可通过盲肠结扎穿刺（CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症。目前评估自噬的方案 体内 在此介绍了在CLP诱导的脓毒症背景下使用的两种方法：一种是利用(GFP)-LC3小鼠检测自噬的方案，另一种是通过透射电子显微镜检测自噬体形成的方案。
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摘要
摘要
可通过盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症，该方法可引发多微生物性脓毒症。本文提供了一种利用CLP技术在小鼠中诱导不同严重程度脓毒症的实验方案。自噬是组织应对应激和病原体侵袭的基本反应。目前有两种用于评估自噬的实验方案 体内 在实验性脓毒症背景下，本文还介绍了以下研究方法。（I）将表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3融合蛋白的转基因小鼠进行CLP处理。通过免疫组织化学或共聚焦显微镜检测，GFP信号（点状结构）的局部增强可用于检测自噬体形成的增加，从而反映自噬通路的激活状态改变。（II）利用透射电子显微镜可定量单位组织面积内自噬性空泡（自噬体）的形成数量（作为自噬激活的标志）。研究脓毒症中自噬反应对于理解组织应对感染的机制至关重要。该领域的研究成果最终可能有助于阐明脓毒症的发病机制，而脓毒症是重症医学中的一个重大难题。
引言
脓毒症是一种由感染引发的全身性炎症反应，是危重患者死亡的主要原因之一1。腹腔内感染常导致多微生物性脓毒症，占所有脓毒症病例的20%，其病死率高达60%2。脓毒症相关死亡主要源于多器官功能障碍继而发展为器官衰竭3,4。迫切需要进一步研究该疾病的致病机制，以推动新型且更有效治疗方法的开发。
盲肠结扎穿刺（CLP）法是一种常用于建立脓毒症体内模型的实验方法。由于盲肠富含细菌，对其进行穿刺可导致多微生物性腹膜炎、细菌入血（菌血症）、感染性休克、多器官功能障碍，最终导致死亡5。目前普遍认为，与既往技术（如向啮齿类动物注射内毒素或纯化细菌）相比，CLP 更能准确反映临床实际情况。因此，CLP 被视为实验性诱导脓毒症并进而研究其发病机制的金标准（尽管该方法也存在局限性）6。在本专著中，我们描述了旨在评估脓毒症的致病机制是否涉及自噬的实验方案。
自噬是一种在进化上保守的细胞过程，可促进受损蛋白质和细胞器（如线粒体）的更新，并在清除包括细菌在内的细胞内病原体方面发挥重要作用7,8。在自噬过程中，细胞质中的蛋白质或细胞器被包裹进双层膜结构的囊泡（称为自噬体），随后被递送至溶酶体进行降解9。目前已鉴定出多种蛋白，它们是最初在酵母中发现的自噬相关基因（Atg）的哺乳动物同源物....
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方案
注意： 布莱根妇女医院/哈佛医学院地区的机构动物护理和使用委员会已批准以下实验程序。
1. 盲肠结扎穿刺
使用相同遗传背景（C57Bl/6）的雄性小鼠，8-10周龄。雌性小鼠对脓毒症诱导的致死性抵抗力强于雄性。在盲肠结扎穿刺（CLP）后的生存率方面，8周龄以上小鼠的结果比年轻小鼠更稳定。每组比较组用于生存分析的小鼠数量应约为 N=10。自噬检测则 N=3-5 只小鼠即可满足要求。
- 使用无菌的小型外科手术器械（即手术刀、剪刀和钝头解剖镊），应适用于啮齿类动物手术。
- 制备麻醉混合液：向7.95 ml PBS中加入150 μl 赛拉嗪（AnaSed注射液） 100 mg/ml）和 700 μl 氯胺酮（Ketaset） CIII，100 mg/ml
- 为确保操作过程中无菌，需佩戴手套、口罩和手术服。
- 称重动物。通过腹腔注射麻醉动物（i.p.）步骤3中提到的混合物，以μl为剂量 （剂量为体重克数的10倍，单位为μl）。例如，对于体重为22 g的小鼠，给予10×22 = 220 μl麻醉混合液。因此，赛拉嗪和氯胺酮的最终剂量分别为17 mg/kg和80 mg/kg体重。确保麻醉充分；夹捏脚趾时不应引起肢体屈曲反应。
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结果
在由CLP诱导的脓毒症发生后6小时，小鼠体内即可出现菌血症14。脓毒症的临床表现（包括寒战、呼吸急促和运动活动能力受损）大约在手术后12小时出现。接受CLP处理的小鼠通常在腹膜炎诱导后约18小时开始死亡。脓毒症越严重，死亡率越高15。具体而言，重度脓毒症在2至3天内导致100%的死亡率，而中度脓毒症在CLP术后7天时导致约60%的死亡率（超过此时间后不再预期有死亡）（图1）。相比之下，假手术小鼠的死亡率应为零
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讨论
CLP 的主要优势在于允许研究人员研究不同严重程度的脓毒症即 从低级到中级和高级）。诱导性脓毒症的严重程度受结扎盲肠长度（最重要的决定因素）、穿刺所用针头的大小以及穿刺孔数量的影响。15此外，小鼠品系和性别会影响脓毒症的严重程度；某些品系比其他品系更易感，且雄性通常比雌性更易感19,20上述因素 综上所述 确定CLP诱导的死亡率。
根据我们的经验，不同研究人员在实施 CLP 所致死亡率方面存在差异。例如，Rittirsch et al. 采用 50% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺（两个孔）的方法，实现了 60% 的死亡率15；而我们研究组的一位研究人员需要采用稍更严重的模型（60% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺）才能达到相同的死亡率；相比之下，我们研究组另一位研究人员使用更严重的模型（接近 100% 结扎、19 G 针、1 次“穿通”穿刺）却仅获得了较低的死亡率（仅为 25%）。鉴于上述情况，可以认为，CLP 严重程度（i........
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披露
作者声明无竞争性财务利益
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 P01 HL108801、R01-HL60234、R01-HL55330、R01-HL079904 对 A. M. K. Choi 的资助。S. Ryter 获得了洛夫莱斯呼吸系统研究所的薪金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GFP-LC3 转基因小鼠 | Riken (日本) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| 赛拉嗪 | Henry-Schein | 568-0606 | 盐酸赛拉嗪注射液（兽用） |
| 氯胺酮 | Henry-Schein | 995-2949 | 凯他赛注射液 100 mg/ml |
| 乙醇 | Fisher | A405-20 | 组织学级 |
| 乙醇 | Fisher | A407-1 | 用于消毒 |
| 6-0 丝线外科缝合线 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| 盐酸丁丙诺啡 | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex 安瓿 |
| 多聚甲醛（37%）溶液 | JT Baker | S898-09 | |
| 二甲苯 | Fisher | X3P-1GAL | |
| 抗 GFP 单克隆抗体 | Life Technologies | G10362 | |
| 霍伊歇特染料 | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT 包埋剂 | VWR 科学 | 25608-930 | |
| 苏丹黑 | Santa Cruz | sc-203760 | |
| 电子显微镜级戊二醛（2.5% 溶于二甲胂酸钠缓冲液） | Electron Microscopy Sciences | 15960 | |
| 环氧丙烷 | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 树脂 | Agar Scientific | R1045 | |
| 十二烯基琥珀酸酐 | Sigma | 46346 | |
| 甲基内次甲基邻苯二甲酸酐 | Sigma | 45359 | |
| N-苄基二甲胺 | Sigma | 185582 |
参考文献
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A.
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重印与许可
