一种系统性电化学与电生理评估神经记录电极的方法

摘要

不同的电极涂层通过改变电化学、化学和机械特性来影响神经记录性能。体外电极的比较相对简单，但体内响应的比较通常因电极与神经元之间的距离差异以及个体动物间的差异而变得复杂。本文提供了一种可靠的神经记录电极比较方法。

摘要

神经植入物的新材料和新设计通常被单独测试，仅展示其性能，而未参考其他植入特性。 这使得无法理性地选择特定应用下的最优植入物，也阻碍了基于最关键性能参数的新材料开发。 本文建立了一种用于体外（in vitro）和体内（in vivo）测试神经记录电极的实验方案。 文中记录了电化学和电生理测试的推荐参数，并讨论了关键步骤和潜在问题。 该方法消除或减少了简单体内（in vivo）测试范式中存在的许多系统误差，特别是电极与神经元之间距离的变化以及动物模型之间的差异。 结果表明，关键的体外（in vitro）和体内（in vivo）响应之间具有强相关性，例如阻抗和信噪比。 该方案可轻松适用于测试其他电极材料和设计。 体外（in vitro）技术可扩展至任何其他非破坏性方法，以确定更多重要的性能指标。 用于听觉通路手术方法的原则也可修改后应用于其他神经区域或组织。

引言

神经植入物正越来越多地被用于研究、控制假肢以及治疗帕金森病、癫痫和感觉丧失等疾病^1,2。 测量和/或控制大脑的化学和电学组成是所有神经植入物的基础。 然而，为了减少副作用，仅在神经组织处于异常状态时进行治疗至关重要³。 例如，用于治疗癫痫的深部脑刺激器仅应在发作期间向大脑施加电脉冲。 一些可能的副作用包括肌张力障碍、记忆丧失、定向障碍、认知功能受损、诱发幻觉、抑郁或抗抑郁效应^3,4。 因此，在许多设备中，需要闭环系统来记录电活动，并在检测到异常状态时触发刺激。 记录电极也用于控制假肢装置。 为了实现最精确的触发和设备控制，以尽可能高的信噪比记录目标神经活动至关重要。 在科研应用中，高信噪比同样极为理想，因为可以获得更可靠的数据，从而减少所需的实验对象数量。 这也将有助于更深入地理解神经刺激与记录所涉及的机制和通路。

神经植入物置入大脑后，会引发免疫反应^5,6。 该免疫反应的时间进程通常分为急性和慢性两个阶段，每个阶段涉及不同的生物学过程⁷。 免疫反应可能对植入物的性能产生显著影响，例如通过胶质瘢痕包裹使电极与目标神经元隔离，或导致植入材料的化学降解⁸。 这会降低记录电极的信噪比和刺激电极的输出功率，并可能导致电极失效⁹。 为防止植入物在使用寿命期间发生失效，必须谨慎选择植入物的设计和材料。

近年来，为了提高神经记录中的信噪比和植入物的稳定性，已开发出多种不同的材料和植入体设计。 电极材料包括铂、铱、钨、氧化铱、氧化钽、石墨烯、碳纳米管、掺杂导电聚合物，以及最近出现的水凝胶。 已测试的基底材料还包括硅、二氧化硅、氮化硅、蚕丝、聚四氟乙烯（特氟龙）、聚酰亚胺和硅胶。 还研究了多种电极修饰方法，例如采用层粘连蛋白、神经营养因子或自组装单分子层进行涂层处理，以及利用电化学、等离子体和光学技术进行表面处理。 植入体设计可以是一维、二维或三维结构，电极通常位于绝缘探针的尖端，或穿透式电极柄的边缘，也可构成二维阵列用于皮层表面植入。 无论电极的设计或材料如何，以往文献通常在没有与其他植入结构进行对比的情况下展示新植入体的性能。 这阻碍了对其特性的系统性评估。

