一种用于研究昆虫行为可塑性的喙伸展反应实验方案：在基础、生物医学及农业研究中的应用

摘要

为蜜蜂（Apis mellifera）开发的 proboscis extension response（PER）条件化训练方案，为研究多种昆虫中不同的学习机制提供了一种生态相关性强且易于量化的手段。

摘要

昆虫通过将刺激与生存相关的重要事件进行关联的经验，来调整其对刺激的反应。例如食物、配偶、威胁）。昆虫通过多种行为机制学习显著的关联，并将其与这些事件联系起来。了解这种行为可塑性，对于旨在协助农业有益昆虫的项目至关重要。这种理解也可用于寻找解决由作为疾病传播媒介和害虫的昆虫所引发的生物医学和农业问题的方案。Proboscis Extension Response（PER）条件化训练方案最初是为蜜蜂（Apis mellifera）开发的Apis mellifera50 多年前，该方法被用于研究蜜蜂如何感知和学习花香气味，这些气味向蜂群传递了其生存所需的花蜜和花粉资源信息。PER 实验程序为研究多种生态学上重要的行为可塑性机制提供了一个稳健且易于实施的框架。该方法可轻松改造，适用于多种其他昆虫物种及其他行为反射。这些实验方案可与多种监测中枢神经系统（CNS）神经活动的技术（如电生理学或生物成像）结合使用，也可用于操控特定的神经调节通路。该方法是一种灵敏的检测手段，可快速识别环境胁迫因子、毒素或杀虫剂对行为造成的亚致死效应。

我们展示了如何通过两种方法简便地实施PER（Proboscis Extension Response，喙伸展反应）实验方案。其中一种方法适用于学生实验课或快速检测实验处理的效果；另一种方法则能更严格地控制变量，这对于行为条件化研究尤为重要。我们说明了如何使用多种行为反应指标——从二元的是/否判断，到喙伸展的潜伏期和持续时间等连续变量——来检验科学假设。此外，我们还讨论了研究人员在初次使用该实验流程时常见的若干误区。

引言

许多昆虫会学习与生态相关的刺激，并由此改变对这些刺激的行为反应，以适应环境中新的预测性关系。多种不同的机制可能构成这种行为可塑性的基础。例如，非联合型，联合型/巴甫洛夫式，操作式/工具式¹）。这些可塑性类型在刺激或行为与重要事件（如食物、配偶或危险的出现）的关联方式上有所不同。理解这些可塑性形式对于基础研究至关重要，有助于揭示神经系统如何发生改变以编码新的记忆²。了解作为重要疾病传播媒介的昆虫的适应性行为也具有重要意义（例如，采采蝇和蚊子）以及在农业上具有重要意义的昆虫，包括在作物生产中起作用的（如蜜蜂）或作为害虫的昆虫。

研究任何动物的行为可塑性都需要在实验中对多个变量进行一定程度的控制，而这种控制在野外条件下是无法实现的¹。这就需要建立一种可靠的条件化实验方案，该方案可在更受控的环境中实施，同时仍与自然条件下的行为相关。蜜蜂（Apis mellifera）是建立用于分析行为可塑性的受控实验方法的理想模型^3,4。蜜蜂的吻部伸展反应（Proboscis Extension Response, PER）是一种自然的行为反射，当蜜蜂的触角受到糖溶液刺激时，会本能地伸出其吻部。在正常的觅食行为中，当蜜蜂在花朵中发现花蜜时就会发生PER。幸运的是，蜜蜂在实验室环境中也容易表现出这一简单且易于量化的反应。这使得研究人员能够在受控条件下，研究影响这一生态相关行为的内在机制⁵。此外，PER还可结合条件化训练方案，用于在不同处理条件下探究刺激感知以及学习与记忆过程，从而揭示行为可塑性背后的神经与行为机制⁶。

自从Kuwabara的早期研究以来⁷，PER（伸吻反应）条件化已被广泛用于揭示蜜蜂行为可塑性背后的非关联性、关联性和操作性机制⁸。这些机制与自由飞行蜜蜂研究中揭示的机制相同⁹。与自由飞行蜜蜂的研究不同，PER条件化实验可与脑部的电生理记录^10,11或活细胞荧光成像技术^12-14相结合。此外，PER实验方案还允许通过药理学或分子遗传学手段对神经通路进行实验性操控，以检验特定神经网络组分（如神经调质）功能的假设^15,16。PER实验方案还为评估环境因素以及毒素对蜜蜂健康和觅食效率的亚致死效应提供了重要途径¹⁷。

本实验流程并列介绍了两种气味递送方法。方法1是一种气味与非条件刺激（蔗糖）递送方式，可提供一种成本低廉且技术简单的气味与蔗糖奖励呈现手段。该方法适用于基础训练，以及无法实现自动化操作的情况，是将该技术引入课堂或教学实验室的优良方式。在涉及更复杂任务以及需联合进行气味感知、学习或记忆相关生理学评估的实验中，准确且精确地调控刺激的起始时间、持续时间及递送时序至关重要。为实现最可靠的刺激递送，应采用自动化气味递送手段以及精确的奖励递送方法。方法2采用自动化气味递送和更精确的蔗糖递送方式，技术上更为复杂，初始设置所需资源也多于方法1，但能显著提高训练过程中刺激时序与剂量的一致性，应尽可能优先使用。

