心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

摘要

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。

摘要

既往研究表明，细胞递送可通过释放细胞因子和多种因子，促进心脏组织的血管重建并提高细胞存活率，从而改善心脏功能。此外，进一步观察发现，某些特定干细胞（如心脏干细胞、间充质干细胞和心球细胞）能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，进而整合到周围心肌组织中。

本文介绍了将非收缩性细胞可靠地递送至免疫缺陷小鼠左心室壁所需的材料与方法。该显微外科手术的关键步骤包括麻醉与镇痛剂注射、气管内插管、切开胸腔以暴露心脏，以及使用无菌30号针头和精密微升注射器将细胞注入心室壁。

组织处理包括心脏采集、包埋、切片和组织学染色，结果显示心肌内细胞注射在心外膜区域以及心室壁均造成轻微损伤。非收缩性细胞保留在免疫缺陷小鼠的心肌壁内，并被一层纤维化组织所包绕，可能起到抵御心脏压力和机械负荷的保护作用。

引言

已针对心血管疾病的小鼠和大鼠模型测试了多种细胞递送方案，旨在将该实验性操作在人类患者中的效率、有效性和安全性进行转化。在小型啮齿类动物心脏中，心肌内细胞递送是最可行的递送方法^1,2，而在大鼠心脏中，也可采用顺行³和逆行⁴冠状动脉内细胞灌注。这两种方法各有局限性与优势。通过冠状动脉途径递送细胞在促进细胞广泛分布方面理论上优于直接肌内注射³，但也存在引发冠状动脉栓塞的风险^3,5。心肌内递送的局限性则与机械性损伤、急性炎症及心肌损伤相关^6,7。在人类中，用于心脏修复的细胞可通过经心内膜或外科心外膜途径进行心肌内注射，或通过冠状动脉内途径递送⁸。经血管途径注射适用于急性梗死且心肌已再灌注的患者，但在病变区域血管完全闭塞或血流较差的情况下可能无法实施⁹。通过经心内膜或经心外膜途径直接向心室壁注射在技术上是否可行，取决于患者的健康状况。事实上，已有研究表明该技术是安全的^10,11，尽管经心外膜注射需要开胸手术，而经心内膜途径则需要对每位患者进行电生理标测，以区分存活的缺血心肌与瘢痕心肌区域⁹。

重要的是，在细胞治疗研究中，最适合移植的细胞类型仍有待确定。短期分析（4周）显示，注射定义为心脏球体（cardiospheres）的心脏干细胞¹² 或骨髓中的侧群细胞¹³ 诱导小鼠心脏功能恢复¹⁴ 和大鼠¹⁵ 通过减少瘢痕面积和细胞死亡来建立心肌梗死模型。在未使用免疫抑制的大鼠心肌梗死模型中进行同种异体心球细胞移植被证实是安全的，可促进心脏再生，并通过激活内源性修复机制改善心脏功能。¹⁵心脏中的 Lin-/c-kit+ 成体前体细胞具有自我更新、克隆形成和多向分化潜能 体外 和 体内，并在注射到缺血性大鼠心脏后重建了受损心肌壁的大部分区域¹⁶ 并具有形成导电性及中等大小冠状动脉的能力¹⁷这些有前景的数据推动了在人体中开展的 I 期和 II 期临床试验：自体与异体间充质干细胞（MSC）注射¹⁸，心脏球体¹⁹，或缺血性人心脏中的c-Kit阳性心脏干细胞（CSC）20在长期研究中均显示出对心脏功能的有益作用。然而，广泛的长期随访和回顾性荟萃分析表明，干细胞治疗对部分患者具有显著益处，但对其他患者则效果不一，结果存在不可预测的差异²¹这些局限性可能需要针对每位个体和每种疾病设计特定的细胞递送方案。

