这些细菌的存活与增殖。本文旨在演示两种技术，可用于从临床或环境样本中分离和鉴定胞内病原体：阿米巴共培养法和阿米巴富集法。阿米巴共培养法通过将待检样本接种至阿米巴单层培养物上，使样本中存在的胞内细菌感染并裂解阿米巴，从而实现胞内细菌的回收。阿米巴富集法则用于从临床或环境样本中回收阿米巴。该方法不仅有助于发现新的阿米巴物种，还可能发现仅能在这些阿米巴中特异性生长的新型胞内细菌。这两种技术相结合，有助于发现能够在阿米巴中生长的新型胞内细菌。由于这些胞内细菌具有感染阿米巴并抵抗吞噬的能力，它们也可能逃避巨噬细胞的吞噬作用，从而对高等真核生物具有致病性。

引言

在分子诊断技术出现之前，环境生态位或临床样本中的微生物通常通过在不同选择性培养基上进行培养来检测，主要是在培养皿中的琼脂上进行。通过观察细菌菌落的表型及其代谢活性，可将细菌鉴定至物种水平。也可使用液体培养基以提高检测的灵敏度。然而，这两种技术均无法检测到在这些培养基上生长缓慢或完全不生长的细菌。这正是目前分子检测方法被广泛应用的原因。不过，DNA的检测结果无法提供有关细菌是否具有活性的信息。此外，与培养方法不同，分子检测方法无法获得可用于进一步表征的菌株。

研究在固体培养基上生长不良或需要宿主细胞才能生长的病原体十分复杂。大多数这类"难以培养"的细菌属于苛养的胞内寄生菌，通常是在大规模暴发疫情后才被发现和鉴定，Legionella pneumophila（嗜肺军团菌）便是如此。该细菌是在一次美国退伍军人大会期间暴发疫情后被鉴定出来的。当时共有182人感染，29人因严重肺炎而死亡^1,2。后续研究证实，阿米巴原虫是该细菌的天然宿主，其存在于酒店空调系统和供水网络中，是导致所谓军团菌病暴发的根源³。

阿米巴原虫在全球范围内存在，已从土壤、空气、水体以及人类志愿者的鼻黏膜中分离得到（详见综述） ⁴）。这些 "自由生活的" 阿米巴原虫在自然环境中通常自主分裂，但偶尔可侵入易感宿主⁵阿米巴通过吞噬....

方案

1. 阿米巴共培养

1.1 样品制备

1. 环境样品
   1. 水样
      将水样（500 ml 至 1 L）通过孔径为 0.22 μm 的滤膜过滤。然后将滤膜在 Page's 变形虫生理盐水培养基（PAS）中振荡（每 1 L 蒸馏水中含 120 mg NaCl、4 mg MgSO₄•7H₂O、4 mg CaCl₂•2H₂O、142 mg Na₂HPO₄ 和 136 mg KH₂PO₄）。
   2. 固体样品
      将土壤或沙子等固体样品以及活性污泥等半固体样品用蒸馏水或 PBS 重悬，然后通过孔径为 0.22 μm 的滤膜过滤。随后将滤膜在 PAS 中振荡。
   3. 内源性变形虫和原生动物高度污染的样品
      首先以低速离心（180 × g）10 分钟对样品进行沉降，或通过孔径为 5 μm 的滤膜过滤。对上清液（或滤过液）按步骤 1.1.1 进一步处理。
      注意：可采用其他去污染技术进一步净化环境样品：将样品在 50 °C 加热 30 分钟，或用酸性或碱性溶液处理^....

结果

利用阿米巴共培养和阿米巴富集方法，发现了一系列环境来源和/或致病性细菌（表1）。

本研究团队及其他研究者曾采用阿米巴共培养法分析环境样本、水处理厂及配水系统。该技术可分离出多种微生物。通过阿米巴共培养法最常分离到的细菌为分枝杆菌属（Mycobacterium）成员，这些细菌可从水处理厂及供水管网中回收获得^{13,14,24,27,28}。军团菌属（Legionella）及α-变形菌纲（α-proteobacteria）物种也可从水处理厂及医院供水系统中分离得到^14,24,28-31。此外，已从河水及水处理设施中分离出多种与衣原体相关（Chlamydia-related）的物种，例如洛桑星菌（Estrella lausannensis）（图2B-C）^12,15,32,33。

利用阿米巴共培养技术，已发现多种巨大病毒，例如拟菌病毒（.......

讨论

阿米巴共培养和阿米巴富集是有效的方法，已成功分离出多种新的细菌和阿米巴物种。这些方法获得的结果证实了阿米巴以及抗阿米巴细菌在环境中普遍存在，尤其值得注意的是，在被认为通过氯化和臭氧处理等化学手段控制的人工水系统中也广泛存在。阿米巴共培养和阿米巴富集是分离和培养这些潜在致病微生物的关键工具，可获得纯培养菌株，进而深入研究其生物学特性与致病性。最近，该方法已被改进用于高通量分离巨型病毒⁴¹。类似地，阿米巴共培养有望实现自动化，并作为常规技术用于检测环境样本及人工水系统的微生物质量，例如饮用水系统。

可以使用不同种类的阿米巴进行阿米巴共培养。我们通常更倾向于使用Acanthamoeba castellanii或A. polyphaga，因为它们比哈氏虫（Hartmannella vermiformis）更不易形成包囊，且具有相对较广的宿主谱。也可使用其他种类，但需对实验方案和培养基进行相应调整。最近有研究表明，A. lenticulana（ATCC 30841）可在与A. castell.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖一水合物	Merck, Darmstadt, Germany	108342
0.22 μm 孔径膜	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	SCVPU11RE
蛋白胨	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	211693
酵母提取物	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	212750
细胞培养瓶	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	353135
Kova 载玻片	Hycor, Indianapolis, IN	87144
细胞培养微孔板	Corning Inc, Corning, NY	3524
Diff-Quik 染色试剂盒	Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany	130832
齐氏品红	Fluka, St-Louis, MI	21820
碱性品红	Sigma, St-Louis, MI	857843
苯酚	Sigma, St-Louis, MI	P1037	腐蚀性和致突变性
孔雀石绿草酸盐	Fluka, St-Louis, MI	63160
16% 甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15710
皂苷	Sigma, St-Louis, MI	84510