方案

1. 气味（条件刺激） cartridge 的准备

1. 实验开始前，为所有条件化训练所需的不同气味准备多个气味 cartridges。
   1. 在通风橱内进行气味稀释和气味 cartridge 的制备。切勿在通风橱外打开气味瓶，因为气味会迅速扩散至整个实验室，可能导致蜜蜂在训练前意外接触气味。此外，在准备气味 cartridge 时应佩戴手套，操作完成后彻底清洗，以避免在操作过程中将气味暴露给蜜蜂。
   2. 确保每个气味 cartridge 都使用颜色编码标签明确标注其首次使用的气味。每个气味 cartridge（注射器筒身或推杆）只能用于一种气味，因为 cartridge 上可能残留有先前气味的痕迹。
2. 气味与气味混合物的准备
   1. 将气味用正己烷或矿物油稀释至所需浓度。
      注：改变气味浓度或呈现两种及以上气味的混合物，可进一步研究蜜蜂感知气味及建立条件化关联的其他方面。气味混合物可以是简单的50:50二元混合物，也可以是模拟自然嗅觉刺激的多种气味复杂组合。降低气味浓度也会增加任务难度。
      1. 随着 cartridge 的重复使用，气味会逐渐耗尽（图2）。为避免因耗尽造成的问题，应准备足够数量的 cartridge，以便每使用10–12次后更换新的 cartridge。
3. 气味 cartridge 的制备
   1. 方法1
      1. 本方法使用20 ml塑料注射器，将直径为15 mm的圆形滤纸片固定在推杆的橡胶端，作为气味 cartridge。
      2. 将推杆从注射器中取出，用图钉将滤纸片固定在推杆末端。
      3. 使用微量移液器将10 μl气味溶液滴加到滤纸上，然后将推杆重新插入注射器筒身，并将推杆推至注射器筒身上的15 ml刻度处。
   2. 方法2
      1. 本方法使用1 cc玻璃或塑料结核注射器（或类似体积和形状的改装移液器），在注射器筒身内放置一条滤纸条，并在筒身宽口端放置橡胶或硅胶限流器，构成气味 cartridge。
      2. 将1 cc结核注射器的推杆从筒身中取出，该筒身将作为气味 cartridge 的主体。
      3. 取下推杆上的黑色橡胶头，并剪去其封闭端。
         注：该橡胶环可作为限流器，减少实验装置中气流产生的吸力，防止过早将气味从 cartridge 中抽出并吹向被固定住的蜜蜂。也可使用外径4.8 mm的硅胶管，切成5 mm长的小段作为限流器。
   3. 用70%乙醇冲洗注射器筒身内部及橡胶/硅胶限流器（以去除前次使用残留的大部分气味），然后让其自然晾干。
   4. 将一条尺寸为0.2 × 4 cm的滤纸条插入筒身宽口端，使滤纸伸出开口外1–2 cm。
   5. 使用微量移液器将3–10 μl气味溶液滴加到滤纸上，注意不要让气味接触到注射器筒身的末端。同一气味可重复使用同一移液器吸头，但在准备下一个不同气味时必须更换新的吸头。
   6. 将注射器筒身的宽口端朝上，使滤纸迅速滑入管内。随后将限流器插入筒身的宽口端。
      1. 确保每个气味 cartridge 都使用颜色编码标签明确标注其首次使用的气味。每个气味 cartridge（注射器筒身或限流器）只能用于一种气味，因其上可能残留有先前气味。
   7. 将一块无尘纸揉成团，用70%乙醇浸湿，彻底擦拭 cartridge 外表面，以清除 cartridge 外部可能残留的气味。

2. 蜜蜂的采集、固定与饲喂

1. 制备蜜蜂束缚装置
   1. 使用塑料吸管、硬质塑料管或机械加工的金属管（内径均约为 0.9 cm，壁厚 1–2 mm）制作简单的蜜蜂束缚装置。进行手术操作时应使用更坚固的装置。
   2. 将管材切割成 3 cm 长的段。然后，将装置上端约 1 cm 处的一半部分部分切除，以便在固定蜜蜂时更容易将其保持在原位。
   3. 剪取一条 0.2 × 6 cm 的封口胶带，将一端固定在蜜蜂束缚装置的一侧，另一端保持自由。
2. 采集工蜂
   1. 在工蜂离开蜂群前短暂停留或采食归巢时，于蜂巢入口处采集。
      注：在蜂巢入口处覆盖一块网眼大小刚好允许工蜂通过的金属网，可减缓归巢工蜂的速度，便于在它们进入蜂巢前捕获。
   2. 将闪烁小瓶罩住蜜蜂，直至其飞入瓶内。拧紧瓶盖时，应保持瓶口水平或朝下，防止蜜蜂飞出。每个小瓶中仅放置一只蜜蜂。确保瓶盖上有孔，以保证充足的气体交换。
   3. 快速采集蜜蜂，以尽量减少其在小瓶中的停留时间。将装有蜜蜂的小瓶置于阴凉处的小盒中。
   4. 将装有小瓶和蜜蜂的盒子转移至实验室，并将小瓶放入冰水混合物中，直至蜜蜂停止活动。一旦蜜蜂失去活动能力，立即从冰水中取出小瓶，避免过度暴露于低温，并将蜜蜂放入束缚装置中。
      注：不建议将蜜蜂放入冰箱或冷冻柜，因为难以监控蜜蜂何时失去活动能力，容易导致过度低温暴露。当束缚超过 10 只蜜蜂时，应每次仅转移少量蜜蜂至冰水混合物中。
3. 束缚蜜蜂
   1. 将蜜蜂放入束缚装置中，使其胸部背侧朝向管材被切开的部分，头部略高于管材顶端。轻轻将蜜蜂压向管材，使其口器伸出管材边缘。将封口胶带从蜜蜂头部与胸部之间的背侧插入，并将自由端牢固地粘贴在装置侧面。
      1. 确保装置上的胶带平整且绷紧。蜜蜂束缚装置前端与胶带之间不应有明显间隙，胶带应平整贴合在装置顶部。若有间隙，蜜蜂可能无法正常伸出喙或可能逃脱。同时，确保蜜蜂的前足未从装置前端与封口胶带之间伸出。
4. 喂食蜜蜂及喂食至训练间隔时间
   1. 束缚后约 30 分钟——待蜜蜂从初始操作中恢复后——给予每只蜜蜂 3–4 μl 的 0.5 M 蔗糖溶液（溶于水）。此剂量足以支持 3–4 小时的喂食至训练间隔。
      1. 通常情况下，每小时的喂食至训练等待时间应提供约 1 μl 的 0.5 M 蔗糖溶液，以确保蜜蜂在间隔期间存活，同时在训练开始时具有足够的饥饿感，从而有动力学习条件化关联。若实验室温度较高，或使用不同浓度的蔗糖溶液，应相应调整喂食量或间隔时间。
         注：若喂食至训练间隔为 24 小时，需确保所有蜜蜂在训练开始前至少 24 小时已以 0.5 M 或 1 M 蔗糖溶液喂至饱足。在室温条件下，蜜蜂通常需要约 24 小时才能达到足够的动机水平，以在训练方案中良好响应。
         注：喂食所用蔗糖溶液的浓度应低于训练中作为奖励使用的浓度，以防止蜜蜂对训练中使用的蔗糖浓度敏感性降低，从而影响学习表现¹⁸。
      2. 喂食应在远离训练区域的位置进行。在训练前于训练环境中暴露于非条件刺激（蔗糖）可能影响后续对气味的条件化训练。
   2. 在喂食与训练间隔期间，将蜜蜂置于实验室安静区域的台面上，避免不必要的干扰。若实验室环境湿度较低，应将蜜蜂置于装有湿润纸巾的塑料容器中，以防止脱水，因为长时间暴露于低湿度环境可能导致蜜蜂死亡。
      注：实验过程中不得更改束缚和喂食方案！每次实验应使用固定的从束缚喂食到开始训练的时间间隔，确保所有蜜蜂接受完全相同的处理。