在小鼠和大鼠模型中，长期研究显示，细胞注射并未进一步改善心脏功能（12个月）。事实上，人胚胎干细胞来源的心肌细胞（hESC-CM）移植物大多被一层纤维化组织与宿主心肌隔离^22,23。在将骨骼肌成肌细胞移植至心肌梗死小鼠心脏后，也观察到了类似结果²⁴。此外，同种异体间充质干细胞（MSCs）在梗死心脏中长期维持功能的能力，因其分化后由免疫豁免状态转变为免疫原性状态而受到限制²⁵。

考虑到上述挑战与前景，本文展示了如何通过心肌内注射在小鼠体内递送细胞。我们观察到，不具有心肌细胞收缩特性的细胞与宿主心肌组织无连接，而是形成一个具有薄层纤维化屏障的凝聚团块。尽管在某些情况下这种结果可能具有优势，但以下分析可能有助于理解如何调控细胞植入，以生成功能上相互连接的心肌结构。

方案

所有动物实验均依照国际（欧洲议会2010/63/EU指令）和国家（英国政府内政部1986年法案）法规进行。本文所述操作程序属于我们在英国许可机构授权下的工作计划内容，未以记录为目的而单独实施。

1. 细胞的制备

本方案以人胚胎肾细胞（HEK293细胞）为例，说明特定细胞系的制备过程。对于多能干细胞或成体干细胞向特定细胞谱系的培养与最终分化，必须采用针对具体细胞类型的实验方案。

1. 在含有1%丙酮酸钠、2 mM谷氨酰胺、1%抗生素（青霉素/链霉素）和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（高糖，4,500 mg/L）中培养细胞。通常每两天更换新鲜培养基，一个10 cm培养皿按1:3比例传代。
2. 用胰蛋白酶轻柔处理细胞1次 ，并按照1:1比例在DMEM培养基中重悬。
3. 使用血细胞计数板计数细胞，并将3 × 10⁶个细胞收集至另一离心管中。
4. 在摆桶转子中以100 ×g离心5分钟。
5. 弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀2次。
6. 将细胞重悬于PBS 1× 中，浓度为10⁶个细胞/50 µL，用于注射至免疫缺陷小鼠的左心室。

2. 术前条件

1. 每次手术前，在温度受控的隔离器（22 °C；表1）中使用无菌饲料和水饲养免疫缺陷小鼠（NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD）。
2. 在层流罩下进行免疫缺陷小鼠的手术操作。使用70%乙醇清洁工作区域，并对手术器械（镊子和剪刀）进行高压灭菌处理。
3. 开启用于手术和术后恢复的加热垫。 加热垫对于防止手术期间及术后体温下降至关重要。
4. 将一个洁净且已高压灭菌的笼子放置在恢复用加热垫上。
5. 将小鼠连同其原始笼子一起，装入无菌高压灭菌袋中，从隔离器转移至手术室。
6. 称量小鼠体重，并根据体重皮下注射（s.c.）含有美托咪定 和盐酸氯胺酮 的溶液，该溶液用0.9% 无菌生理盐水稀释，用于麻醉小鼠并松弛肌肉（美托咪定 1 mg/kg；盐酸氯胺酮 75 mg/kg）。
7. 当小鼠完全麻醉后（约1–2分钟内，刺激后无足趾回缩反射），将其从笼中取出。
8. 在小鼠胸部左侧和喉部区域涂抹脱毛膏。经过适当时间（约2–5分钟）后，用湿润的纸巾擦去松动的毛发。
9. 将小鼠仰卧位放置于手术板上。从术者视角看，小鼠呈垂直方向，尾部朝下，头部朝上。
10. 将镇痛溶液（布托啡诺）以0.1–0.2 μg/g的剂量溶于无菌生理盐水中，皮下注射至后肢，并使用棉签蘸取无菌碘伏 溶液覆盖已剃毛的区域。
11. 将显微镜（2.5X物镜）对焦于喉部区域。

