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方法文章

通过阿米巴共培养与阿米巴富集方法发现新的细胞内病原体

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DOI：

10.3791/51055

⸱

2013年10月27日

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

本文内容

摘要

阿米巴共培养是一种利用贴壁阿米巴细胞的选择性培养系统，用于培养能够抵抗阿米巴和巨噬细胞等吞噬细胞的胞内病原体。因此，该方法是发现新病原微生物的关键工具。通过阿米巴富集，可发现新的阿米巴物种及其特异性的胞内细菌。

摘要

军团菌、分枝杆菌和类衣原体等胞内病原体难以分离，因为它们通常在用于培养细菌的选择性培养基上生长不良或完全不生长。因此，许多此类病原体直到最近才被发现，或仅在重大疫情暴发后才被识别。这些病原体常与阿米巴原虫相关，后者作为宿主细胞，支持这些细菌的存活与增殖。本文旨在演示两种技术，可用于从临床或环境样本中分离和鉴定胞内病原体：阿米巴共培养法和阿米巴富集法。阿米巴共培养法通过将待检样本接种至阿米巴单层培养物上，使样本中存在的胞内细菌感染并裂解阿米巴，从而实现胞内细菌的回收。阿米巴富集法则用于从临床或环境样本中回收阿米巴。该方法不仅有助于发现新的阿米巴物种，还可能发现仅能在这些阿米巴中特异性生长的新型胞内细菌。这两种技术相结合，有助于发现能够在阿米巴中生长的新型胞内细菌。由于这些胞内细菌具有感染阿米巴并抵抗吞噬的能力，它们也可能逃避巨噬细胞的吞噬作用，从而对高等真核生物具有致病性。

引言

在分子诊断技术出现之前，环境生态位或临床样本中的微生物通常通过在不同选择性培养基上进行培养来检测，主要是在培养皿中的琼脂上进行。通过观察细菌菌落的表型及其代谢活性，可将细菌鉴定至物种水平。也可使用液体培养基以提高检测的灵敏度。然而，这两种技术均无法检测到在这些培养基上生长缓慢或完全不生长的细菌。这正是目前分子检测方法被广泛应用的原因。不过，DNA的检测结果无法提供有关细菌是否具有活性的信息。此外，与培养方法不同，分子检测方法无法获得可用于进一步表征的菌株。

研究在固体培养基上生长不良或需要宿主细胞才能生长的病原体十分复杂。大多数这类"难以培养"的细菌属于苛养的胞内寄生菌，通常是在大规模暴发疫情后才被发现和鉴定，Legionella pneumophila（嗜肺军团菌）便是如此。该细菌是在一次美国退伍军人大会期间暴发疫情后被鉴定出来的。当时共有182人感染，29人因严重肺炎而死亡1,2。后续研究证实，阿米巴原虫是该细菌的天然宿主，其存在于酒店空调系统和供水网络中，是导致所谓军团菌病暴发的根源3。

阿米巴原虫在全球范围内存在，已从土壤、空气、水体以及人类志愿者的鼻黏膜中分离得到（详见综述） 4）。这些 "自由生活的" 阿米巴原虫在自然环境中通常自主分裂，但偶尔可侵入易感宿主5阿米巴通过吞噬作用摄取多种微生物，并利用水解酶进行溶酶体消化。6许多兼性或专性胞内细菌能够抵抗消化，从而感染并在阿米巴中分裂，例如 军团菌, 沙眼衣原体-相关细菌或分枝杆菌（综述见于 7 和 8）。自由生活的阿米巴原虫可能是尚未被发现的胞内细菌的重要潜在储存宿主。这促使我们在洛桑建立了两种主要技术，即阿米巴共培养法和阿米巴富集法，使多个研究团队能够从多种环境样本中分离出多种新的专性胞内微生物。9-15.

