冲击波在细胞培养中的应用

摘要

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。 体外 实验正受到越来越多的关注。因此，我们建立了一种模型 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）试验，使我们能够模拟 体内 条件，从而避免干扰性的物理效应。

摘要

如今，冲击波因其再生效应而广为人知。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续损伤的情况下，对靶细胞或组织产生生物学刺激。因此， 体外 实验正受到越来越多的关注。已有多种将冲击波施加于细胞培养物的方法被报道。总体而言，所有现有模型均聚焦于如何将冲击波最优地施加到细胞上。

然而，仍有一个问题尚未解决：冲击波穿过细胞培养物后会发生什么？由于细胞培养基与周围空气的声阻抗差异极大，超过99%的冲击波会被反射！因此，我们开发了一种模型，主要由一个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的容器构成，使冲击波在穿过细胞培养物后能在水中继续传播。该设计可避免空化效应，同时防止冲击波反射，从而干扰后续波形。利用此模型，我们能够模拟 体内 条件，从而逐步深入了解冲击波的物理刺激如何转化为生物细胞信号（“机械转导”）").

引言

冲击波是由能量突然释放而产生的声压波，例如闪电时产生的雷声。在医学领域，冲击波已应用超过30年 ，用于体外冲击波碎石术（Lithotripsy）以粉碎肾结石。自20世纪80年代初偶然发现接受碎石术的患者髂骨增厚以来，研究人员首次开展了评估冲击波治疗（SWT）对骨愈合影响的研究¹。观察到冲击波治疗显著改善了长骨骨不连的愈合效果²。随后，其适应证被扩展至软组织创面³。基础研究结果表明，冲击波可在不造成后续组织损伤的情况下，对靶组织产生生物学刺激作用。冲击波可诱导促血管生成生长因子（例如 VEGF、PlGF、FGF）的释放，进而引发显著的血管生成。这促使冲击波治疗的适应证进一步扩展至缺血性疾病。我们课题组及其他研究团队已在动物模型和临床试验中证实了SWT对缺血性心脏病具有积极治疗作用^4-6。

然而，冲击波治疗（SWT）的物理刺激如何转化为生物信号（即机械转导）的具体机制仍 largely 未知。随着医学多个领域对 SWT 的兴趣持续增加，对其作用机制的探索也日益深入。因此， 在 体外 冲击波实验正变得越来越重要。除了减少动物实验和具有成本效益外，其最大的优势在于 在 体外 体外冲击波治疗（IVSWT）可能为研究特定细胞类型的特异性行为提供可能性。在冲击波介导的组织再生过程中，很可能所有被治疗组织中的细胞均参与其中，甚至存在系统性效应的讨论。然而，每种细胞类型均发挥特定作用并具有其固有的功能。IVSWT使我们能够识别这种特定功能，从而更深入地理解其复杂的内在机制。

目前关于冲击波对细胞培养影响的研究表明，冲击波可促进细胞增殖，改变细胞膜受体，增强并加速细胞分化，促进生长因子和趋化因子的释放，以及增加细胞迁移能力^7-9。

大多数干扰性的物理效应 在 体外 模型 已有多种将冲击波作用于细胞培养物的方法被报道。这一事实导致了一个问题，即由于不同模型中细胞刺激的物理条件差异较大，研究结果很难进行比较。总体而言，所有现有模型均致力于如何将冲击波最优地施加于细胞。

然而，仍有一个问题尚未解决：声波在穿过细胞培养物后会发生什么变化？主要问题在于，细胞培养基与周围空气的声阻抗差异极大，导致超过99%的冲击波被反射图1。

由于两种介质的声阻抗不同，声波不仅会发生反射，还会产生180°的相位偏移，从而对细胞施加强大的拉伸力图2。

声阻抗定义为材料密度与其声速的乘积，即 Z = ρ × c。水的声阻抗为 ZWater = 1,440,000 Ns/m³，对于空气则仅为 420 Ns/m³这两个数值的巨大差异会导致激波的反射和相位移动。这种相位移动使正压脉冲转变为拉伸波。

即使这种拉力对细胞无害，它也会干扰模拟的设想 体内 冲击波效应 体外. 在体 由于体型结构较大，这些拉伸力几乎不会产生。

此外，反射的行波甚至可能干扰入射波，从而引起干涉现象。目前已知有两种类型的干涉：相长干涉是指两列波叠加，导致振幅加倍 图3；当两列波以完全相反的相位相遇时，则发生相消干涉，导致波被抵消（图3）。因此，体外冲击波治疗（IVSWT）需要一种模型，以允许冲击波在穿过细胞培养层后继续传播。