3. 条件化处理

1. 测试蔗糖敏感性
   1. 在开始训练前几分钟，用一小滴0.5 M蔗糖溶液（与喂食时使用的浓度相同）轻触蜜蜂的触角，以测试其取食动机。在此测试过程中不要让蜜蜂取食。如果蜜蜂伸展出喙，则表明其可能具有足够的学习动机，可用于本实验方案。
2. 实验设计
   注意：本实验方案可根据多种学习范式进行调整，以研究蜜蜂学习与记忆能力的多个方面。可调节的参数包括：试验间间隔、单次训练的蜜蜂数量、刺激间间隔、气味的种类、浓度和数量、非条件刺激的类型和浓度、试验次数及试验顺序（图1；表1）^19-21。在设计每次训练试验的具体方案时，必须确保个体之间的试验间间隔保持一致。试验间间隔过短、过长或不一致均会显著影响蜜蜂的学习表现。有关此主题的详细讨论，请参见文末讨论部分。
   注意：若蜜蜂处于温暖环境中，其学习任务的速度会更快。因此，应保持训练环境的温度恒定且温暖（尽可能维持在29–30 °C）。
3. 递送气味（条件刺激）
   1. 方法1
      1. 设置气味递送系统
         1. 将装有经气味处理滤纸的塑料20 ml注射器固定，使其稳定且小端正对蜜蜂触角。将活塞置于15 ml刻度处，并调整注射器位置，以便于操作活塞。
      2. 呈现气味刺激
         1. 每次试验开始时，将蜜蜂固定在训练装置的支架上，使其触角正对气味 cartridge。在开始气味刺激前，让蜜蜂在装置中适应15–25秒，以减少因视觉环境突然变化而造成的干扰。
            1. 若蜜蜂刚放入训练装置即对气味 cartridge 产生反应，可能是 cartridge 尖端残留有气味。使用浸有70%乙醇的无绒纸巾清洗 cartridge 以去除污染气味。若此方法无效，则更换 cartridge。
         2. 以稳定速度推动注射器活塞，使其在4秒内完全压下。在递送非条件刺激前，观察蜜蜂对气味的反应。
         3. 每次试验结束后，让蜜蜂在训练装置中再休息15–25秒。过早移动蜜蜂将显著降低每次训练试验的效果。
   2. 方法2
      1. 设置气味递送系统
         1. 气流源与流速
            1. 使用水族箱曝气泵或实验室台式压缩空气供应系统作为气味递送的气流源（若实验室配备后者）。
               注意：典型的水族箱曝气泵气流速率约为400 ml/min（7 ml/sec）；在4秒的气味刺激期间，28 ml空气将流经1 ml的cartridge。
            2. 在气流输送装置的管路中串联一个流量计，用于调节气流速率。调节流量计，使流速达到400 ml/min。使用另一个流量计检测气味 cartridge 出口处的实际流速。
            3. 通过塑料管路和阀门系统将气流连接至气味 cartridge。
               注意：下文所述的定时装置将在试验适当时间点打开阀门。塑料连接件通过Luer接口将气流系统与cartridge的注射器筒身相连。
            4. 无论使用何种气流源，均需定期检查流速，确保管路通畅且流速维持在设定值。
      2. 自动气味递送
         1. 使用可编程逻辑控制器（PLC）实现气味递送的自动化。
            注意：PLC程序设定为在启动程序（通过按钮触发）后6秒打开气味气流阀门，保持开启4秒，并在气味刺激开始后3秒发出可听见的喂食信号（通过小型扬声器），提示实验人员递送蔗糖。
         2. 使用小型LED指示每次试验中气味刺激的时间点。如有可能，使用红色LED，因为蜜蜂的光感受器对较长波长（红光）不敏感，而偏向较短波长（紫外光），因此不易察觉红光。将LED置于蜜蜂后下方，位于其视觉范围之外，以避免光线成为无意的条件刺激。
            注意：该灯光也有助于验证PLC是否正常运行，并有助于分析测试试验中蜜蜂行为反应的视频记录。
      3. 排气系统
         1. 在蜜蜂后方设置排气系统，以帮助气流经过蜜蜂并及时清除训练装置中的含气味空气，确保每次气味呈现具有明确的时间界限。
            注意：若实验室配有真空系统，可改装真空接口并连接烘干管作为导管，提供所需气流以排出训练装置内的空气。若无真空系统，可在烘干管中串联小型电风扇，并将其引至通风橱或窗外，亦可满足需求。
      4. 每天开始前，检查气味递送系统和排气系统的电气连接与气路连接。按下气味递送系统的启动按钮，记录从按下按钮到阀门开启（可听到轻微“咔哒”声且LED灯亮起）之间的时间，以及到非条件刺激提示信号（可听见音调）响起之间的时间。通过将湿润的手指置于即将连接至气味 cartridge 的接头前方来检测气流——仅当阀门开启时应有明显气流。通过将无绒纸巾靠近排气系统出口处，检查排气系统是否能产生足够强的气流，以有效清除训练装置内的空气。
   3. 安装气味 cartridge
      1. 在实验台面或小型Plexiglas 支架上放置适量模型黏土，用于固定蜜蜂和气味 cartridge，使其正对排气系统。将玻璃气味注射器插入黏土中，并调整其方向，使宽端开口正对蜜蜂头部。注射器末端应距离蜜蜂1–2 cm。在此范围内选择一个固定距离并保持一致。
      2. 将连接 cartridge 与气管及阀门系统的接头牢固地安装在注射器窄端的磨砂玻璃接口上。
   4. 呈现气味刺激
      1. 每次试验开始时，将固定好的蜜蜂放置在训练装置的支架上，使其触角正对气味 cartridge。在开始气味刺激前，让蜜蜂在装置中静置15–25秒，使其适应新环境。
         注意：若蜜蜂刚放入训练装置即对气味 cartridge 产生反应，可能是 cartridge 尖端残留有气味。使用浸有70%乙醇的无绒纸巾清洗 cartridge 以去除污染气味。若此方法无效，则更换 cartridge。
      2. 按下启动按钮，启动气味递送的定时机制。在刺激开始后、非条件刺激呈现前，观察蜜蜂对气味的反应。
      3. 每次试验结束后，让蜜蜂在训练装置中再静置15–25秒 ，以利于初始记忆的形成。过早移动蜜蜂将显著降低每次训练试验的效果。
4. 递送蔗糖（非条件刺激）
   1. 方法1
      1. 本方法使用牙签递送蔗糖。
         注意：建议使用塑料牙签，因为木制牙签可能带有气味，会影响蜜蜂对条件刺激的反应。
      2. 将牙签尖端浸入蔗糖溶液中，当需要递送非条件刺激时，将牙签置于蜜蜂前方，让蜜蜂舔食约1秒。
      3. 定期更换牙签，避免蔗糖积聚。
   2. 方法2
      1. 蔗糖递送系统
         注意：更精确递送非条件刺激的方法是使用微量注射器，可准确递送极小体积（十分之一微升）的蔗糖奖励。
         1. 将微量注射器的调节旋钮尽可能向后旋转。将蔗糖溶液装入微量注射器筒内，确保玻璃部分无气泡，并完成注射器组装。在将针头安装至注射器筒窄端前，先用蔗糖溶液填充针头接口部分。为确保针头内液体确为蔗糖而非清洗针头时残留的水，实验开始前应将调节旋钮向前推进1–2 μl。
   3. 蔗糖呈现
      1. 在呈现气味期间，将针头尖端保持在距蜜蜂约2 cm处。利用训练装置边缘稳定注射器，避免抖动，以免干扰蜜蜂。不要提前将针头靠近蜜蜂以等待喂食信号，否则会过早转移蜜蜂的注意力，使其从气味转向蔗糖。
      2. 一旦喂食信号响起，轻轻触碰触角直至蜜蜂伸展出喙，随即开始喂食。通常只需极轻微地触碰一两次触角即可。
         1. 奖励量应控制在0.2–0.8 μl之间。蜜蜂应在非条件刺激规定时间内（约1–2秒）轻松完全摄取整个液滴。避免使用“ad libitum”方式从大液滴中长时间喂食，此类液滴蜜蜂无法完全摄取。
         2. 注意观察触角上是否出现蔗糖积聚，这会降低蜜蜂对后续奖励呈现的反应。若发生此情况，应调整喂食程序。
         3. 为确保气味线索与蔗糖奖励的准确配对，应在提示音响起后尽快将蔗糖溶液液滴递送给蜜蜂。
            注意：条件刺激（气味）与非条件刺激（蔗糖）起始时间的间隔至关重要。理想情况下，气味呈现与蔗糖呈现应有短暂重叠。若条件刺激结束与非条件刺激递送之间相隔数秒以上，训练效果将明显下降。