本方案提供了一种通过多种分析与电生理技术比较不同电极材料的方法。 基于一篇近期发表的文章，该文章比较了4种不同掺杂的导电聚合物涂层（吡咯聚合物（Ppy）和3,4-乙烯二氧噻吩聚合物（PEDOT）分别掺杂硫酸根（SO₄）或 para-甲苯磺酸盐（pTS）和4种不同的涂层厚度¹⁰. 本文发现一种材料 PEDOT-pTS 在沉积时间为 45 秒时，具有最高的信噪比和动作电位数量，且背景噪声最小，这些参数依赖于电极阻抗。 与其它掺杂导电聚合物及裸露的铱电极相比，PEDOT-pTS 还表现出更优异的急性生物稳定性。 该方案可用于确定控制信噪比和稳定性的关键参数，并进一步利用这些参数提升神经记录电极的性能。

方案

该方案已获得拉筹伯大学（09-28P）和皇家墨尔本理工大学动物伦理委员会（1315）的批准。

1. 电极制备与初步处理 体外 测试

1. 配制电极涂层沉积溶液；例如 10 mM 3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）和 0.1 M 钠 para-甲苯磺酸钠（Na₂pTS）形成聚-3,4-乙烯二氧噻吩-pTS（PEDOT-pTS）。
2. 将电极阵列连接至电化学工作站。
3. 小心地将电极阵列放入沉积溶液中，并用夹具固定。
4. 将铂网对电极和 Ag/AgCl 参比电极放入沉积溶液中，并连接至电化学工作站。
5. 使用恒电位仪将涂层沉积到目标电极上。 沉积条件（电位、电流和时间）将根据所需的涂层而有所不同。 对于PEDOT-pTS涂层，已采用1 V的施加电位，持续时间为15、30、45或60秒。  阵列上的四个电极应以交错配置的方式涂覆涂层（图1).
6. 将电极阵列从沉积液中取出，并用去离子水轻轻冲洗。
7. 根据需要使用其他材料重复包被步骤。
8. 准备 体外 测试溶液（0.3 M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄））₂HPO₄) 于去离子水中。
9. 将电极阵列连接到恒电位仪。
10. 将电极阵列小心放入测试溶液中，并用夹具固定。
11. 将铂网对电极和 Ag/AgCl 参比电极放入测试溶液中，并连接至电化学工作站。
12. 使用电化学工作站，对所有电极依次进行电化学阻抗谱（EIS）测试（偏置电位 0 V，振幅 10 mV，频率范围 10–100,000 Hz）和循环伏安法测试（1 个循环，电位范围 -0.8 至 0.8 V，扫描速率 100 mV/s）。 未测试的电极保持在开路电位，每次测试之间设置1秒的静置时间。 全部32个电极在1小时的完整测试过程中均与溶液保持接触。
13. 从测试溶液中取出电极阵列，并用去离子水轻轻冲洗。
14. 进行其他所需的分析，例如光学显微镜观察。
15. 将探针存放在干燥的保护容器中，以防止电极表面受损和降解。

2. 电极植入

1. 称量大鼠体重。
2. 注射乌拉坦（20% w/v 溶于蒸馏水，1.3 g/kg，腹腔注射）以进行非复苏性 麻醉。
3. 通过趾夹回缩反射测试确认麻醉起效。若麻醉深度不足，应追加乌拉坦剂量（0.3 g/kg，腹腔注射）。
4. 涂抹眼用润滑剂，然后剃除动物头部的毛发。
5. 将动物俯卧位固定于恒温板上，并插入直肠探头（37.5 °C）。
6. 将一侧耳杆置于立体定位仪中大致预期的最终位置，然后调整动物位置，使耳杆对准外耳道。
7. 将另一侧耳杆对齐对侧外耳道。 在耳杆中微调动物位置，使其与门齿固定器对齐。
8. 使用鼠齿镊打开动物下颌，将上门齿钩入门齿固定器，并固定鼻部。
9. 在头部皮肤上做一切口，切口位置约位于中线右侧1 mm处，从前囟前10 mm至后囟后10 mm。
10. 从切口处向外侧牵开皮肤和肌肉，暴露顶骨和间顶骨 用20%过氧化氢溶液和纱布擦拭暴露骨面。
11. 在间顶骨上靠近后囟和中线处钻一个约3 mm²的孔，取出骨塞。 用无菌生理盐水冲洗孔洞，以清除可能损伤电极的骨屑或碎片。
12. 使用钝头剪刀在颈背部皮下钝性分离，形成一个腔隙。 将一根Ag/AgCl导线用脱脂棉包裹，用生理盐水浸润后，将参考电极置入该腔隙中。
13. 用针尖在矢状面切开硬脑膜。
14. 将电极阵列连接至电极操纵器，并将其调整至开孔上方，保持19°的前后倾斜角度。 手动将电极插入脑组织约2 mm，方向朝向下丘。
15. 将扬声器连接至左侧空心耳杆。
16. 确保放大器已开启，然后在封闭记录腔之前再次确认动物处于麻醉状态。

