精子发生过程的细胞学分析：Drosophila 精巢的活体与固定制备

摘要

本文描述了分离和制备用于相差显微镜和荧光显微镜成像的活体及固定Drosophila睾丸样品的方法。 

摘要

黑腹果蝇 是一种功能强大的模式系统，已被广泛用于阐明多种生物学过程。例如，对雌性和雄性生殖系的研究 果蝇 极大地促进了当前对减数分裂以及干细胞生物学的理解。文献中已有大量关于细胞分离与成像的优秀实验方案 黑腹果蝇 卵巢 和睾丸^3-12. 本文所述为解剖与制备的方法 果蝇 用于显微分析的睾丸组织制备方法配有视频演示。本文介绍了从成年雄性个体腹部分离睾丸的实验方案，以及制备活体组织切片用于相差显微镜分析的方法；同时提供了固定睾丸组织并进行免疫荧光染色以用于荧光显微镜分析的实验流程。这些技术可应用于对 果蝇 在精子发生过程中存在缺陷以及蛋白质亚细胞定位可视化方面存在问题的突变体。

引言

Drosophila 睾丸是研究多种生物学过程的理想模型系统，包括干细胞调控、减数分裂以及精子发育^13-18。其精母细胞及其减数分裂纺锤体体积较大，便于进行细胞学分析；同时，精子发生过程中较为松弛的细胞周期检验点有助于研究细胞周期基因的突变。在睾丸的长轴方向上，不同类型的细胞按有序的时序排列，精子发生过程中的任何异常均可能导致这种整体结构的改变。结合 Drosophila 的遗传学工具，这些特性为精子发生过程的突变分析提供了便利^21-23。

果蝇精子发生的过程已有明确定义。在精巢内，以囊状结构同步发育的生殖细胞沿精巢长度方向依次经历精子发生的不同阶段。在雄性生殖细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，胞质分裂均不完全，导致子细胞通过称为环状通道的胞质桥相互连接（图1）。精巢顶端存在一群生殖干细胞，可产生精原细胞；这些精原细胞经历四次伴有不完全胞质分裂的有丝分裂，形成含有16个细胞的初级精母细胞囊。在减数分裂前的S期之后，初级精母细胞进入G2期，这是一个持续约90小时的长期生长期，期间细胞体积增加约25倍。经过减数分裂I和减数分裂II，分别形成含有32个细胞的次级精母细胞囊和含有64个细胞的单倍体精子细胞囊。未成熟的圆形精子细胞经历广泛的细胞重塑，最终发育为成熟精子。减数分裂后的细胞，特别是伸长中的和成熟的精子细胞束，占据了精巢的大部分体积。

方案

1. 睾丸解剖

1. 使用CO₂气流在瓶子或小瓶中麻醉果蝇₂ 并转移到果蝇固定板上。
2. 在解剖显微镜下使用小号画笔对果蝇进行分选，并根据实验需求收集适量数量的果蝇 果蝇 所需基因型的雄性个体。年轻的雄性个体（0-2日龄）最适合用于观察精子发生早期各阶段的细胞。例如 精原细胞、初级精母细胞和早期减数分裂后精细胞），而稍年长的雄性个体（2-5日龄）则更适合观察精子发生的最后阶段的细胞（尤其是成熟精子）。
3. 使用镊子去除每只果蝇的翅膀（以防止在解剖过程中果蝇漂浮在液体中）。
4. 加入约 500 ml 磷酸盐缓冲液（130 mM NaCl，7 mM Na₂HPO₄，3 mM NaH₂PO₄；PBS）滴加到黑色背景的硅胶包被解剖皿中。其他水溶液也已成功用于睾丸解剖³.
5. 将镊子朝向果蝇的前端，夹住其胸部，并将其浸入PBS液滴中。在体视显微镜下观察，用另一把镊子夹住并向后牵拉外生殖器（位于腹面腹部末端的深褐色结构），直至其与腹部分离。大多数情况下，睾丸、精囊和附属腺会随外生殖器一同被拉出；若未完全取出，可将一把镊子插入腹部，轻轻分离并取出睾丸。
6. 使用两把镊子在 PBS 液滴中将睾丸与附属腺体及外生殖器分离图2）。野生型睾丸因其黄....

结果

一对正确解剖的Drosophila雄性生殖器官示例见图2A。从成年雄蝇腹部取出的睾丸通常通过一对精囊（蓝色，图2A'）与射精管（棕色，图2A'）和一对附属腺（绿色，图2A'）相连。为了将睾丸与大部分伴随的体细胞组织分离，应去除并弃去射精管和附属腺，仅保留睾丸对和精囊（图2B和2B'）。精囊也可进一步去除，仅保留睾丸对用于后续处理。

选择用于睾丸解剖的成年雄性果蝇的年龄是一个重要的考虑因素。在年轻的雄性果蝇中（羽化后0-2天），精囊较小且几乎为空，而睾丸处于最大直径状态（如图2所示）。使用较年轻的雄性可确保获得相对较多的正在分裂的生殖细胞（正在进行有丝分裂或减数分裂）以及早期的减数分裂后精子细胞。当使用较年长的雄性果蝇（羽化后3-5天）进行解剖时（图像未显示），精囊更为明显，因其充满精子而膨胀，且睾丸比年轻雄性更细。如果实验目标是观.......

讨论

尽管野生型果蝇的睾丸因其黄色而易于识别（与之相邻的组织为白色），但突变型果蝇的睾丸 白色 突变果蝇呈白色，因此有时可能与肠道组织混淆。大多数转基因品系通常处于 白色 背景，也因微型-白色 基因发现于 P-元素不会促进睾丸中的色素积累。当 果蝇 睾丸无法通过颜色区分，其他易于识别的特征包括其螺旋状排列以及成对出现。¹²注意，一些研究人员发现使用解剖针比使用镊子更容易分离睾丸¹².

该方案的关键步骤是制备压碎的睾丸组织。一种有效的方法是将载玻片悬于含有睾丸组织的盖玻片上方几毫米处，使盖玻片上 PBS 的表面张力将含有组织的盖玻片向上拉向载玻片。这种方法通常可破坏精原囊并使细胞在载玻片上充分分散，非常适合对单个细胞进行成像。 alternatively，若需保留完整或部分精原囊用于成像，可增加加在盖玻片上的 PBS 体积（从 4–5 µL 增至 7–8 µL）。

如果某种特定的 Drosoph.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	用于将Kimax培养皿制成硅胶包被解剖皿的双组分硅酮弹性体
PAP笔	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
透明指甲保护剂	Wet n Wild	7780235001
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36931
小鼠抗γ-微管蛋白抗体（克隆GTU-88）	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure山羊抗小鼠IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
乙醇	Fisher Scientific	AC61511-0040
甲醇	Fisher Scientific	A412-4
16% 甲醛	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	按照生产商说明用于硅化盖玻片
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	溶于75%乙醇，浓度为0.5 mg/ml；保存于-20 °C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes精细任务擦拭纸	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	分子生物学级
带螺旋盖的玻璃Coplin染色缸	Electron Microscopy Sciences	70315
单面磨砂载玻片	Corning	2948-75X25
聚-L-赖氨酸包被载玻片	Polysciences, Inc.	22247-1	可选（用于替代未处理载玻片）
方形盖玻片	Corning	2865-22
刀片	Fisher Scientific	12-640
Kimax培养皿	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
镊子	Dumont	52100-51S	5型INOX
Stemi 2000-CS体视显微镜	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40X物镜	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X物镜	Carl Zeiss