由细菌病原体不同程度定植的 C. elegans 的自动化分离

摘要

蠕虫分选仪通过根据荧光报告基因的表达对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行分选，从而促进遗传筛选。在此，我们描述一种新的应用： 根据表达GFP的病原体的定植情况进行分选，并利用该方法研究病原体识别在启动免疫反应中尚未被充分理解的作用。

摘要

分选蠕虫仪是一种类似于流式细胞仪（FACS）的仪器，用于开展以下研究： 秀丽隐杆线虫，通常用于根据荧光报告基因的表达对线虫进行分选。本文中，我们重点介绍该仪器的一种替代用途，即根据线虫被表达GFP的病原体定植的程度对其进行分选。这一新应用使我们能够探究线虫肠道定植程度与免疫反应诱导之间的关系。而 秀丽隐杆线虫 已记录到针对不同病原体的免疫反应，但其启动机制仍不清楚。两种主要的可能机制（并非互斥）是：对病原体相关分子模式的识别，以及对感染所造成损伤的感知。为了区分这两种可能性，必须将生物体对病原体的暴露与其引发的损伤分离开来。利用蠕虫分选仪，可实现对被革兰氏阴性病原菌大量定植的线虫进行分离 铜绿假单胞菌，其损伤可能由病原体载量引起，而对照线虫虽经相似暴露但未被定植或仅有轻微定植。利用这些不同的群体评估病原体载量与转录免疫应答诱导之间的关系。结果表明二者相互分离，支持存在病原体识别的可能性。

引言

自动线虫分选技术与流式细胞术（FACS）类似，其工作原理是当线虫在管道中被拉直后通过时，检测其体内荧光信号 （通常由报告蛋白的转基因表达提供），然后根据研究者设定的门控参数，将线虫导向收集管/孔或废液容器 ¹。线虫分选仪可在多个研究领域中发挥重要作用；例如，有研究将其作为分析工具，系统追踪了近1,000个基因的启动子活性在时空上的动态变化模式²。
然而，线虫分选仪最主要的应用仍在于遗传筛选，用于检测目标基因的表达水平或荧光蛋白在线虫体轴上的定位情况^3-5。

本文介绍了一种蠕虫分选仪的新应用，用于追踪荧光标记病原体在蠕虫体内的定植过程。利用该工具，我们重点研究了病原体定植程度/载量与免疫应答之间的关系，以深入了解在蠕虫中启动免疫应答的相关机制。

迄今为止，在几乎所有被研究过的生物体中，针对微生物病原体的先天免疫反应的启动都依赖于对病原体相关分子模式（PAMPs）和/或危险/损伤相关分子模式（DAMPs）的识别^6,7。前者是指保守的微生物结构，包括微生物细胞壁、鞭毛或脂双层的组分⁶；后者则包括释放的分子（例如 ATP⁸）、发生改变的蛋白质或其他细胞过程异常的标志物^9,10。这两类信号均由被称为模式识别受体（PRRs）的蛋白质识别，当这些受体特异性结合相应的模式分子后，会激活一系列事件，从而引发保护性免疫反应。C. elegans 作为一种易于操作的模型生物，在解析宿主-病原体相互作用的多个方面极为有用，但目前尚不清楚的是，该线虫中免疫反应是如何被启动的。迄今尚未发现任何与其它生物中模式识别受体（PRRs）同源的候选受体能够结合PAMPs，而且许多在其他生物中对免疫反应至关重要的PRR同源物在C. elegans中对病原体反应和抗性的贡献却出人意料地有限。例如，在Drosophila 中对抵抗革兰氏阳性病原体至关重要的Toll受体，在C. elegans中仅有一个同源基因tol-1，它仅有助于抵御革兰氏阴性病原体Salmonella Typhimurium¹¹，而对其他已测试的革兰氏阴性或革兰氏阳性病原体则无保护作用^11,12。这些观察结果，结合一些研究表明干扰细胞蛋白质翻译可诱导免疫反应，使部分研究者提出C. elegans主要识别DAMPs^9,13,14。然而，也有报道指出死亡的病原体能够诱导免疫反应，提示PAMP的识别可能在C. elegans的病原体识别中具有重要作用^15,16。先前针对基因型相同且年龄同步化的C. elegans群体的免疫反应研究显示，个体间在肠道被革兰氏阴性细菌病原体Pseudomonas aeruginosa定植的程度上存在显著差异。

