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方法文章

精子发生过程的细胞学分析：Drosophila 精巢的活体与固定制备

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DOI：

10.3791/51058

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2014年1月20日

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

本文描述了分离和制备用于相差显微镜和荧光显微镜成像的活体及固定Drosophila睾丸样品的方法。 

摘要

黑腹果蝇 是一种功能强大的模式系统，已被广泛用于阐明多种生物学过程。例如，对雌性和雄性生殖系的研究 果蝇 极大地促进了当前对减数分裂以及干细胞生物学的理解。文献中已有大量关于细胞分离与成像的优秀实验方案 黑腹果蝇 卵巢 和睾丸3-12. 本文所述为解剖与制备的方法 果蝇 用于显微分析的睾丸组织制备方法配有视频演示。本文介绍了从成年雄性个体腹部分离睾丸的实验方案，以及制备活体组织切片用于相差显微镜分析的方法；同时提供了固定睾丸组织并进行免疫荧光染色以用于荧光显微镜分析的实验流程。这些技术可应用于对 果蝇 在精子发生过程中存在缺陷以及蛋白质亚细胞定位可视化方面存在问题的突变体。

引言

Drosophila 睾丸是研究多种生物学过程的理想模型系统，包括干细胞调控、减数分裂以及精子发育13-18。其精母细胞及其减数分裂纺锤体体积较大，便于进行细胞学分析；同时，精子发生过程中较为松弛的细胞周期检验点有助于研究细胞周期基因的突变。在睾丸的长轴方向上，不同类型的细胞按有序的时序排列，精子发生过程中的任何异常均可能导致这种整体结构的改变。结合 Drosophila 的遗传学工具，这些特性为精子发生过程的突变分析提供了便利21-23。

果蝇精子发生的过程已有明确定义。在精巢内，以囊状结构同步发育的生殖细胞沿精巢长度方向依次经历精子发生的不同阶段。在雄性生殖细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，胞质分裂均不完全，导致子细胞通过称为环状通道的胞质桥相互连接（图1）。精巢顶端存在一群生殖干细胞，可产生精原细胞；这些精原细胞经历四次伴有不完全胞质分裂的有丝分裂，形成含有16个细胞的初级精母细胞囊。在减数分裂前的S期之后，初级精母细胞进入G2期，这是一个持续约90小时的长期生长期，期间细胞体积增加约25倍。经过减数分裂I和减数分裂II，分别形成含有32个细胞的次级精母细胞囊和含有64个细胞的单倍体精子细胞囊。未成熟的圆形精子细胞经历广泛的细胞重塑，最终发育为成熟精子。减数分裂后的细胞，特别是伸长中的和成熟的精子细胞束，占据了精巢的大部分体积。

功能性精子成功运输至雌性果蝇体内，需要雄性生殖系统各组成部分之间的协调运作。雄性生殖系统由多个成对结构（睾丸、储精囊和附属腺）以及一条单一的射精管组成（图2）。精子在睾丸中产生，并在交配前储存在储精囊中24。附属腺含有分泌细胞，可产生精液。精子从储精囊迁移至射精管时，会与来自附属腺的精液混合。射精管同时连接储精囊和附属腺。最终，精子与精液的混合物通过位于雄性腹部后端的射精球被泵入雌性果蝇的阴道25。精液中的蛋白质对于精子在雌性黑腹果蝇（Drosophila）生殖道内特化器官——受精囊中的长期储存至关重要26。

优秀的分离方法 果蝇 睾丸以及处于不同精子发生阶段的细胞的可视化在科学文献中已有报道3-12我们在此通过提供这些实验方案的实例并辅以视频演示，进一步丰富了这一知识体系。活体睾丸样本的制备方案用于相差显微镜观察，该方案基于先前描述的方法。27睾丸的甲醛固定和免疫染色方案同样基于先前描述的方法。28. 本文所述方法已应用于多项研究中 果蝇 精子发生（例如，用于评估动力蛋白（dynein）在微管负端定向运动中的作用） 黑腹果蝇 精子发生