4. 测试

1. 在训练结束后，使用无强化的测试试验来评估蜜蜂对条件化关联的学习效果和/或记忆保持情况。
   注意：有关在分析蜜蜂对训练试验表现的同时，还需分析其对无强化测试试验反应的重要性的详细解释，以及测试试验次数和测试气味目的的说明，请参见讨论部分。
2. 巩固时间
   1. 训练结束后，可立即进行测试试验，或让蜜蜂经历一段巩固期后再进行测试。
      注意：巩固期的时长，即训练与测试之间的时间间隔，取决于实验目的。若旨在研究学习差异或短期记忆，可在训练结束后立即或数小时后评估蜜蜂在测试试验中的表现。若实验涉及长期记忆的研究，则测试试验应在训练结束至少24小时后进行。
   2. 若测试试验在训练结束后超过24小时进行，则应在训练结束后立即以0.5 M蔗糖溶液喂食蜜蜂至饱足，并在此后每天至少喂食一次，直至测试前12–24小时停止。
      1. 为确保蜜蜂达到饱足状态，需多次重复喂食，直到蜜蜂在触及其触角时不再伸展喙部为止。每只蜜蜂最多可摄入40 μl蔗糖溶液以达到饱足。
   3. 在巩固期间，应将蜜蜂置于加湿容器中，以防其脱水死亡。
3. 测试试验
   1. 测试时仅使用新制备的气味 cartridges。
      注意：用于习得阶段的cartridges可能消耗不均，导致测试刺激在不同试验、不同气味及不同个体蜜蜂之间不一致，从而显著影响结果的一致性和可靠性。
   2. 测试过程中应保持与训练阶段相同的试验间间隔及其他实验参数。
   3. 测试试验中不得呈现非条件刺激，因为奖励的存在会改变蜜蜂对条件刺激的反应，可能掩盖条件化方案或处理的更细微效应。
   4. 应对所有测试试验进行录像，以便后续测量蜜蜂对气味反应的多个方面。