3. 体内 测试

1. 输送白噪声脉冲（高斯分布噪声，1-44 kHz；10 毫秒上升-下降时间），并监测每个电极上的活动。脉冲输送的最大速率为每 200 毫秒一次。
2. 使用电动微驱动装置，缓慢插入电极阵列，直至在每个分支上最远端的 3 个电极记录到声诱发活动（记录到活动的电极数量和位置可能因电极放置位置或电极设计而异）。
3. 采用声刺激方案：以 70 dB 强度，每秒重复一次，共 300 次 50 毫秒的白噪声脉冲（高斯分布噪声，1-44 kHz；10 毫秒上升-下降时间），并在每个电极上记录多单位活动（采样率为 24.4 kHz）。
4. 将电极阵列再缓慢插入 200 μm 进入下丘（IC），使每个电极大致位于初始记录位置中更远端电极所在的位置。
5. 重复声刺激与神经记录方案。
6. 以 200 μm 为步长继续插入电极阵列，并重复执行声刺激与神经记录方案，直至所有电极均已在至少 3 个不同位置记录到声诱发活动（通常共 8–12 个电极位置）。
7. 以 200 μm 为步长将电极阵列回撤，同时持续执行声刺激与神经记录方案，直至恢复至初始电极阵列位置。
8. 手动小心地将电极阵列完全回撤。
9. 注射过量戊巴比妥钠（Lethobarb；200 mg/kg，腹腔注射）以处死动物。
10. 用蒸馏水轻轻冲洗电极阵列。  然后将探针存放在干燥的保护容器中，以防止电极表面受损或降解。

4. 植入后 体外 测试

1. 用蒸馏水轻轻冲洗电极阵列，以去除任何污染物。
2. 将电极阵列连接至电化学工作站。
3. 小心地将电极阵列放入测试溶液中，并固定夹紧。
4. 将铂网对电极和Ag/AgCl参比电极放入测试溶液中，并连接至电化学工作站。
5. 使用电化学工作站，在所有电极上依次进行电化学阻抗谱（EIS）（偏置电位 0 V，振幅 10 mV，频率范围 10–100,000 Hz）和循环伏安法测试（1 个循环，电位范围 -0.8 至 0.8 V，扫描速率 100 mV/s）。 未测试的电极保持开路电位，每次测试之间设置 1 秒的静置时间。 全部 32 个电极在整个 1 小时的测试过程中均与溶液保持接触。
6. 从测试溶液中取出电极阵列，并用去离子水轻轻冲洗。
7. 将电极阵列放入酶清洗溶液中浸泡 24 小时。
8. 从溶液中取出电极阵列，并用蒸馏水冲洗。
9. 将电极阵列连接至电化学工作站。
10. 小心地将电极阵列放入测试溶液中，并固定夹紧。
11. 将铂网对电极和Ag/AgCl参比电极放入测试溶液中，并连接至电化学工作站。
12. 使用电化学工作站，在所有电极上依次进行电化学阻抗谱（EIS）（偏置电位 0 V，振幅 10 mV，频率范围 10–100,000 Hz）和循环伏安法测试（1 个循环，电位范围 -0.8 至 0.8 V，扫描速率 100 mV/s）。 未测试的电极保持开路电位，每次测试之间设置 1 秒的静置时间。 全部 32 个电极在整个 1 小时的测试过程中均与溶液保持接触。
13. 从测试溶液中取出电极阵列，并用去离子水轻轻冲洗。
14. 将探针存放在干燥的保护容器中，以防止电极表面受损或降解。