除了基本实验方案外，还提供了调整解剖方法的建议，以便富集精原细胞、初级精母细胞或成熟精子。文中描述了不同的睾丸处理方法，可根据需要保持精巢囊完整或将其分散。使用该方法的优势在于 黑腹果蝇 睾丸作为模式系统的优势在于，与 果蝇 卵母细胞和胚胎、抗体及染料在从睾丸分散后可轻易穿透细胞，所需洗涤步骤较少，因此实验方案可在相对较短的时间内完成。

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方案

1. 睾丸解剖

  1. 使用CO₂气流在瓶子或小瓶中麻醉果蝇2 并转移到果蝇固定板上。
  2. 在解剖显微镜下使用小号画笔对果蝇进行分选，并根据实验需求收集适量数量的果蝇 果蝇 所需基因型的雄性个体。年轻的雄性个体（0-2日龄）最适合用于观察精子发生早期各阶段的细胞。例如 精原细胞、初级精母细胞和早期减数分裂后精细胞），而稍年长的雄性个体（2-5日龄）则更适合观察精子发生的最后阶段的细胞（尤其是成熟精子）。
  3. 使用镊子去除每只果蝇的翅膀（以防止在解剖过程中果蝇漂浮在液体中）。
  4. 加入约 500 ml 磷酸盐缓冲液（130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3 mM NaH2PO4；PBS）滴加到黑色背景的硅胶包被解剖皿中。其他水溶液也已成功用于睾丸解剖3.
  5. 将镊子朝向果蝇的前端，夹住其胸部，并将其浸入PBS液滴中。在体视显微镜下观察，用另一把镊子夹住并向后牵拉外生殖器（位于腹面腹部末端的深褐色结构），直至其与腹部分离。大多数情况下，睾丸、精囊和附属腺会随外生殖器一同被拉出；若未完全取出，可将一把镊子插入腹部，轻轻分离并取出睾丸。
  6. 使用两把镊子在 PBS 液滴中将睾丸与附属腺体及外生殖器分离图2）。野生型睾丸因其黄色而易于与邻近的白色组织区分。立即进行步骤2。
  7. 从末成熟雄性个体中分离睾丸即 在蛹壳内（被蛹壳包裹）的情况下，必须首先执行一个额外步骤，即从蛹壳中取出果蝇；该步骤此前已在其他文献中描述过。31从步骤1.2开始，按照成年睾丸的解剖方法进行解剖。
  8. 为了从幼虫期雄性个体中分离睾丸，需对一种睾丸分离方案进行改良操作 果蝇 幼虫卵巢32简而言之，雄性幼虫可通过其脂肪体后三分之一处存在的一对大型、透明、卵圆形结构（幼虫睾丸）与雌性幼虫相区分。为分离幼虫睾丸，按幼虫卵巢分离所述方法，将雄性幼虫部分剥开，以分离睾丸及其周围的脂肪体。随后立即进入本方案中所述的第2步；睾丸可在制片前（步骤2.3或3.14）按卵巢处理方法从脂肪体中分离。32.

2. 样品制备与活体成像

  1. 用一对镊子将 2-3 对睾丸轻轻放入载玻片上的一滴 4-5 ml PBS 液滴中。注意睾丸数量与 PBS 体积的比例可能需要调整：液体过多会导致压片时细胞无法充分铺展，而液体过少则会导致压片时细胞破裂。可选：在步骤 3.2 中使用硅化处理的盖玻片，以尽量减少组织与盖玻片的黏附。
  2. 用一对镊子在适当位置撕开每个睾丸，以最大程度地使目标生殖细胞类型保留在制片中（注意在压片过程中，睾丸内容物主要从撕裂区域溢出至载玻片上）。若要富集精原细胞和初级精母细胞，应在睾丸顶端附近撕开（1 级，图 2B）；若要富集初级精母细胞和精子细胞，应在略偏基部的位置撕开（2 级，图 2B）；若要富集更成熟的生殖细胞，则应在靠近曲率起始处撕开（3 级，图 2B）。
  3. 将一块玻璃载玻片轻轻覆盖在盖玻片上，以压碎睾丸组织；切勿手动施加压力，仅靠载玻片自身的重量即可获得合适的压片效果。应尽量避免产生气泡。可选：在步骤 3.2 中使用聚-L-赖氨酸包被的载玻片，以促进组织与载玻片的黏附。
  4. 制备完成后应立即使用（理想情况下在制备后 15 分钟内），通过相差显微镜观察活细胞；对于睾丸中表达荧光标记蛋白的转基因果蝇，可在本步骤通过荧光显微镜观察活细胞。或者，可继续进行固定和抗体染色（方案 3）。
  5. 用擦拭纸轻轻吸去盖玻片下多余的液体，使样本展平，直至生殖细胞清晰聚焦。