3. 手术条件

1. 使用钝头剪刀在环状软骨下方稍低处沿腹侧正中线做一长约0.5–1 cm的皮肤切口。分离皮肤与结缔组织，以暴露唾液腺。
2. 用镊子和磁性胸腔牵开器同时向两侧牵拉唾液腺的自然中线分界，将其分开，并暴露气管。
3. 轻轻将舌头拉向一侧以暴露喉部。小心地将插管插入气管。插管尖端应通过可见的喉部和气管清晰可见。重要的是，如果插管已进入但不清晰可见，则可能已进入食管。此时应将其取出并调整插管尖端的位置。
4. 将管路连接至呼吸机。设定潮气量为 200 μl 并 150 次/分钟。用胶带将通气管固定在手术面板上。
5. 使用钝头剪刀和镊子，在左侧胸部区域沿头尾方向做一条1至1.5厘米长的皮肤切口。
6. 在不进行切口的情况下，将皮肤从结缔组织/肌肉层以及胸大肌和胸小肌上松解分离。
7. 在第三和第四肋骨之间进行开胸手术，步骤如下：
   1. 用小型圆头镊子夹捏并刮擦以穿通肋间肌层。
   2. 一旦穿透肋间肌层，即放置胸腔牵开器以最大程度打开胸腔。此时可见左心室（LV）的上部和中部及其上方的耳廓（心房）。
8. 用细胞制备一支精密注射器，该注射器应能每次注射10 μl体积的液体。在注射器尖端安装一支30 G针头。
9. 用胶带将一个小的塑料套管（来自 Introcan-W 20 G）固定在针头上，仅暴露包括针尖开口在内的 1 mm 部分。这样可以防止针头穿透整个左心室壁，将细胞注入左心室腔内。
10. 在5倍物镜的帮助下，以该放大倍数观察左心室，并在左心室壁的5个不同位置注射细胞（每次注射10 μl，共注射106个细胞）。若注射成功，可见局部出现白色区域，且无明显细胞反流；若注射失败，则该动物将被排除于功能分析之外。
11. 移除牵开器。用两针6-0丝线缝合封闭两侧分离的肋骨，关闭胸壁。
12. 用浸有1× PBS的棉签湿润胸肌和皮肤 用镊子将肌肉轻柔地放回原位。
13. 用6-0丝线缝合3-4针关闭皮肤。喉部切口用2-3针缝合皮肤。
14. 注射阿替美唑 （终浓度为1 mg/kg）以逆转麻醉作用。
15. 一旦小鼠开始自主呼吸，立即从气管中取出导管，并将小鼠置于右侧卧位。小鼠预计在数分钟内恢复。
16. 当小鼠开始转身并行走时，将其放入温暖的恢复笼中（小型独立通气笼具，带封闭式滤膜盖），静置1小时。
17. 将动物置于可控温的加热箱中过夜（37 °C）。
18. 将水和颗粒饲料加入培养皿中 术后前两天支持恢复。

4. 术后分析

对10个注射了细胞的心脏和10个未注射细胞的对照心脏进行如下组织学分析：

1. 注射后1周对移植细胞进行分析（图1 和 3).
   1. 用异氟烷过量实施安乐死后，用 20 ml 的 4% 多聚甲醛（PFA）灌注心脏以固定组织。将固定后的组织依次浸入浓度递增的乙醇（70–100%）中脱水，并包埋于石蜡块中。
   2. 使用切片机将心脏组织在石蜡中切片至5 μm厚度，并用苏木精和伊红染色以进行形态学分析。
   3. 使用马松三色染色法观察结缔组织。
   4. 在载玻片扫描显微镜下分析图像（图1A、2A， 3A, 3B, 和 3C）并使用数字切片扫描显微镜以短轴视角观察整个心脏图1B 和 1C).
2. 在上述分析后，将心脏组织置于二甲苯中脱蜡，并通过将样本浸入水中进行再水化 按乙醇浓度递减的顺序（从100%至水）进行脱水，并进行扫描电子显微镜（SEM）制样处理 如下所示：
   1. 将脱蜡的组织块在0.1 M磷酸盐缓冲液中含1%单宁酸的溶液中孵育1小时。
   2. 使用递增浓度的乙醇（从25%至100%）对样本进行脱水。
   3. 使用HMDS（六甲基二硅氮烷）干燥样品。
   4. 使用Acheson Silver Dag将样本固定在样品台（Stubbs）上，并用金-钯进行镀膜。
   5. 在分析型扫描电子显微镜中观察样品图2B).

