冲击波在细胞培养中的应用

摘要

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。 体外 实验正受到越来越多的关注。因此，我们建立了一种模型 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）试验，使我们能够模拟 体内 条件，从而避免干扰性的物理效应。

摘要

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续损伤的情况下，对靶细胞或组织产生生物学刺激。因此， 体外 实验正受到越来越多的关注。已有多种将冲击波施加于细胞培养物的方法被报道。总体而言，所有现有模型均聚焦于如何将冲击波最优地施加到细胞上。

然而，仍有一个问题尚未解决：冲击波穿过细胞培养物后会发生什么？由于细胞培养基与周围空气的声阻抗差异极大，超过99%的冲击波会被反射！因此，我们开发了一种模型，主要由一个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的容器构成，使冲击波在穿过细胞培养物后能在水中继续传播。该设计可避免空化效应，同时防止冲击波反射，从而干扰后续波形。利用此模型，我们能够模拟 体内 条件，从而逐步深入了解冲击波的物理刺激如何转化为生物细胞信号（“机械转导”）").

引言

冲击波是由能量突然释放而产生的声压波，例如闪电时产生的雷声。在医学领域，冲击波已应用超过30年 ，用于体外冲击波碎石术（Lithotripsy）以粉碎肾结石。自20世纪80年代初偶然发现接受碎石术的患者髂骨增厚以来，研究人员首次开展了评估冲击波治疗（SWT）对骨愈合影响的研究¹。观察到冲击波治疗显著改善了长骨骨不连的愈合效果²。随后，其适应证被扩展至软组织创面³。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续组织损伤的情况下，对靶组织产生生物学刺激作用。冲击波可诱导促血管生成生长因子（例如 VEGF、PlGF、FGF）的释放，进而引发显著的血管生成。这促使冲击波治疗的适应证进一步扩展至缺血性疾病。我们课题组及其他研究团队已在动物模型和临床试验中证实了SWT对缺血性心脏病具有积极治疗作用^4-6。

然而，冲击波治疗（SWT）的物理刺激如何转化为生物信号（即机械转导）的具体机制仍 largely 未知。随着医学多个领域对 SWT 的兴趣持续增加，对其作用机制的探索也日益深入。因此， 在 体外 冲击波实验正变得越来越重要。除了减少动物实验和具有成本效益外，其最大的优势在于 在 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）可能为研究特定细胞类型的特异性行为提供可能性。在冲击波介导的组织再生过程中，很可能所有被治疗组织....

方案

伦理许可

在获得患者的书面知情同意后，从妇产科剖宫产手术中获取脐带，用于分离人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。该研究已获得因斯布鲁克医科大学伦理委员会的批准（编号：UN4435）。

1. 准备IVSWT水浴

1. 在合适的容器中准备 3.5 L 自来水。水需加热至 37 °C（参见方案 6）。
2. 将水注入水浴箱，直至水位距离边缘约 3 cm。注意确保水完全覆盖膜。这大约需要准备好的 3.5 L 水。
3. 将温度传感器连接至电源。
4. 将传感器插入水浴箱后壁的指定接口中。
5. 将加热装置连接至温度传感器的电源。切勿在水浴无水时进行此操作，否则加热器会熔化有机玻璃。
6. 等待水温达到稳定的 37 °C。定期用某种棒状物搅拌水，以确保水浴内温度均匀一致。

2. 准备细胞和培养瓶

1. 在T25培养瓶中以所需密度接种细胞，过夜培养；或直接在培养瓶中培养细胞，直至达到所需的汇合度。
2. 实验前，将培养瓶垂直放置。
3. 向培养瓶中加入培养基，液面加至瓶颈下方即可。切勿加入过多培养基，避免培养基接触瓶颈或封口帽导致污染。
4. 使用无滤膜的实心盖将培养瓶拧紧，以防止水污染。注意水浴中的水及水浴设备本身....

结果

采用所述方法，我们将冲击波作用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），这些细胞系此前从脐带中分离获得。脐带来源于择期剖宫产手术。

在T25细胞培养瓶中，当HUVECs细胞融合度达到90%时，使用电液冲击波治疗系统进行处理。治疗参数为能量流密度0.1 mJ/mm²，频率5 Hz。从冲击波源至细胞层距离为5 cm处施加300次脉冲。

通过实时PCR分析检测了Tie-2（含免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2）mRNA的基因表达。与对照组（CTR: 100.03±7.5）相比，Tie-2表达在冲击波治疗（SWT）后随时间显著上调（SWT后2小时：156.75±14.49；4小时：141.03±9.71；6小时：166.68±2.15；p<0.05）图5B。该血管生成素受体可直接提示内皮细胞增殖，并作为其血管生成能力的指标。作为阳性对照，我们使用了Poly (I:C)（聚肌苷酸-聚胞苷酸），其作为一种RNA结构类似物，已知可刺激内皮细胞（SWT后2小时：125.7±10........

讨论

所提出模型的重要性在于 体外 冲击波治疗的优势在于，与现有模型不同，声波在穿过细胞培养物后仍可继续传播，从而避免了张力等干扰性物理效应。该模型更接近于 体内 比其他直接将波应用于细胞培养瓶的方法具有更温和的条件。

另一个优势在于可以调节冲击波源与细胞之间的距离。如果直接处理培养瓶，则无法实现这一点。然而 体内 根据目标组织所处的深度，施加器与目标区域之间的距离存在一定差异。同时，可以研究细胞相对于波焦点处于特定位置时所受到的影响。

开展初步实验

根据我们对心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞的操作经验，每种细胞类型都需要其特定的治疗参数。因此，我们强烈建议在开展目标实验之前，先进行预试验以确定合适的处理参数。该预试验应包括冲击波施加器与样品之间的不同距离、不同的能量流密度，以及确定最适宜的脉冲次数。冲击波应用频率的问题仍存在争议——即使 体内. 一项用于治疗参数探索性试验的合适方案作为补充材料提供

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Orthogold 冲击波治疗仪	组织再生技术公司，伍德斯托克，佐治亚州 – 由德国康斯坦茨 MTS-Europe GmbH 公司生产
IVSWT 水浴锅 V2.0	约翰·霍亨内格 - 技术产品
EBM-2 基础培养基 500 mL + EGM-2 SingleQuot 添加剂 &和生长因子	Lonza	CC-3156 && CC-4176	该培养基用于图示实验中HUVECs的培养，以铺满细胞培养瓶。对于其他细胞类型，请使用推荐的培养基。
Pechiney Parafilm M PM996	佩秦尼塑料包装	PH-LF-PM996-EA 在 labplanet.com	用于密封烧瓶
Falcon 血清移液管 25 ml	Becton Dickinson 实验室耗材	357525
CellMate II 血清移液管	Matrix Technologies
Skintact 超声耦合凝胶	Skintact	UL-01 250 ml
T25 细胞培养瓶	COSTAR	3056
Mikrozid 消毒剂	施ülke
3.5 L 脱气水
纸巾