可通过盲肠结扎穿刺（CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症。目前评估自噬的方案 体内 在此介绍了在CLP诱导的脓毒症背景下使用的两种方法：一种是利用(GFP)-LC3小鼠检测自噬的方案，另一种是通过透射电子显微镜检测自噬体形成的方案。
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摘要
摘要
可通过盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）法在小鼠中诱导实验性脓毒症，该方法可引发多微生物性脓毒症。本文提供了一种利用CLP技术在小鼠中诱导不同严重程度脓毒症的实验方案。自噬是组织应对应激和病原体侵袭的基本反应。目前有两种用于评估自噬的实验方案 体内 在实验性脓毒症背景下，本文还介绍了以下研究方法。（I）将表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3融合蛋白的转基因小鼠进行CLP处理。通过免疫组织化学或共聚焦显微镜检测，GFP信号（点状结构）的局部增强可用于检测自噬体形成的增加，从而反映自噬通路的激活状态改变。（II）利用透射电子显微镜可定量单位组织面积内自噬性空泡（自噬体）的形成数量（作为自噬激活的标志）。研究脓毒症中自噬反应对于理解组织应对感染的机制至关重要。该领域的研究成果最终可能有助于阐明脓毒症的发病机制，而脓毒症是重症医学中的一个重大难题。
引言
脓毒症是一种由感染引发的全身性炎症反应，是危重患者死亡的主要原因之一1。腹腔内感染常导致多微生物性脓毒症，占所有脓毒症病例的20%，其病死率高达60%2。脓毒症相关死亡主要源于多器官功能障碍继而发展为器官衰竭3,4。迫切需要进一步研究该疾病的致病机制，以推动新型且更有效治疗方法的开发。
盲肠结扎穿刺（CLP）法是一种常用于建立脓毒症体内模型的实验方法。由于盲肠富含细菌，对其进行穿刺可导致多微生物性腹膜炎、细菌入血（菌血症）、感染性休克、多器官功能障碍，最终导致死亡5。目前普遍认为，与既往技术（如向啮齿类动物注射内毒素或纯化细菌）相比，CLP 更能准确反映临床实际情况。因此，CLP 被视为实验性诱导脓毒症并进而研究其发病机制的金标准（尽管该方法也存在局限性）6。在本专著中，我们描述了旨在评估脓毒症的致病机制是否涉及自噬的实验方案。
自噬是一种在进化上保守的细胞过程，可促进受损蛋白质和细胞器（如线粒体）的更新，并在清除包括细菌在内的细胞内病原体方面发挥重要作用7,8。在自噬过程中，细胞质中的蛋白质或细胞器被包裹进双层膜结构的囊泡（称为自噬体），随后被递送至溶酶体进行降解9。目前已鉴定出多种蛋白，它们是最初在酵母中发现的自噬相关基因（Atg）的哺乳动物同源物，可调控自噬过程。微管相关蛋白1轻链3B（LC3B，Atg8的同源物）从LC3B-I（游离形式）转化为LC3B-II（与磷脂酰乙醇胺共价结合的形式），是自噬体形成的关键步骤之一9。自噬功能障碍与衰老及多种人类疾病（如癌症和神经退行性疾病）相关10。此外，自噬还影响固有免疫和适应性免疫，例如抗原呈递、淋巴细胞发育以及免疫细胞的细胞因子分泌8。因此，自噬可能也在感染引发的全身性炎症反应（即 脓毒症）中发挥作用，这一推测是合理的。
迄今为止，已有多种方法被用于评估自噬在组织损伤中的作用 体内包括使用表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3 的小鼠 通过电子显微镜对组织中自噬体进行定量分析 （这两种方法在本专著中有详细描述）。其他方法还包括组织匀浆中自噬相关蛋白表达的定量，以及自噬流的分析（详见其他文献）。11-13本文综述的目的是提供当前用于评估自噬的实验方案 体内 在实验性脓毒症的背景下。
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方案
注意： 布莱根妇女医院/哈佛医学院地区的机构动物护理和使用委员会已批准以下实验程序。
1. 盲肠结扎穿刺
使用相同遗传背景（C57Bl/6）的雄性小鼠，8-10周龄。雌性小鼠对脓毒症诱导的致死性抵抗力强于雄性。在盲肠结扎穿刺（CLP）后的生存率方面，8周龄以上小鼠的结果比年轻小鼠更稳定。每组比较组用于生存分析的小鼠数量应约为 N=10。自噬检测则 N=3-5 只小鼠即可满足要求。
- 使用无菌的小型外科手术器械（即手术刀、剪刀和钝头解剖镊），应适用于啮齿类动物手术。