IVSWT 水浴

基于上述考虑，我们设计了一种水浴装置，以避免前述问题（见图4）。该装置主要由一个有机玻璃制成的容器构成，其上设有膜结构，可用于连接各种冲击波发生器。在该膜与发生器之间需使用超声耦合凝胶进行耦合。水浴中需填充脱气水，以防止水中溶解气体引发空化效应。容器底部配有加热器，并连接温度传感器和控制单元，可调节温度以模拟体内环境，避免实验过程中细胞培养物温度下降。温度可稳定维持在37摄氏度，与培养箱中的条件一致。样品支架可用于浸没各种类型的培养瓶或试管。需注意，样品容器必须完全充满培养基，因为气泡会阻碍冲击波的传播。水浴后壁设有楔形吸能材料，用于吸收并消除冲击波，防止其反射回传造成干扰。

与其他体外冲击波治疗（IVSWT）模型相比，另一个优势在于可以调节施加器与培养瓶之间的距离。我们团队及其他使用该模型的研究者的研究结果均明确表明，每种细胞类型对不同的处理参数均表现出高度特异性的反应。此外，明确定义波源与样品之间距离至关重要，因为这使我们能够控制细胞相对于冲击波施加器焦点的特定位置。

方案

伦理许可

在获得患者的书面知情同意后，从妇产科剖宫产手术中获取脐带，用于分离人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。该研究已获得因斯布鲁克医科大学伦理委员会的批准（编号：UN4435）。

1. 准备IVSWT水浴

1. 在合适的容器中准备 3.5 L 自来水。水需加热至 37 °C（参见方案 6）。
2. 将水注入水浴箱，直至水位距离边缘约 3 cm。注意确保水完全覆盖膜。这大约需要准备好的 3.5 L 水。
3. 将温度传感器连接至电源。
4. 将传感器插入水浴箱后壁的指定接口中。
5. 将加热装置连接至温度传感器的电源。切勿在水浴无水时进行此操作，否则加热器会熔化有机玻璃。
6. 等待水温达到稳定的 37 °C。定期用某种棒状物搅拌水，以确保水浴内温度均匀一致。

2. 准备细胞和培养瓶

1. 在T25培养瓶中以所需密度接种细胞，过夜培养；或直接在培养瓶中培养细胞，直至达到所需的汇合度。
2. 实验前，将培养瓶垂直放置。
3. 向培养瓶中加入培养基，液面加至瓶颈下方即可。切勿加入过多培养基，避免培养基接触瓶颈或封口帽导致污染。
4. 使用无滤膜的实心盖将培养瓶拧紧，以防止水污染。注意水浴中的水及水浴设备本身并非无菌。
5. 将培养瓶盖用Parafilm封口膜密封，然后再放入水浴中。
6. 将已密封的培养瓶固定在提供的支架上。
7. 将固定好的培养瓶放入水浴中。注意使细胞培养瓶的中部与冲击波施加装置的膜中心处于同一高度，水浴侧边的标记线可作为参考。

3. 定义处理参数

1. 确定冲击波源与样品之间的距离。通过开展参数探索预实验（如图6所示）来确定最佳处理参数。
2. 在冲击波设备上选择合适的处理参数（能量流密度、频率）。同样，请参考图6。

4. 冲击波应用

1. 在冲击波换能器以及水浴膜上涂抹足量的商品化超声传导凝胶，以确保良好的耦合。换能器与膜之间不得存在空气或气泡，否则会吸收冲击波。
2. 将换能器连接至膜上，并稳定地固定在膜的中央位置，注意保持其水平对齐。
3. 确保探头在水浴中的垂直位置与水浴侧壁所示标记对齐。
4. 保持换能器中心与培养瓶中心处于同一水平线上，并固定稳定。
5. 启动冲击波装置，并在操作全程中保持培养瓶和换能器位置稳定，同时施加脉冲。