3. 甲醛固定与抗体染色

  1. 使用金属镊子夹住载玻片（来自方案2的压碎睾丸样本），将其短暂浸入液氮中（直至液氮停止沸腾），进行速冻处理。
  2. 立即使用刀片移除盖玻片。
  3. 使用金属镊子将载玻片转移至装有预冷的冰乙醇（95%，分光光度级，无甲醇）的玻璃载玻片架中，于 -20 °C 下保存 10 分钟。
  4. 使用金属镊子将载玻片转移至盛有含0.1% Triton X-100的4%多聚甲醛PBS溶液（PBS-T）的玻璃载玻片架中，室温下孵育7分钟。
  5. 使用金属镊子将载玻片转移至盛有 PBS 的玻璃载玻片架中。在室温下用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟，重复 1 次。每次洗涤均通过弃去玻璃载玻片架中的溶液完成即通过倾倒去除并更换为新鲜溶液。
  6. 弃去 PBS，将切片浸入 PBS-T 中，在室温下孵育 30 分钟，以通透细胞膜。
  7. 室温下用 PBS 清洗载玻片 5 分钟，重复 2 次。
  8. 封闭步骤（可选）：将切片浸入含1% BSA的PBS中，室温孵育45分钟。
  9. 使用疏水屏障笔在载玻片上围绕压碎的组织（肉眼清晰可见）画一个圆圈，以限制后续步骤3.9和3.11中添加的抗体溶液。在进行免疫染色过程中，应始终保持组织湿润。
  10. 加入30–40 ml一抗（用PBS-T按1:400至1:50稀释，具体比例取决于抗体种类）至画线区域内的组织中。若已进行封闭步骤，则将一抗用含1% BSA的PBS-T稀释。抗γ-微管蛋白抗体（用于中心粒的染色） 图4) 按1:100稀释。置于湿润、避光的孵育盒中孵育（例如在室温下放置2小时，或在4°C下过夜，置于带有湿润纸巾的密闭塑料盒中。
  11. 室温下用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共 3 次。若进行了封闭步骤，则先用 PBS-T 洗涤两次，再用 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟，室温。
  12. 加入30-40 ml荧光标记的二抗（用PBS按1:400稀释），避光室温孵育1-2小时。
  13. 室温下用 PBS 清洗载玻片 5 分钟，重复 2 次。
  14. 在圆圈内的组织中加入30-40 ml DAPI溶液（0.2 mg/ml，溶于PBS）。
  15. 轻轻将盖玻片覆盖在组织上，注意避免产生气泡。若出现气泡，应小心移动盖玻片，但不得破坏压片，直至气泡从盖玻片边缘逸出。
  16. 使用清洁湿巾轻轻吸去载玻片边缘多余的 DAPI。
  17. 使用透明指甲油将盖玻片封固在载玻片上。
  18. 在接下来的3-4小时内使用此样本，通过荧光显微镜观察免疫染色细胞。如需长期保存载玻片（至少可保存数周），请使用含DAPI的甘油基封片介质，并将载玻片置于-20 ˚C保存。
  19. 或者，根据抗原的不同，可用甲醇替代甲醛固定样品。完成第3.2步的整个实验流程后，将压片睾丸的载玻片浸入甲醇中，在-20 °C下处理10分钟，随后继续从第3.5步开始后续操作。