由于变形虫是能够吞噬细菌的专业吞噬细胞，因此一种能够抵抗吞噬并在这些原生生物体内生长的细菌，也可能在人类吞噬细胞中定植并对人类具有致病性。这一点已在部分衣原体相关细菌中得到初步证实，例如Waddlia chondrophila。W. chondrophila不仅能在变形虫中生长，还能在多种细胞类型中生长，包括哺乳动物上皮细胞、巨噬细胞以及鱼类细胞系16-18。此外，利用变形虫共培养的方法在临床样本中检测胞内细菌也显示出重要意义19,20，包括含有大量不同细菌物种污染的粪便样本21。

本文介绍了阿米巴共培养和阿米巴富集的主要步骤，包括（a）环境或临床样本的处理；（b）在无菌培养基及大肠杆菌（Escherichia coli）菌苔上培养阿米巴；以及（c）胞内细菌的筛选与鉴定。

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方案

1. 阿米巴共培养

1.1 样品制备

  1. 环境样品
    1. 水样
      将水样（500 ml 至 1 L）通过孔径为 0.22 μm 的滤膜过滤。然后将滤膜在 Page's 变形虫生理盐水培养基（PAS）中振荡（每 1 L 蒸馏水中含 120 mg NaCl、4 mg MgSO4•7H2O、4 mg CaCl2•2H2O、142 mg Na2HPO4 和 136 mg KH2PO4）。
    2. 固体样品
      将土壤或沙子等固体样品以及活性污泥等半固体样品用蒸馏水或 PBS 重悬，然后通过孔径为 0.22 μm 的滤膜过滤。随后将滤膜在 PAS 中振荡。
    3. 内源性变形虫和原生动物高度污染的样品
      首先以低速离心（180 × g）10 分钟对样品进行沉降，或通过孔径为 5 μm 的滤膜过滤。对上清液（或滤过液）按步骤 1.1.1 进一步处理。
      注意：可采用其他去污染技术进一步净化环境样品：将样品在 50 °C 加热 30 分钟，或用酸性或碱性溶液处理14。
  2. 临床样品
    根据临床样品的理化性质进行处理。对液体样品进行过滤或离心以去除大颗粒杂质。将固体样品重悬。若使用组织样品，可通过 Dounce 匀浆器或玻璃珠等方法将其研磨，并裂解细胞以释放胞内细菌。

1.2 变形虫的制备

  1. 培养基制备
    制备以下培养基：含有蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的丰富培养基（PYG；在5 L蒸馏水中加入100 g蛋白胨、10 g酵母提取物、4.9 g MgSO4•7H2O、5 g柠檬酸钠•2H2O、0.1 g Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O、1.7 g KH2PO4、1.97 g Na2HPO4•7H2O、45 g葡萄糖和0.295 g CaCl2）以及用于棘阿米巴属（Acanthamoeba）的非营养性培养基如PAS。
  2. 阿米巴培养
    1. 在含有30 ml PYG培养基的细胞培养瓶中，于25 °C下培养阿米巴（优先选用Acanthamoeba castellanii ATCC 30010或A. polyphaga Linc-Ap1）。
    2. 通过剧烈振荡培养瓶收获阿米巴，将细胞悬液在1,500 × g条件下离心10分钟。用PAS培养基洗涤沉淀物两次。使用Kova计数板对细胞进行计数，并调整体积以获得每毫升含5 × 105个细胞的悬液。
    3. 将阿米巴悬液转移至微孔板中。12孔和24孔板每孔加1 ml，48孔板每孔加500 μl，96孔板每孔加300 μl。于25 °C孵育至少2小时，使阿米巴沉降并贴附于各孔底部。

1.3 共培养

  1. 样品接种
    1. 从步骤2.3.3的平板中，用步骤1.1或1.2样品的系列稀释液进行接种，通常采用10倍梯度稀释，起始为100 μl未稀释样品。
    2. 将微孔板在1,800 × g下离心10分钟，使样品中可能存在的微生物沉淀到阿米巴菌苔上。这有助于增加阿米巴对微生物的接触和吞噬作用。
    3. 将培养板在25 °C孵育45分钟，用PAS更换新鲜培养基，洗涤三次。每孔加入1 ml PAS，根据目标细菌种类决定是否添加抗生素（链霉素、青霉素、庆大霉素和/或万古霉素）。
    4. 将微孔板置于32 °C、加湿的环境中孵育，以避免阿米巴原虫包囊化。每天使用20倍物镜观察每个孔，检测是否有细菌侵入并裂解阿米巴原虫。
    5. 若发生裂解，取100 μl共培养物接种于约10个单层新鲜阿米巴中，进行传代培养。5 变形虫/cm2. 为特异性分离特定细菌种类，还需接种针对这些细菌设计的特异性琼脂培养基（即 BCYE 琼脂用于 军团菌 种（spp.）
    6. 若未出现裂解现象，于首次接种后四至七天取100 μl共培养物，接种至24孔板中含900 μl新鲜阿米巴培养物的孔内。若观察到阿米巴迅速裂解而无细菌增殖，则可能存在病毒。此时，将上清液以0.22 μm滤膜过滤，并用过滤后的悬液感染新鲜阿米巴。