5. 记录蜜蜂的反应

1. 条件反射反应（PER）的二元（有/无）评分
   1. 在训练试验和测试试验期间，使用二元评分系统对条件反射反应（PER）进行评分。将反应记为阳性或阴性；当每组处理的样本量为20-40只蜜蜂时，这种评分方式足以满足多种类型的分析需求。反应的具体表现形式可能较为复杂²²。因此，建立一个易于观察和判断的阳性反应标准至关重要。
      1. 当蜜蜂的喙伸展超过由张开的上颚尖端连线所形成的界限时，记为阳性（+）反应。仅当蜜蜂在气味呈现开始后、结束前伸出喙时，才记为阳性反应。
      2. 若在整个试验过程中未出现喙的伸展，或在气味刺激结束后才出现喙的伸展，则记为阴性（−）反应。
      3. 避免尝试对部分伸展反应进行评分。如需对蜜蜂行为进行更精细的区分，可采用下文所述的视频分析技术。
2. 通过视频分析获取额外的PER测量指标（视频 1）
   1. 通过分析蜜蜂对气味反应的视频，获取行为测试中的额外信息。
      注：这些测量指标还可提供更高的时间分辨率，用于分析蜜蜂对气味的反应，尤其是在不同处理组之间在PER有无评分上无显著差异时尤为有用。
   2. 视频录制
      1. 始终使用未强化测试或消退试验进行视频录制。奖励的存在会改变蜜蜂对气味的反应，从而影响喙伸展的持续时间。
      2. 将摄像机架设在三脚架上，置于训练区域上方，并对准蜜蜂头部前方，使触角和喙在画面中清晰对焦。
      3. 将用于指示气味刺激呈现的小型LED灯放置在蜜蜂后方、视频中可见的位置，以便在分析时用于识别气味的开始和结束时间点。
      4. 在气味呈现前20秒开始录制，并在气味结束后的至少20秒内继续录制，期间不得干扰蜜蜂。
   3. 视频分析
      1. 将视频导入具备测量视频中特定帧之间时间间隔功能的视频编辑软件（如iMovie或Final Cut Pro）。
      2. 分析蜜蜂对气味的反应，时间范围从气味刺激开始时起算一段固定时段（例如，10秒或20秒）。
      3. 使用以下常见指标评估PER：
         1. 测量喙伸展的持续时间，即喙越过上颚-上颚连线（如上所述）的总时间。
            注：蜜蜂在10-20秒的时间窗口内可能多次伸展和收回其喙。应分别测量每次喙的伸展，并计算总持续时间。分析每次单独喙伸展的次数和持续时间也可提供有价值的信息。
         2. 测量喙伸展的潜伏期，即从气味开始（LED灯亮起）到首次喙伸展之间的时间。
         3. 统计并记录舌部（Glossal）伸展的次数和时间，相对于气味开始、首次伸展或其他时间参数。
         4. 追踪触角运动²³，这些运动也会表现出特征性的、与气味相关的改变。
            注：在视频1中，已使用视频追踪软件对触角运动进行追踪，以展示蜜蜂对气味刺激所引起的触角运动变化。

结果

我们展示了上述PER方案应用的两个实例。第一个实例采用方法2，研究了蜜蜂如何根据气味与条件刺激（CS）在分子结构上的相似性来感知不同气味^5,24,25。第二个实例则展示了方法1的应用，以及在科研实验室中初次开展PER条件化实验时必须注意的一些事项。

此类研究已用于结合生物成像¹³或电生理分析²⁶来描述蜜蜂和蛾类的嗅觉“感知空间”。蜜蜂（n = 20）经过12次前向配对训练试验，被训练将癸醛气味与蔗糖强化建立关联（图3A）。约有10%的蜜蜂在第一次试验中出现“自发性”反应，这是正常现象。此后，随着后续几次试验的进行，产生反应的蜜蜂比例逐渐上升，至第五次试验时达到100%，并在之后所有试验中保持该水平。多项研究表明，这种反应比例的上升特异性地出现在前向配对条件下（图1），相较于若干重要的对照程序具有显著差异³。在习得阶段结束后，每只蜜蜂均接受一系列无强化的测试试验（图3B），其中包括暴露于条件刺激（CS）气味以及其他在分子结构上与CS系统性差异的多种气味物质。蜜蜂对CS气味的反应最强，对其他气味物质的反应则随着结构差异的增大而逐渐减弱，对与CS最不相似的气味物质反应最低。

在图4中，展示了一个近期工作坊的结果，学生在该工作坊中首次学习使用方法1对蜜蜂进行条件化训练。学生首先通过将甲基环己酮（MCH）或辛醇（OCT）与蔗糖强化进行前向配对，来对蜜蜂进行条件化训练（图4A）。在第一次试验中，蜜蜂的反应百分比较低，随后各次试验中的反应比例逐渐上升，表明蜜蜂学会了气味与蔗糖之间的关联。不同学生组之间，蜜蜂学习条件化关联的程度存在差异。根据我们的经验，这类差异可能源于作为条件刺激（CS）所使用的气味、方法本身（方法1）中存在的不精确因素，或实验操作者训练水平的不同。在第三种情况下，随着实验者经验的增加，实验结果会迅速变得更加一致。条件化训练完成后，每只蜜蜂均用每种气味测试两次。在经过OCT或MCH前向配对条件化训练的蜜蜂组中，蜜蜂对条件化气味的反应最强，这与预期一致（图4B）。

另一组蜜蜂对气味OCT进行顺向配对训练，同时平行地与另一组进行反向配对训练，即在反向配对组中，气味OCT与蔗糖呈反向顺序配对。反向配对是多种对照程序之一，用于证明反应增强特异性地源于顺向配对，而非其他过程（例如由敏感化引起的非特异性兴奋）。在反向配对中，蔗糖非条件刺激（US）和气味条件刺激（CS）的呈现顺序与图1所示相反。由于在反向配对中，气味CS是在蔗糖呈现之后才出现，因此无法对条件反应（CR）进行评分，故未展示其习得数据。正如对联想式条件反射所预期的那样，顺向配对组对OCT的反应水平高于反向配对组（图4C）。

图 1. 采用前向配对方式进行条件反射的实验设计示意图。 本图中所用术语的定义见 表 1。(A) 条件刺激（气味）先于非条件刺激（蔗糖/水溶液）出现，并与之部分重叠。该条件刺激与非条件刺激之间的关系对蜜蜂和蛾类的条件反射训练最为有效。但最适刺激间期（ISI）可能因训练方案和动物物种而异¹。(B) 条件刺激（CS）、条件反应（CR）、非条件刺激（US）和非条件反应（UR）的时间分解及其相对时序。在非条件刺激呈现之前出现，或在无强化的“测试”试验中出现的条件反应（CR），是实验方案中的因变量测量指标。