- 制备麻醉混合液：向7.95 ml PBS中加入150 μl 赛拉嗪（AnaSed注射液） 100 mg/ml）和 700 μl 氯胺酮（Ketaset） CIII，100 mg/ml
- 为确保操作过程中无菌，需佩戴手套、口罩和手术服。
- 称重动物。通过腹腔注射麻醉动物（i.p.）步骤3中提到的混合物，以μl为剂量 （剂量为体重克数的10倍，单位为μl）。例如，对于体重为22 g的小鼠，给予10×22 = 220 μl麻醉混合液。因此，赛拉嗪和氯胺酮的最终剂量分别为17 mg/kg和80 mg/kg体重。确保麻醉充分；夹捏脚趾时不应引起肢体屈曲反应。 注意：使用眼科用 涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。
- 将动物仰卧放置于清洁的工作台面上，尾巴和后肢朝向操作者。使用酒精（70% EtOH 溶液）对腹部皮肤进行消毒。 注意： 手术区域应完全剃毛，以避免毛发接触导致伤口污染。 此外，理想情况下，手术过程中应使用循环温水垫以维持麻醉小鼠的正常体温。
- 使用解剖刀，在中线左侧约1厘米处，平行于中线做一小的纵行皮肤切口。切勿穿透至腹腔。用小剪刀将初始切口向两端延伸。
- 识别腹肌并进行解剖以进入腹膜腔。
- 使用钝性解剖镊识别盲肠，并将其移出腹腔。注意避免损伤肠系膜血管（以免引起致死性出血）。
- 结扎盲肠的60%以建立中度脓毒症模型。结扎盲肠75%或以上通常导致重度脓毒症，而结扎25%或以下则导致轻度脓毒症。注意避免结扎回盲瓣，以免阻断肠道连续性。
- 通过使用21 用G号针在结扎处附近对盲肠进行一次贯穿穿刺（形成两个孔），穿刺方向应从盲肠的系膜侧至对系膜侧。注意避免穿刺到系膜血管。
- 移除针头。轻轻挤压结扎的盲肠，以确认两个孔的通畅性；仅应有少量粪便从孔中挤出。
- 将结扎并穿刺的盲肠移入腹腔。
注意： 对于假手术小鼠，跳过步骤 1.10–1.12。 - 使用6-0带切割针的丝线缝合腹肌层。使用6-0带切割针的丝线缝合腹部皮肤。
- 注射1 ml 预热（37 °C）生理盐水 i.p. 以补充手术过程中流失的热量和水分。将小鼠置于加热灯下直至其恢复意识。 注意： 理想情况下，可使用更安全的加热装置（如循环温水垫）替代加热灯。
- 术后注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重） 皮下以实现镇痛效果。 注意： 动物在恢复足够的意识以维持胸卧姿势之前，不得无人看管。接受过外科手术的动物在完全康复之前，不得放回与其他动物共同饲养的环境中。
- 将动物放回笼中，自由进食和饮水。当小鼠进入濒死状态（表现为被触碰时无法移动或出现发绀等临床症状）时实施安乐死。每4小时检查一次小鼠。 以避免它们在实施安乐死之前死亡。
2. 组织采集与固定
- 配制4%多聚甲醛（PFA）溶液：向889 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中加入111 ml 37%多聚甲醛。
- 使用高剂量CO2诱导麻醉或氯胺酮/赛拉嗪溶液处死小鼠。
- 将小鼠固定于洁净的操作台面上，用70%乙醇（EtOH）溶液喷洒腹部和胸部皮肤进行消毒。
- 使用手术刀和小剪刀去除腹部、胸部以及覆盖气管区域的皮肤。
- 清除气管周围的组织（肌肉和结缔组织），暴露气管。
- 在气管周围放置一根缝合线（不带切割针头），暂不收紧。
- 使用小型外周静脉导管（20 G）进行“气管插管”。插入导管时需小心，避免气管撕裂。注意气管最大直径位于环状软骨下方。
- 收紧气管及导管周围的缝合线，取出针头，仅将导管的塑料套管保留在气管内。针头仅作为引导钢丝用于插入塑料套管。
- 确认塑料套管已牢固固定于气管后，剪开腹壁肌肉，打开腹腔，暴露膈肌。
- 使用针头穿刺膈肌，造成气胸（i.e. 向胸膜腔内注入空气），使肺组织塌陷。
- 使用小剪刀切除膈肌，沿胸骨剪开（胸骨切开术），移除肋骨 cage，暴露心脏和肺脏。
- 通过插入气管内的塑料套管，在30 cm H2O压力下用甲醛溶液灌注固定肺组织。
- 取出肺组织，置于4% PFA溶液中固定24小时，随后转移至70%乙醇溶液中保存，直至后续处理。
- 识别并取出心脏、肝脏和肾脏，同样置于4% PFA溶液中固定24小时，随后转移至70%乙醇溶液中保存，直至后续处理。
3. GFP 小鼠及 GFP 切片观察
- 按照步骤1所述方法对GFP-LC3小鼠进行CLP及假手术，并按照方案中步骤2所述进行术后处理。
- 将组织（即肺、心脏、肝和肾）包埋于石蜡中，并连续切片至5 μm厚度。
- 准备进行GFP染色时，于60 °C孵育30–60分钟，直至石蜡完全融化且组织呈半透明状。