1.4 细菌分离与鉴定

  1. 细菌染色
    在24孔细胞培养板中的玻璃盖玻片上直接进行共培养。移除培养基后进行染色或免疫荧光操作。
    1. 改良Romanowsky染色法
      1. 让盖玻片自然干燥。将盖玻片浸入固定液（甲醇中含2 mg/L快绿）中5次。
      2. 将盖玻片浸入染色液I（磷酸盐缓冲液pH 6.6中含1.22 g/L伊红G）中5次。
      3. 最后将盖玻片浸入染色液II（磷酸盐缓冲液pH 6.6中含1.1 g/L噻嗪）中5次。
      4. 用蒸馏水冲洗样本，晾干后在显微镜下观察。
    2. 齐-尼染色法
      1. 让盖玻片自然干燥。用齐氏品红覆盖样本，用火焰加热至出现蒸气。
      2. 室温冷却至少5分钟，用蒸馏水冲洗。用含3%盐酸的异丙醇溶液处理样本2分钟，再用蒸馏水冲洗。
      3. 用亚甲蓝覆盖样本30秒，再用蒸馏水冲洗。晾干后在显微镜下观察22。
    3. 吉姆萨染色法
      1. 通过混合以下成分配制碱性品红储备液：100 ml 10%碱性品红（10 g碱性品红溶于100 ml 95%乙醇）、250 ml 4%水溶液苯酚和650 ml蒸馏水。使用前在37 °C孵育48小时。
      2. 让盖玻片干燥，通过火焰固定。用新鲜过滤的碱性品红染色液（4 ml碱性品红储备液加入10 ml 0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.45）覆盖样本2分钟。
      3. 用水冲洗样本，再在孔雀绿（0.8%蒸馏水溶液）中孵育10秒。再次用水冲洗，并重复一次孔雀绿染色。再次用水冲洗。让盖玻片干燥，封片后在显微镜下观察23。
    4. 免疫荧光染色
      1. 将盖玻片在甲醇中孵育5分钟，或用4%多聚甲醛固定10分钟。
      2. 用PBS洗涤三次，在封闭液（PBS中含5% BSA和0.1%皂苷）中室温孵育2小时。
      3. 在含有针对目标微生物的一抗的封闭液中孵育盖玻片1小时。
      4. 再次用PBS洗涤三次，在含有与一抗对应的荧光标记二抗的溶液中孵育1小时。再用PBS洗涤三次，封片后在荧光显微镜下观察。
  2. 通过PCR检测DNA
    从100至200 μl的阿米巴共培养物中提取DNA。使用针对16S rRNA基因的通用引物或针对特定微生物（如分枝杆菌24、军团菌25或Chlamydiales目成员26）的特异性引物检测微生物。

2. 阿米巴富集

2.1. 样品制备

通过涡旋振荡将固体和半固体样品在PAS中重悬。将悬液在低速（180 × g）下离心10分钟，以富集沉淀中的自由生活阿米巴。上清液可用于阿米巴共培养，沉淀物则用于阿米巴富集21。

2.2. 培养基制备

  1. 向100 ml PAS中加入1.5 g琼脂，于121 °C下高压灭菌15分钟。将温热的培养基倒入培养皿中，在室温下静置凝固。
  2. 在LB或硫乙醇酸盐肉汤培养基中于37 °C过夜培养大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）。用PBS洗涤细菌两次，重悬于PAS培养基中。用PAS培养基稀释10倍后，取2–3 ml该稀释液涂布于PAS琼脂平板上，静置晾干。