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结果

一对正确解剖的Drosophila雄性生殖器官示例见图2A。从成年雄蝇腹部取出的睾丸通常通过一对精囊（蓝色，图2A'）与射精管（棕色，图2A'）和一对附属腺（绿色，图2A'）相连。为了将睾丸与大部分伴随的体细胞组织分离，应去除并弃去射精管和附属腺，仅保留睾丸对和精囊（图2B和2B'）。精囊也可进一步去除，仅保留睾丸对用于后续处理。

选择用于睾丸解剖的成年雄性果蝇的年龄是一个重要的考虑因素。在年轻的雄性果蝇中（羽化后0-2天），精囊较小且几乎为空，而睾丸处于最大直径状态（如图2所示）。使用较年轻的雄性可确保获得相对较多的正在分裂的生殖细胞（正在进行有丝分裂或减数分裂）以及早期的减数分裂后精子细胞。当使用较年长的雄性果蝇（羽化后3-5天）进行解剖时（图像未显示），精囊更为明显，因其充满精子而膨胀，且睾丸比年轻雄性更细。如果实验目标是观...

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讨论

尽管野生型果蝇的睾丸因其黄色而易于识别（与之相邻的组织为白色），但突变型果蝇的睾丸 白色 突变果蝇呈白色，因此有时可能与肠道组织混淆。大多数转基因品系通常处于 白色 背景，也因微型-白色 基因发现于 P-元素不会促进睾丸中的色素积累。当 果蝇 睾丸无法通过颜色区分，其他易于识别的特征包括其螺旋状排列以及成对出现。12注意，一些研究人员发现使用解剖针比使用镊子更容易分离睾丸12.

该方案的关键步骤是制备压碎的睾丸组织。一种有效的方法是将载玻片悬于含有睾丸组织的盖玻片上方几毫米处，使盖玻片上 PBS 的表面张力将含有组织的盖玻片向上拉向载玻片。这种方法通常可破坏精原囊并使细胞在载玻片上充分分散，非常适合对单个细胞进行成像。 alternatively，若需保留完整或部分精原囊用于成像，可增加加在盖玻片上的 PBS 体积（从 4–5 µL 增至 7–8 µL）。

如果某种特定的 Drosoph...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Michael Anderson 在 Lee 实验室建立了这些研究精子发生的方法，并感谢 Karen Hales 提供的专业建议。H. Oda 和 Y. Akiyama-Oda 慷慨提供了表达 γ-微管蛋白-GFP 的果蝇品系。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01 基金（GM074044）资助，项目负责人为 L.A.L.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184用于将Kimax培养皿制成硅胶包被解剖皿的双组分硅酮弹性体
PAP笔Fisher ScientificNC9888126Ted Pella #22309
透明指甲保护剂Wet n Wild7780235001
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36931
小鼠抗γ-微管蛋白抗体（克隆GTU-88）Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure山羊抗小鼠IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
乙醇Fisher ScientificAC61511-0040
甲醇Fisher ScientificA412-4
16% 甲醛Thermo Fisher Scientific28908
SigmacoteSigma-AldrichSL2按照生产商说明用于硅化盖玻片
DAPISigma-AldrichD-9542溶于75%乙醇，浓度为0.5 mg/ml；保存于-20 °C
NaClResearch Products International Corp.S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Kimwipes精细任务擦拭纸Fisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075分子生物学级
带螺旋盖的玻璃Coplin染色缸Electron Microscopy Sciences70315
单面磨砂载玻片Corning2948-75X25
聚-L-赖氨酸包被载玻片Polysciences, Inc.22247-1可选（用于替代未处理载玻片）
方形盖玻片Corning2865-22
刀片Fisher Scientific12-640
Kimax培养皿Fisher ScientificS31473Kimble #23060 10015 EMD
镊子Dumont52100-51S5型INOX
Stemi 2000-CS体视显微镜Carl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40X物镜Nikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X物镜Carl Zeiss

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