图 2. 使用后气味耗竭情况。 本实验中，气味滤芯按文中所述以己醇作为条件刺激（CS）。己醇在PER研究中常被用作条件刺激，但实际耗竭速率将取决于所用气味物质及溶剂。滤芯在8次试次中每分钟使用一次，每次4秒（假设标准实验中每次试次使用5只蜜蜂，则相当于总共使用40次）。所用溶剂中的稀释浓度（对PER实验而言相对标准）分别为2.0 M（A）和0.2 M（B）。（A, B） 在第一次和第八次试次后，通过固相微萃取（SPME）纤维吸附气味成分，随后将吸附物脱附至气相色谱仪进行分析。两种溶剂和两种浓度条件下，第一次试次后峰面积均显著高于第八次试次（Wilcoxon配对符号秩检验，p < 0.05 [*] 或更高），表明滤芯经多次使用后释放的气味量减少。（C, D） 相同数据仅显示第八次试次结果，y轴范围扩大。结果显示，在较低浓度下，己烷的耗竭程度略高于矿物油，但在高浓度下差异不明显。

图3. 使用癸醛作为条件刺激（CS）及方法2进行条件化训练的获得与测试。（A） 在12次正向配对试验中逐次试验的条件反应（CR）（图1）。数据来自20只蜜蜂，分为4组，每组5只。刺激间间隔（ISI）为3秒，试验间间隔（ITI）为6分钟。（B） 使用与癸醛在碳链长度和/或羰基碳位置上不同的气味进行的无强化测试。这些气味在四组之间以随机顺序呈现，并与对癸醛的强化试验（每两到三次测试插入一次）交替进行，以避免条件反应（CR）消退。

图4. 研究生在工作坊中接受使用PER方法1训练蜜蜂的实验数据。(A) 三组蜜蜂对辛醇（Gp1和Gp2的n分别为23和15）和甲基环己酮（n = 10）进行条件化训练的习得数据。(B) 两种气味在无强化测试中的条件反应（CRs）；每组随机呈现四次试验。(C) 两组蜜蜂在无强化测试中对两种气味的反应，其中一组为前向配对（Gp 1，n = 23），另一组为后向配对（n = 25）。

术语（缩写）	定义	相关示例
条件刺激（CS）	最初几乎不引起或完全不引起反应的刺激，用于提示非条件刺激（US）的出现	ODOR
条件反应（CR）a	在与非条件刺激（US）建立关联后，对条件刺激（CS）产生的反应	PROBOSCIS EXTENSION
非条件刺激（US）	具有生物学意义、能引发反应的刺激	SUCROSE/WATER SOLUTION
非条件反应（UR）a	对非条件刺激（US）产生的反应	PROBOSCIS EXTENSION
刺激间间隔（ISI）	条件刺激（CS）起始与非条件刺激（US）起始之间的时间间隔	ODOR to SUCROSE interval
试验间间隔（ITI）	同一动物连续两次CS-US配对之间的时间间隔	ODOR (trial n) to ODOR (trial n+1) interval

表1. 重要术语。 这些术语的图示见图1。^a在PER条件反射中，条件反应（CR）与非条件反应（UR）相同，但在其他类型的关联和反射中，CR与UR可能不同。

视频 1. 一只蜜蜂在经过气味条件化训练后表现出伸吻反应（PER）的视频。请注意，蜜蜂在气味呈现后约 1.5 秒出现 PER 反应。追踪软件记录了蜜蜂在气味刺激下触角的运动。视频右上角绘制的线条表示实际的触角运动轨迹。屏幕底部的两个图表分别显示了触角在 X 轴（左）和 Y 轴（右）方向上的运动。视频中图表内的垂直线从左至右依次表示：光开启、PER 反应、光关闭以及喙部回缩。

讨论

本方案介绍了两种利用PER程序进行条件化处理的可靠方法。这些方法是已成功应用的多种方法中的两种^27,21。我们在所有使用PER的实验研究中均采用方法2，因其具有持续的可靠性，即使在不同实验操作者之间也表现稳定。

这一基本实验流程已被应用于多种不同的蜜蜂研究，包括使用不同的条件刺激和不同的行为反射。该方法还被用于探究学习差异的遗传基础^28,29、大脑中嗅觉感知与记忆的生理相关性^13,14,30，以及行为的调节机制和分子遗传基础^15,16,31。由于人们对蜜蜂嗅觉学习的生态学意义已有深入认识——这一研究始于卡尔·冯·弗里希（Karl von Frisch）一百多年前的开创性工作³¹——因此，通过伸吻反射（PER）获得的研究结果可直接关联到蜂群的生存需求。最近，该方法还被应用于农业研究，以考察农药和环境毒素对蜜蜂行为的亚致死效应¹⁷。

该基本实验方法具有很强的适用性，也可用于研究其他物种中的相关问题。已有研究利用两种蛾类——烟草天蛾（Manduca sexta）和棉铃虫（Spodoptera littoralis）——通过伸吻反射（PER）实验探究气味识别的神经基础以及各自嗅觉学习的能力^32,33。果蝇的伸吻反射实验则揭示了化学感受和学习过程中涉及的分子信号级联反应的诸多机制³⁴。此外，伸吻反射技术最近还被用于研究重要疾病传播媒介——锥蝽（Rhodnius prolixus）——的 Habituation（习惯化）现象³⁵。

通常情况下，该实验方法对操作步骤的改变具有较强的耐受性；采用不同的方法很可能仍能产生相同的处理组间相对差异。尽管操作流程相对简单，但在某些情况下仍可能出现一些问题，导致蜜蜂无法学会气味-蔗糖的关联。以下内容涉及对本实验方案可能进行的调整，以及在PER条件化训练过程中可能遇到的一些常见问题。

条件化方案中试验次数与类型的考虑

任何学习方案都需要在习得阶段使蜜蜂经历一定数量的训练试验。该数量主要取决于任务的难度。蜜蜂在单次试验后即可学会简单任务，但至少需要三次试验才能诱导形成长期记忆。正如预期，蜜蜂需要显著更多的试验次数才能充分掌握困难任务。通常情况下，存在一个最大试验次数上限，超过该上限后蜜蜂的表现将不再显著提升。该上限取决于具体任务、气味类型与浓度，以及蔗糖浓度。