然而，转录谱分析研究将这些定植程度不同的种群视为单一整体^17,18。我们利用这种变异性，开发了一种实验方案，通过自动化蠕虫分选仪对暴露于表达GFP的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中定植程度不同的种群进行分离。对不同定植水平种群的基因表达进行分析，有助于评估病原体载量（及其引起的损伤）与免疫应答之间的关系，并为秀丽隐杆线虫（C. elegans）中病原体识别机制提供了新的见解¹⁹。下文将描述该实验方案，该方案可适用于分选感染了任何荧光标记病原体的线虫。

需要提醒潜在使用者的是，所需分选的线虫数量取决于后续分析的性质及所采用的实验方案。例如，在进行微阵列基因表达分析时， >需要1,000条线虫才能获得足够的RNA（采用标准实验方案时），但如果使用扩增技术，则仅需约100条线虫即可，从而加快材料收集速度，最大限度地减少对线虫的应激。

方案

1. 获得同步化的年轻成年动物培养物

1. 在多个接种了OP50-1的大肠杆菌的NGM平板上培养线虫 大肠杆菌 细菌（10倍 从饱和培养物中浓缩，直至大量线虫发育至产卵阶段。
2. 用卵制备液处理怀卵动物以获得同步化的卵培养物（卵）。
3. 将卵接种到多个铺有10倍浓度大肠杆菌的60毫米NGM平板上 浓缩的OP50-1，密度约为150-200个卵/板。
4. 在25 °C下培养平板2天（直至线虫发育至L4-年轻成虫阶段）。

2. 准备 铜绿假单胞菌 培养皿与感染性蠕虫

1. 在进行卵制备的当天（步骤 1.1），将 PA14::GFP 菌种接种至 2 ml 含利福平（终浓度为 100 μg/ml）的 King’s B 培养基中。于 37 °C 振荡培养过夜（O/N）。
2. 将 PA14::GFP 菌液接种至实验所需数量的慢杀平板（SKP）上。在每个 150 mm 的 SKP 培养皿中加入 75–100 μl 饱和菌液，并使用无菌玻璃涂布器均匀涂布。于 37 °C 培养 20–24 小时。
3. 从培养箱中取出平板，静置冷却至室温（约 20 分钟）。使用 M9 缓冲液将步骤 1.4 中的线虫以最小体积冲洗至 PA14::GFP 平板上。当使用 150 mm 平板时，可将数百条线虫置于单个平板上。
4. 将平板于 25 °C 培养 18–21 小时。对于暴露于 P. aeruginosa 的年轻成虫线虫，此时间段可获得定植与非定植个体的最佳分布状态。

3. 设置线虫分选仪

在进行样品分选之前，确保仪器正常运行。详细信息可访问 http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43，基本步骤如下所述。

1. 将鞘液阀压力设置为约 5 psi （4.5–5.5 范围）。
2. 为确认鞘液流速是否合适，在分配器下方放置一个 15 ml 的锥形管，打开鞘液阀，关闭分选阀。将管子置于分配器下方保持 60 秒，管中液体体积应为 9–10 ml。若超出此范围，应相应调整鞘液阀压力。
3. 为确保鞘液流速（按步骤 3.2 设置）能够实现准确分选，使用 40 μm 的对照颗粒测试分选速率：
4. 关闭鞘液阀，向储液罐中加入约 25 ml 对照颗粒溶液。
5. 打开鞘液阀和样品阀。
6. 在计算机软件中进入 "对照颗粒模式"，然后点击采集。
7. 确保颗粒流速约为 5–8 个颗粒/秒，飞行时间（TOF）接近颗粒宽度，即 40 μm。此类 TOF 表明每次仅有一个 40 μm 的物体通过。若数值超出此范围，应根据上述说明相应调整设置。