5. 处理后

1. 将培养瓶从水浴中取出。
2. 用普通纸巾将其擦干。
3. 用消毒剂仔细擦拭培养瓶表面。
4. 移除封口的Parafilm膜和瓶盖。
5. 用移液器将培养瓶内的培养基转移至离心管中。
6. 进行适当离心。离心参数取决于所使用的细胞类型，e.g. 对于HUVECs，使用290 g室温离心。
7. 向培养瓶中加入5 ml细胞培养基。用2 ml细胞培养基重悬离心后的细胞沉淀，将细胞悬液移入培养瓶中。这样可避免在处理过程中脱落的细胞碎片或细胞丢失。

注意事项

1. 制备及处理过程均应在层流罩内的无菌条件下进行，以避免细胞培养污染。
2. 建议遵循良好的细胞培养操作规范，以避免探针污染。特别是将培养瓶放回培养箱前，强烈建议对其外表面进行消毒。水浴箱及其内部的水均非无菌！
3. 除非水浴箱已加水，否则请勿将加热器连接至电源，以免损坏由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的水浴装置。
4. 在冲击波施加器上使用足量的超声耦合凝胶，以确保与水浴之间良好耦合及冲击波的有效传播。空气甚至微小气泡均会吸收冲击波！
5. 检查探针在水浴中的位置与施加器的相对关系，以确保整个生长区域均被处理。
6. 切勿将探针浸入水中过深，以免造成污染。

结果

采用所述方法，我们将冲击波作用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），这些细胞系此前从脐带中分离获得。脐带来源于择期剖宫产手术。

在T25细胞培养瓶中，当HUVECs细胞融合度达到90%时，使用电液冲击波治疗系统进行处理。治疗参数为能量流密度0.1 mJ/mm²，频率5 Hz。从冲击波源至细胞层距离为5 cm处施加300次脉冲。

通过实时PCR分析检测了Tie-2（含免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶2）mRNA的基因表达。与对照组（CTR: 100.03±7.5）相比，Tie-2表达在冲击波治疗（SWT）后随时间显著上调（SWT后2小时：156.75±14.49；4小时：141.03±9.71；6小时：166.68±2.15；p<0.05）图5B。该血管生成素受体可直接提示内皮细胞增殖，并作为其血管生成能力的指标。作为阳性对照，我们使用了Poly (I:C)（聚肌苷酸-聚胞苷酸），其作为一种RNA结构类似物，已知可刺激内皮细胞（SWT后2小时：125.7±10....

讨论

所提出模型的重要性在于 体外 冲击波治疗的优势在于，与现有模型不同，声波在穿过细胞培养物后仍可继续传播，从而避免了张力等干扰性物理效应。该模型更接近于 体内 比其他直接将波应用于细胞培养瓶的方法具有更温和的条件。

另一个优势在于可以调节冲击波源与细胞之间的距离。如果直接处理培养瓶，则无法实现这一点。然而 体内 根据目标组织所处的深度，施加器与目标区域之间的距离存在一定差异。同时，可以研究细胞相对于波焦点处于特定位置时所受到的影响。

开展初步实验

根据我们对心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞的操作经验，每种细胞类型都需要其特定的治疗参数。因此，我们强烈建议在开展目标实验之前，先进行预试验以确定合适的处理参数。该预试验应包括冲击波施加器与样品之间的不同距离、不同的能量流密度，以及确定最适宜的脉冲次数。冲击波应用频率的问题仍存在争议——即使 体内. 一项用于治疗参数探索性试验的合适方案作为补充材料提供

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Orthogold 冲击波治疗仪	组织再生技术公司，伍德斯托克，佐治亚州 – 由德国康斯坦茨 MTS-Europe GmbH 公司生产
IVSWT 水浴锅 V2.0	约翰·霍亨内格 - 技术产品
EBM-2 基础培养基 500 mL + EGM-2 SingleQuot 添加剂 &和生长因子	Lonza	CC-3156 && CC-4176	该培养基用于图示实验中HUVECs的培养，以铺满细胞培养瓶。对于其他细胞类型，请使用推荐的培养基。
Pechiney Parafilm M PM996	佩秦尼塑料包装	PH-LF-PM996-EA 在 labplanet.com	用于密封烧瓶
Falcon 血清移液管 25 ml	Becton Dickinson 实验室耗材	357525
CellMate II 血清移液管	Matrix Technologies
Skintact 超声耦合凝胶	Skintact	UL-01 250 ml
T25 细胞培养瓶	COSTAR	3056
Mikrozid 消毒剂	施ülke
3.5 L 脱气水
纸巾