- 使用标准梯度的二甲苯或二甲苯替代物进行脱蜡：依次在二甲苯1、二甲苯2和二甲苯3中各孵育5分钟，随后在梯度乙醇（EtOH）中分别孵育3分钟：100%、95%、75%，最后用蒸馏水冲洗。
注意：脱蜡后应避免组织干燥，以防样本背景信号增强。 - 使用柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）进行抗原修复，微波处理10–20分钟。注意定期补充缓冲液，防止组织干燥。
- 将溶液置于室温下冷却20分钟，以完成抗原修复过程。
- 用PBS洗涤2–3次。去除多余缓冲液后，将载玻片从染色架转移至水平放置的染色盒或其他湿盒中，以防止干燥。
- 在室温下用含10%正常驴血清（也可使用5%牛血清白蛋白，或优先选用与二抗同源动物的血清）的PBS封闭45–60分钟。
- 在湿盒中，以PBS按1:100稀释GFP一抗，4 °C孵育过夜。轻轻覆盖小片Parafilm于组织表面，以促进抗体与组织均匀接触并防止蒸发。
注意：后续所有步骤均在室温下进行。 - 用PBS洗涤5次以去除未结合的一抗。随后加入二抗（PBS中1:500–1:1,000稀释），室温孵育1–2小时。
- 用PBS洗涤5次以去除未结合的二抗。如需，可在本步骤对切片进行复染。
- 若使用荧光二抗，需用含0.1%苏丹黑的70%乙醇溶液孵育15–20分钟以降低自发荧光。擦去组织周围多余的苏丹黑，并在20分钟内用PBS洗涤5次。
- 加盖玻片封片，并水平存放，直至封片剂完全固化。
4. 替代方案：GFP-LC3 的直接检测
- 用约 500 ml 的 50/50 v/v OCT 与 PBS 混合液灌注并充胀肺组织。
- 在冷冻模具底部加入少量 OCT，将组织包埋其中。
- 小心地将解剖好的肺组织复合体放入模具中。
- 将模具置于干冰预冷的甲基丁烷中缓慢冷冻。
- 继续添加 OCT，直至组织完全覆盖并完全冻结。保持在干冰上，并储存于 -80 °C。
- 使用冷冻切片机切取 5–10 μm 厚的切片，并避免切片暴露于光线下。将切片及剩余组织储存于 -80 °C。
- 准备成像用载玻片时，从冰箱中取出切片，立即滴加一滴 PBS 以防止干燥。
- 用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，随后用 PBS 洗涤。
- 加入 DAPI/Hoescht 染色 10 分钟，用 PBS 洗涤 3 次 。
- 用盖玻片封片，水平放置储存，直至封片剂完全凝固。
- 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行成像。 样品可在 4 °C 下保存长达一个月。
5. 透射电镜样品制备
- 将组织切成约 1 mm 的立方体用于固定。
- 用含 2% 甲醛和 2.5% 戊二醛的 0.1 M 马来酸钠缓冲液（pH 7.4）固定组织。
- 用 0.1 M 马来酸钠缓冲液洗涤 1–2 小时。
注意：固定后的组织可在 0.1 M 马来酸钠缓冲液中于 4 °C 保存。 - 在含 1% 四氧化锇的 0.2 M 马来酸钠缓冲液中后固定 1 小时。
- 用 0.2 M 马来酸钠缓冲液漂洗，每次 10 分钟，共 3 次。
- 用 70% 乙醇脱水，每次 20 分钟，重复 2 次；用 90% 乙醇脱水，每次 10 分钟，重复 2 次；用 100% 乙醇脱水，每次 20 分钟，重复 2 次。
- 用环氧丙烷（propylene oxide）孵育，每次 10 分钟，重复 2 次。
- 用环氧丙烷与环氧树脂混合液（50:50）孵育 1 小时。环氧树脂混合液组成为：24 g Agar 100 树脂、13 g 十二烯基琥珀酸酐、13 g 甲基纳迪克酸酐和 1 ml N-苄基二甲基胺。使用木制刮刀在一次性烧杯中充分混合。
- 在未加盖的小瓶中用环氧树脂孵育过夜（以使残留的环氧丙烷挥发）。
- 将组织包埋于标记好的胶囊中，使用新配制的树脂。在 60 °C 下聚合 48 小时。
- 使用透射电子显微镜在 80 或 60 kV 下将组织切片成像至电镜底片上。将图像打印至相纸或以数字介质形式保存。
- 在含有细胞核的完整细胞中分析自噬体形成情况。可使用低倍视野（e.g. 2,000–4,000X）识别有核细胞。通常使用 6,800–10,000X 的图像进行自噬体定量。从 15–30 个视野中统计单位面积内的自噬体数量，以获得适当的统计代表性。自噬体具有双层膜结构，晚期自噬体类似充满内容物的液泡。
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结果