当使用多种不同气味的试验时，应以伪随机序列呈现不同类型的试验，以防止蜜蜂记忆简单的气味呈现顺序，而非学习不同气味之间的差异³⁶。在这些伪随机序列中，每种气味类型的试验次数必须相等。此外，对于所有气味而言，某一气味类型试验之前和之后出现相同气味或其他任一气味的概率必须相等。对于两种气味——A 和 B——可使用以下序列：ABBABAAB。在八次试验中，每种气味各呈现四次。通过连接相同的序列，以达到每种气味所需试验次数。

无论实验设计如何，都有一些参数必须保持恒定，以优化学习效果。条件刺激（CS）与非条件刺激（US）之间的重叠对于有效的条件反射至关重要。图1、表1所示的试验间间隔需要保持恒定并进行优化，因为不规则或过短或过长的试验间间隔会显著影响条件反射方案的有效性¹。

行为测试实验的重要性与设计考量

在实验的“获得阶段”记录的反应（此时条件刺激 CS 与非条件刺激 US 同时呈现）可能具有参考价值。但需注意，不同试验类型中的气味呈现条件可能存在差异。在强化试验中，伴随蔗糖奖励的气味会与视觉刺激（递送蔗糖液滴装置的运动）同时出现，这可能影响蜜蜂的反应；此外，蜜蜂仅有三秒钟时间作出反应（四秒的气味刺激减去与蔗糖呈现重叠的一秒；图1）。如果实验涉及蜜蜂学习区分两种气味（例如，一种强化、一种未强化），那么在交替试验中呈现的未强化气味不伴随奖励相关的视觉刺激，且蜜蜂有完整的四秒钟时间作出反应。因此，在获得阶段，对这两种气味的反应并不完全可比。无论采用何种条件化方案，均不应仅依赖获得曲线¹来判断学习效果。为了更准确地评估蜜蜂的学习情况，应引入一系列未强化的测试试验，在这些试验中两种气味均不伴随奖励，从而确保所有刺激的测试条件完全一致。

根据实验的具体目的，测试可以包括对条件化气味的单次测试试验，或对条件化气味的一系列试验，或条件化气味与一种新气味的组合试验。对条件化气味进行单次测试试验，可简单地检测蜜蜂是否记得该条件化气味。然而，第一次测试试验的反应可能既反映了蜜蜂的动机水平，也反映了它们对条件化气味的回忆。一系列测试试验，无论是对条件化气味的一系列消退试验，还是对条件化气味与一种或多种新气味的单次测试系列，也可用于评估记忆。一系列消退试验可用于评估蜜蜂对该条件化关联的记忆强度：回忆越强，消退条件化反应所需的试验次数就越多。对条件化气味与新气味进行一系列单次测试，还可评估蜜蜂对条件化气味记忆的特异性。

同时对对照组和处理组在相同的时间点进行条件化处理和测试也至关重要。将条件化后不久测试的蜜蜂与长时间饲养后测试的蜜蜂进行比较是存在问题的，因为蜜蜂在饱食过程中会接触到蔗糖非条件刺激（US），从而产生干扰。例如，长时间间隔后表现下降可能归因于记忆衰退，也可能归因于因非强化性接触US所引起的动机状态改变和/或学习效应，这会使结果变得不明确。因此，处理组的表现应始终以在同一时间点进行条件化和测试的对照组为参照进行判断。

气味浓度与完整性

气味（条件刺激，CS）的浓度和完整性可能受到多种因素的影响而受损。气味传递中最常见的问题是因过度使用导致气味 cartridges 耗尽（图2）。为避免这一问题，建议每使用10至12次（即每进行2或3轮实验，每组5只蜜蜂）后更换cartridges。在测试试验中必须使用全新的cartridges，因为已使用过的cartridges可能消耗程度不同，从而导致提供的气味刺激不均等。另一个常见问题是气味cartridges被污染，这通常是由于在未彻底清洁的情况下将同一cartridge用于多种不同气味所致。被污染或不洁净的气流可能无意中引入额外的嗅觉刺激（使用活性炭过滤器可防止背景污染）。当将PER条件反射训练与对气味的生理反应测量相结合时，这一问题尤为突出。若气味cartridges存在泄漏，蜜蜂会在实验开始前就暴露于气味中，从而降低气味刺激的显著性。此外，气味输送系统的供气装置若安装不严密，可能导致阀门打开时气味输送量极少甚至完全无法输送，从而人为地削弱蜜蜂对目标气味的反应。

蔗糖溶液与非条件刺激（奖励）

作为非条件刺激（US）所使用的蔗糖溶液的用量、浓度和完整性对实验的成功至关重要。条件化效果取决于用作非条件刺激的蔗糖水溶液的用量和浓度³⁷。方法2中使用的显微注射器可精确控制非条件刺激的递送（精确至0.2 μl），我们建议在所述的两种方法中均使用此类注射器。牙签法（方法1）适用于无法使用昂贵注射器的情况，例如在对大量学生进行培训、野外工作或预算有限的情况下。只要保持准确的时间控制，并定期更换牙签以避免蔗糖积累（以及递送浓度的变化），方法1的严谨实施也是可行的。然而，使用牙签更难以精确控制和估算所递送非条件刺激的量和强度，而这一点在条件化研究中非常重要¹。为提供足够奖励以维持蜜蜂学习条件关联的动机，所需蔗糖浓度可能取决于任务难度、蜜蜂的内部状态或一年中的时间。任务越困难，蜜蜂成功学习所需蔗糖溶液的浓度就越高。即使在5 °C条件下，蔗糖溶液中也可能滋生霉菌，这会破坏溶液的完整性，影响蜜蜂在实验期间的健康及其对奖励的感知。最好每隔几天更换一次溶液。