4. 分选定植与非定植线虫

1. 使用M9缓冲液将线虫冲洗至15 ml锥形管中。静置使成虫自然沉降至管底，吸除上清液。加入新鲜M9缓冲液重悬，重复此洗涤步骤3–4次。该过程可去除大部分幼虫以及过量细菌，耗时约10分钟。
2. 将线虫加入蠕虫分选仪储液槽中，并用小型搅拌子轻轻混匀。
3. 通过将绿色PMT设为600，红色和黄色PMT设为200，调节初始信号增益。
4. 开始采集数据以调整设置。
5. 目标分选速率为每秒25-30个事件（线虫）。若事件速率过高，需用M9缓冲液适当稀释储液池中的线虫；若速率过低，则在少量M9缓冲液中加入更多线虫。
6. 如果实验需要对定植与非定植线虫进行非常严格的分离，则设置 "共定位检测" 到 "纯度"这可以确保当两个物体距离过近或同时出现在同一液滴中时，仪器会拒绝收集该液滴。
7. 为了分选目标群体，在指示大小（以获得成虫）和荧光强度的轴上绘制门控区域即 高表示定植，低表示非定植）。荧光门控的阈值需通过实验确定。
8. 在分配器下方放置一个多孔板或培养皿以收集线虫 然后打开分选阀，开始分选线虫。
9. 收集少量细胞样本，在显微镜下确认分选所得细胞群体是否为目标细胞群体。若非目标群体，应相应调整设门参数，并继续样本收集。

结果

当将年龄相匹配、基因型相同的 C. elegans 暴露于 P. aeruginosa 时，其定植水平呈现出广泛的分布（图1A）。借助本文所述的实验方案，可有效分离未定植与已定植的线虫（图1B）。与未定植线虫不同，已定植线虫表现出组织损伤的迹象，例如运动迟缓和排便减少¹⁹。后者可能是导致被 P. aeruginosa 定植的线虫难以清除感染的原因之一。这一现象对本实验方案具有直接意义，提示被分选为未定植的线虫此前并未被定植。为了直接验证该推论是否正确，研究人员手工挑选已定植线虫，对其进行与分选实验中类似的洗涤步骤，随后在荧光显微镜下观察；结果仅有4/56的线虫清除了病原体。因此，在被分选为未定植的线虫中，此前曾被定植的个体所占比例极可能可以忽略不计。然而，建议在洗涤过程中监测定植状态的变化，以避免错误分选对分析结果造成影响，这一问题在研究其他病原体时可能比 P. aeruginosa 更为突出。

先前采用本文所述方案的研究...

讨论

本文所述方法利用对线虫外部实体的荧光标记，来追踪线虫与其环境之间的相互作用。在我们所展示的案例中，分离基于对病原体的标记，用于将携带大量病原体的线虫与无（或少量）病原体负载的线虫区分开来。后续的基因表达分析发现，这两组之间在免疫应答方面没有差异，表明免疫应答与病原体负载量无关。已有研究显示，触发该应答的信号在物理上与细菌相关联，而非由细菌分泌，提示该信号可能是一种病原体相关分子模式（PAMP）。综合这些结果支持了如下假说：PAMP识别在秀丽隐杆线虫（C. elegans）免疫应答的启动中发挥重要作用¹⁹。

上述分选方案的一个优点是，能够从同一种群中分离出定植与非定植的线虫。这依赖于种群中定植与非定植个体具有理想的分布比例。我们发现，在用野生型幼年成虫线虫感染时 P. aeruginosa，这相当于约18小时的暴露时间。该暴露时间导致动物群体中大多数个体被定植至一定程度 "中等" 学位，但数百条线虫表现出完全定植，同样数量的线虫未被定植。尽管这符合我们实验目的下的最佳分布，但其他人可依据自身需求定义其最佳分布。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
M9 缓冲液	实验室自制		配方见 wormbook.org
利福平	Sigma	R3501
卵制备溶液	实验室自制		50 ml 水；40 ml 漂白剂；10 ml 10 N 氢氧化钠
NGM 平板	实验室自制		配方见 wormbook.org
SKP 平板	实验室自制		配方与 NGM 相同，仅蛋白胨浓度为 0.35% 而非 0.25%
对照测试颗粒	Union Biometrica	310-5071-001