在由CLP诱导的脓毒症发生后6小时，小鼠体内即可出现菌血症14。脓毒症的临床表现（包括寒战、呼吸急促和运动活动能力受损）大约在手术后12小时出现。接受CLP处理的小鼠通常在腹膜炎诱导后约18小时开始死亡。脓毒症越严重，死亡率越高15。具体而言，重度脓毒症在2至3天内导致100%的死亡率，而中度脓毒症在CLP术后7天时导致约60%的死亡率（超过此时间后不再预期有死亡）（图1）。相比之下，假手术小鼠的死亡率应为零
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讨论
CLP 的主要优势在于允许研究人员研究不同严重程度的脓毒症即 从低级到中级和高级）。诱导性脓毒症的严重程度受结扎盲肠长度（最重要的决定因素）、穿刺所用针头的大小以及穿刺孔数量的影响。15此外，小鼠品系和性别会影响脓毒症的严重程度；某些品系比其他品系更易感，且雄性通常比雌性更易感19,20上述因素 综上所述 确定CLP诱导的死亡率。
根据我们的经验，不同研究人员在实施 CLP 所致死亡率方面存在差异。例如，Rittirsch et al. 采用 50% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺（两个孔）的方法，实现了 60% 的死亡率15；而我们研究组的一位研究人员需要采用稍更严重的模型（60% 结扎、21 G 针、1 次“穿通”穿刺）才能达到相同的死亡率；相比之下，我们研究组另一位研究人员使用更严重的模型（接近 100% 结扎、19 G 针、1 次“穿通”穿刺）却仅获得了较低的死亡率（仅为 25%）。鉴于上述情况，可以认为，CLP 严重程度（i....
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披露
作者声明无竞争性财务利益
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 P01 HL108801、R01-HL60234、R01-HL55330、R01-HL079904 对 A. M. K. Choi 的资助。S. Ryter 获得了洛夫莱斯呼吸系统研究所的薪金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GFP-LC3 转基因小鼠 | Riken (日本) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| 赛拉嗪 | Henry-Schein | 568-0606 | 盐酸赛拉嗪注射液（兽用） |
| 氯胺酮 | Henry-Schein | 995-2949 | 凯他赛注射液 100 mg/ml |
| 乙醇 | Fisher | A405-20 | 组织学级 |
| 乙醇 | Fisher | A407-1 | 用于消毒 |
| 6-0 丝线外科缝合线 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| 盐酸丁丙诺啡 | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex 安瓿 |
| 多聚甲醛（37%）溶液 | JT Baker | S898-09 | |
| 二甲苯 | Fisher | X3P-1GAL | |
| 抗 GFP 单克隆抗体 | Life Technologies | G10362 | |
| 霍伊歇特染料 | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT 包埋剂 | VWR 科学 | 25608-930 | |
| 苏丹黑 | Santa Cruz | sc-203760 | |
| 电子显微镜级戊二醛（2.5% 溶于二甲胂酸钠缓冲液） | Electron Microscopy Sciences | 15960 | |
| 环氧丙烷 | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 树脂 | Agar Scientific | R1045 | |
| 十二烯基琥珀酸酐 | Sigma | 46346 | |
| 甲基内次甲基邻苯二甲酸酐 | Sigma | 45359 | |
| N-苄基二甲胺 | Sigma | 185582 |
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