结果

我们注射了HEK293细胞，这些细胞因其与心肌细胞不同的形态而易于区分（图1），呈鹅卵石状，而心肌细胞则呈细长形（图1A）。与心肌细胞（粉红色）相比，HEK293细胞对苏木精染料（蓝色）的反应更强，这可能是由于其细胞核含量更高所致（图1A）。为了进一步区分注射的细胞与宿主组织，我们在注射前2小时用DAPI对HEK293细胞进行标记。标记后的细胞在心肌组织中清晰可见，如图1E所示。对照假手术小鼠的心脏整体未显示任何损伤（图1C），组织完整性良好（图1D）。

在心脏的短轴整体切面图中，注射的细胞在注射区域呈现为均一的细胞团（图1B）。该细胞团周围包绕着一层薄薄的纤维化组织，在三色染色中表现为蓝色区域（图2A）。扫描电子显微镜显示，这些细胞未与宿主心肌组织相连（图2B），这可能与其无收缩...

讨论

在本研究中，我们展示了如何在小鼠心脏中进行心肌内细胞注射。作为该方法的验证，我们使用了HEK293细胞。需要特别强调的是，HEK293细胞并未用于任何细胞治疗研究，因此本研究的结果不适用于直接转化为治疗策略。然而，由于HEK293细胞不具备收缩功能，且不会转分化为其他细胞类型，这使得研究能够更加聚焦于技术层面，例如待递送细胞的特性以及递送途径。

据报道，心肌内注射途径 tends to 导致细胞簇嵌入心肌组织^24,26，而冠状动脉内注射途径则可在损伤部位实现更均匀的分布。对于心肌细胞替代而言，理想的供体细胞应具备心肌细胞的电生理、结构和收缩特性，并能够从结构和功能上整合到宿主组织中，这表明在移植前有必要采用细胞分化程序。

成功手术的关键要点可总结如下：

1. 使用注射类化合物麻醉小鼠，以减缓心率并便于细胞注射。
2. 对小鼠进行气管插管，以维持肺部功能。
3. 进行开胸手术时避免切割肌肉，以保持胸肌功能，确保呼吸正常。
4. 暴露心脏后，在显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
隔离器	Pfi 系统		需要引用来源
加热垫	兽医技术解决方案	HE006	适用于小型动物
美托咪啶	国家兽医服务		需兽医处方
盐酸氯胺酮	国家兽医服务		需兽医处方
阿替美唑	国家兽医服务		需兽医处方
脱毛膏	商业商店
布托啡诺	NVS		需兽医处方
Leica MZFLIII 显微镜	Leica	型号 S6E	配备摆臂支架 TS0
Hamamatsu Nanozoomer 数字切片扫描仪	Hamamatsu	RS 系列
扫描电子显微镜	Jeol	JSM-6610
钝头剪刀	FST	14084-09
Minivent 呼吸机	Harvard Apparatus	73-0043	包含小型 Y 型接头 (73-0027) 和插管套管 (73-2844)
镊子	FST	11052-10
牵开系统	FST	18200-20	适用于体重不超过 200 g 的动物的套件
30 G 12 mm；½ 英寸	BBraun	A210	细黄色
微升注射器	ESSLAB	81201	另包含 Hamilton 重复分配器 PB 600-1，目录号 83700
6-0 丝线缝合线	Ethicon	W1614T