条件刺激与非条件刺激呈现的精确性、时机及一致性

正确实施PER实验程序（或任何条件反射程序）最关键的环节在于条件刺激（CS）和非条件刺激（US）呈现的精确性、时机控制和一致性（图1）。初次进行该实验的研究人员常常在一种或两种刺激的呈现上不够精确。若刺激间间隔（ISI）设置不当，导致CS与US未能有效重叠，则会导致条件反射效果不佳。程序逻辑控制器（PLC）会自动向实验人员发出声音信号，提示其在气味刺激开始后3秒给予蔗糖溶液。研究人员应在信号发出后，迅速将蔗糖/水液滴递送至蜜蜂附近。这些操作有助于确保ISI的一致性。在训练区域旁放置秒表，可方便地确定每次试验的时间点，并监控蜜蜂在刺激呈现前后停留在实验区域的时间。这样可使刺激间间隔（ITI）保持相对一致，并使整个实验过程以可控的节奏进行。ITI过短（例如少于1分钟）或过长均可能导致条件反射效果下降¹。

季节性、环境和情境因素对蜜蜂表现的影响

蜜蜂的学习表现可能在训练前后受到周围环境的显著影响。季节变化带来的温度波动和食物可获得性变化，常常会改变蜜蜂的学习动机。当花朵盛开时，蜜蜂在实验室内学习条件反射关联的动机就会降低³⁸。当蜂群受到极端温度、食物短缺或疾病相关压力等应激因素影响时，其学习表现也会明显下降。在飞行室内饲养的蜜蜂可能在初期表现出良好的学习能力，但随着时间推移，疾病和衰老带来的应激同样会逐渐削弱其学习表现。训练过程中的环境背景也可能降低蜜蜂的表现。任何额外的气味、移动或其他刺激都可能使蜜蜂分心，偏离实验刺激。为避免这一问题，应保持相对一致且简化的视觉环境。

基因型和经验影响 PER 表现

由于任务分工、基因型或其他环境因素，蜜蜂工蜂在任何条件反射实验中的表现可能存在显著差异²⁰。因此，为了减少个体间的变异，尽可能标准化实验中所用动物的类型非常重要。在由一只自然交配的蜂王所领导的蜂群中，即蜂王与多只雄蜂交配，工蜂的父系基因型会有所不同。遗传背景可能导致感官反应性³⁹和学习能力²⁹的显著差异。使用仅由单只雄蜂精子人工授精的蜂王所领导的蜂群，可降低这种个体间的变异²⁸。

上述方案包括一种从蜂巢入口收集蜜蜂工蜂的方法。然而，这些蜜蜂在年龄或行为任务方面存在差异。它们可能是年轻的（缺乏经验的）或年长的（经验较丰富的）采集蜂，也可能是进行首次定向飞行的年轻蜜蜂，或者是守卫蜂。为减少变异性，可在蜜蜂羽化为成虫时（以控制年龄）和/或开始采集活动时（以控制经验），使用快干搪瓷漆或标记标签对蜜蜂进行标记。数天后，收集已标记的蜜蜂用于训练。从事哺育行为的工蜂可从蜂巢框中采集。当工蜂将头部伸入蜂巢幼虫室以喂养和照料其中的幼虫时，即可准确识别其为哺育蜂。

使用处女蜂王或雄蜂进行PER条件化训练

除了工蜂之外，处女蜂王和雄蜂也可通过 PER 实验程序进行训练，用于培育在学习能力上存在差异的蜜蜂遗传品系的研究²⁸。处女蜂王应在羽化后尽快采集，并直接放入固定装置中，无需麻醉。从蜂群内的育雏巢脾上采集的年轻未成熟雄蜂通常缺乏学习动机。雄蜂在开始交配飞行后，能够 readily完成 PER 任务的学习²⁸。应在它们完成交配飞行返回时进行采集，并在用于培育蜂王的蜂群中，将其置于小型笼内过夜饲养。切勿在训练前一日尝试将雄蜂固定于装置中；它们在固定装置中过夜存活率较低。在开始训练前约两小时，可从笼中取出雄蜂，直接放入固定装置中，无需麻醉。

结论

这种PER实验方法可作为设计PER实验的起点。大多数PER实验方案都需要对该流程进行某些修改，以实现特定的实验目标，并适应多个处理组的设置。该方法易于实施，但正确操作需要注重细节并加以练习。一旦掌握，该方法便可成为多种基础研究和应用研究项目中针对不同昆虫物种的一项有力研究工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
气味化合物（例如）
1-己醇	Sigma-Aldrich	471402-100ML	更多示例
2-辛酮	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	气味剂，参见任意
庚醇	Sigma-Aldrich	51778-5ML	关于嗅觉的论文
香叶醇	Sigma-Aldrich	163333-25G	处理自
壬醛	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Smith 实验室
己烷	Sigma-Aldrich	296090-1L
重矿物油	Sigma-Aldrich	330760-1L	确保它’无气味。
乙醇	Sigma-Aldrich	459836-1L
闪烁瓶	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	使用小型钻头在小瓶盖上钻一个小孔。
蜜蜂固定装置			定制自直径为0.9 cm的塑料饮料吸管或硬质塑料/金属管。
胶带
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
洗瓶	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	对于70%乙醇。
干燥管
仅适用于方法1
20 ml 一次性塑料注射器	Cole-Parmer	WU-07945-18
15 mm 滤纸圆片	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
图钉
牙签
仅适用于方法2
Gilmont 微量注射器，0.2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
Gilmont 微量注射器针头	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub 皮下注射针头	Fisher Scientific	14-826-10
1 cc 结核菌素注射器（塑料/玻璃）	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA 或 Z192090-200EA	玻璃结核菌素注射器可选用，但塑料注射器价格低廉得多，且在有限次数的使用中性能良好。
小型橡胶/硅胶限位器	Cole-Parmer	EW-95702-02	由外径为4.8 mm的硅胶管或1 cc注射器活塞的橡胶头制成。
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Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
75 x 100 mm 滤纸	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Direct Logic 05 可编程逻辑控制器	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm，4 mm， & 内径为6 mm的PVC或硅胶管	Cole-Parmer	各种	Cole-Parmer 提供多种适用的管路选择。
聚丙烯连接器 & leur接头	Cole-Parmer	各种	Cole-Parmer 提供多种管径的接头和管件供选择。
65 mm 相关流量计	Cole-Parmer	EW-03216-08	带玻璃浮子的铝制转子流量计；用于液体和气体，带阀门。
或
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PCB电路板 12V直流 70分贝压电蜂鸣器	RadioShack	273-074