2.3. 样品接种

在培养皿的一侧加入一滴样品（或一小片滤膜），使其流过培养皿，在皿中央形成一条线。

2.4. 阿米巴生长与阿米巴传代培养

  1. 每天观察一次培养皿。若观察到阿米巴迁移前沿，则在迁移前沿处切下一小块琼脂，接种至涂布有大肠杆菌（E. coli）菌苔的新鲜非营养琼脂（NNA）培养皿中。
  2. 根据样本的纯度重复多次再接种，以获得特定阿米巴菌株的纯培养物。

2.5. 变形虫和细菌的表征

  1. 刮取细胞并将其重悬于 PAS 中。
  2. 提取 DNA，并通过 PCR 扩增和测序（例如，细菌采用 16S rRNA 扩增，阿米巴采用 18S rRNA 扩增）确定阿米巴和/或细菌内共生体的种类。
  3. 将上述刮取后悬浮于 PAS 中的细胞用于接种新鲜的阿米巴，进行阿米巴共培养，以检测样本中可能存在的细菌。

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结果

利用阿米巴共培养和阿米巴富集方法，发现了一系列环境来源和/或致病性细菌（表1）。

本研究团队及其他研究者曾采用阿米巴共培养法分析环境样本、水处理厂及配水系统。该技术可分离出多种微生物。通过阿米巴共培养法最常分离到的细菌为分枝杆菌属（Mycobacterium）成员，这些细菌可从水处理厂及供水管网中回收获得13,14,24,27,28。军团菌属（Legionella）及α-变形菌纲（α-proteobacteria）物种也可从水处理厂及医院供水系统中分离得到14,24,28-31。此外，已从河水及水处理设施中分离出多种与衣原体相关（Chlamydia-related）的物种，例如洛桑星菌（Estrella lausannensis）（图2B-C）12,15,32,33。

利用阿米巴共培养技术，已发现多种巨大病毒，例如拟菌病毒（...

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讨论

阿米巴共培养和阿米巴富集是有效的方法，已成功分离出多种新的细菌和阿米巴物种。这些方法获得的结果证实了阿米巴以及抗阿米巴细菌在环境中普遍存在，尤其值得注意的是，在被认为通过氯化和臭氧处理等化学手段控制的人工水系统中也广泛存在。阿米巴共培养和阿米巴富集是分离和培养这些潜在致病微生物的关键工具，可获得纯培养菌株，进而深入研究其生物学特性与致病性。最近，该方法已被改进用于高通量分离巨型病毒41。类似地，阿米巴共培养有望实现自动化，并作为常规技术用于检测环境样本及人工水系统的微生物质量，例如饮用水系统。

可以使用不同种类的阿米巴进行阿米巴共培养。我们通常更倾向于使用Acanthamoeba castellanii或A. polyphaga，因为它们比哈氏虫（Hartmannella vermiformis）更不易形成包囊，且具有相对较广的宿主谱。也可使用其他种类，但需对实验方案和培养基进行相应调整。最近有研究表明，A. lenticulana（ATCC 30841）可在与A. castell...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Bernard La Scola 教授在阿米巴共培养和阿米巴富集方面提供的有益技术建议和富有启发性的讨论。我们还感谢 Vincent Thomas 博士在本实验室建立该技术过程中给予的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
葡萄糖一水合物Merck, Darmstadt, Germany108342
0.22 μm 孔径膜Merck Millipore, Darmstadt, GermanySCVPU11RE
蛋白胨Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ211693
酵母提取物Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ212750
细胞培养瓶Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ353135
Kova 载玻片Hycor, Indianapolis, IN87144
细胞培养微孔板Corning Inc, Corning, NY3524
Diff-Quik 染色试剂盒Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany130832
齐氏品红Fluka, St-Louis, MI21820
碱性品红Sigma, St-Louis, MI857843
苯酚Sigma, St-Louis, MIP1037腐蚀性和致突变性
孔雀石绿草酸盐Fluka, St-Louis, MI63160
16% 甲醛溶液Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA15710
皂苷Sigma, St-Louis, MI84510

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