结果

本实验方案所用的一种典型电极阵列如图1所示。该阵列在4个探针臂上共有32个铱电极，每个电极的标称几何面积为413 μm²，电极间距为200 μm。阵列上每隔一个电极涂覆一种四种不同电极涂层中的一种，分别标记为1-4。所选涂层材料在化学、机械和电化学性能方面均经过仔细考量。如前所述¹⁰，延长沉积时间会增加电极面积和涂层厚度，而施加更大的电流或电位也可能提高沉积速率，但同时可能发生竞争性反应，从而影响沉积过程。针对这种特定导电聚合物，沉积方案已在此前优化，以确保获得可重复的涂层，并将沉积限制在目标电极上（即不扩散至相邻电极）¹⁰。

电极阵列修饰完成后，应进行一系列光学和电化学分析。本实例中采用了循环伏安法（图2）和电化学阻抗谱法（图3）。该方案采用大电位范围的循环伏安法，并从还原扫描方向开始。若需计算电极电荷密度，应将循环伏安数据转换为电流-时间曲线，并对还原区或氧化...

讨论

本方案提供了一种在同一只动物体内比较神经记录电极涂层的方法。 所采用的电极设计适用于植入大鼠下丘（IC），其尺寸处于相似量级。 此类电极的某些变体，例如增加齿间距，会导致所有齿无法同时位于大鼠下丘内；而更长的齿和更大的电极间距会增加插入过程中齿尖接触颅底的风险。 较小的电极间距则会增加一个电极上的涂层与相邻电极发生接触的风险。 电极面积会影响神经记录信号的响应，因此必须在不同实验间保持一致。 所选面积适用于记录多单元活动，能够在电极与神经元距离变化的情况下获得更一致的数据。 使用4个具有相同涂层的电极可在单只动物内部进行统计分析，且通过2只动物分别植入2种不同的电极阵列即可获得足够的数据（每种材料样本量为8）。 此外，各齿上的电极涂层呈交错排列，以尽量减少实验过程中因插入电极阵列导致的神经元死亡，或因齿从尖端到基部宽度变化引起的电场效应等误差。 此类误差可能导致齿尖电极与基部电极产生不同的电生理响应。 已发现不同批次电极阵列在电化学和电生理特性上存在差异；因此建议使用同一批次制备的电极阵列进行系列实验。 也可采用三维电极阵列以从单只动物获...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可编程衰减器	TDT	PA5	控制跨频率声信号的幅度
静电扬声器驱动器	TDT	ED1	驱动静电扬声器（EC1）
耦合式静电扬声器	TDT	EC1	向动物传递声音
处理基站	TDT	RZ2	记录电极阵列的神经活动（使用PZ2前置放大器）
前置放大器	TDT	PZ2-256	256通道高阻抗前置放大器
多功能处理器	TDT	RX6	用于生成声学刺激
多通道电极	NeuroNexus Technologies	A4 × 8–5mm-200-200-413	4支臂32通道电极阵列
恒电位仪	CH Instruments	CHI660B	用于沉积电极涂层，并进行循环伏安法和电化学阻抗谱测试（与CHI684联用）
多路复用器	CH Instruments	CHI684	在恒电位仪上切换不同电极
磷酸氢二钠	Fluka	71644	用于测试溶液
3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）	Sigma Aldrich	483028	一种电极涂层材料
对甲苯磺酸钠（Na2pTS）	Sigma Aldrich	152536	一种电极涂层材料
氨基甲酸乙酯	Sigma Aldrich	U2500	用于麻醉动物
银/氯化银电极	CH Instruments	CHI111	用于体外电极测试 in vitro
铂电极	CH Instruments	MW4130	用于体外电极测试 in vitro
电动微驱动装置	Sutter Instruments	DR1000	用于手术期间控制电极阵列的位置
酶清洁剂	Advanced Medical Optics	Ultrazyme	植入后清除电极阵列上的蛋白质
声学屏蔽箱	TMC Ametek	83-501	将动物与声学和电噪声隔离
立体定位仪	David Kopf Instruments	1430	固定并定位动物
温度控制器	World Precision Instruments	ATC1000	控制动物体温
骨钻	KaVo Dental	K5Plus	用于实施开颅手术
吸引器	Flaem	Suction pro	用于实施开颅手术