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植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

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DOI：

10.3791/51095

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2014年2月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

本文内容

摘要

本文介绍了一种植物蛋白质复合物的纯化与表征实验方案。我们通过免疫沉淀复合物中的单一蛋白质，从而鉴定其翻译后修饰及其相互作用蛋白伙伴。

摘要

由于具有复杂的感知和信号传导系统，植物能够快速适应不断变化的环境。在病原体侵染过程中，植物会通过募集和激活免疫复合物来迅速响应感染。via 免疫复合物的激活与蛋白质的翻译后修饰（PTMs）密切相关，例如磷酸化、糖基化或泛素化。深入理解这些翻译后修饰的调控机制，将有助于更全面地揭示植物抗病性的实现途径。

本文介绍了一种用于纯化核苷酸结合型亮氨酸富集重复（NB-LRR）互作蛋白及其后续鉴定其翻译后修饰（PTMs）的蛋白质纯化方法。经过少量修改后，该方法也可适用于其他植物蛋白复合物的纯化。该方法基于目标蛋白的表位标签融合表达，随后通过免疫沉淀进行部分纯化，并用于质谱分析，以鉴定相互作用蛋白及翻译后修饰。

本实验方案表明：i). 可通过质谱法检测磷酸化等蛋白质翻译后修饰（PTM）的动态变化；ii). 获得足量的目标蛋白至关重要，这可以在一定程度上弥补免疫沉淀产物纯度不足的问题；iii). 为了检测目标蛋白的翻译后修饰，必须对该蛋白进行免疫沉淀，以获得足够量的蛋白。

引言

免疫通路依赖于蛋白质的多种翻译后修饰（PTM），以快速转导信号并激活免疫反应1。PTM 是对蛋白质结构进行的快速、可逆且高度特异性的化学修饰，能够影响蛋白质的构象、活性、稳定性、定位以及蛋白质-蛋白质相互作用2-4。在植物中，已鉴定出超过300种PTM类型，包括泛素化、小泛素样修饰（sumoylation）、硫酸化、糖基化和磷酸化2,5。越来越多的证据表明，PTM在植物免疫的多个方面具有重要作用1,5,6。蛋白质磷酸化是指磷酸基团可逆地结合到丝氨酸、苏氨酸 或酪氨酸残基上的过程，是调控多种细胞功能的重要机制，因此也是植物防御信号级联中研究最为深入的PTM5-11。依赖磷酸化的信号转导是植物防御激活的核心组成部分，该过程可由跨膜受体对外部微生物的识别启动，也可由多结构域抗性蛋白在细胞内对病原体的识别所触发5,8。

微生物侵入植物后，会被细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）所识别12。已知的PRRs包括受体样蛋白（receptor-like proteins, RLPs）和受体样激酶（receptor-like kinases, RLKs），二者均含有一个配体结合的胞外结构域和一个单次跨膜结构域。与RLPs不同的是，RLKs具有胞内的激酶结构域13-15。PRRs的胞外结构域可结合微生物中保守的激发子分子，即病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），对于RLKs而言，这一结合会引发其胞内结构域的自磷酸化和转磷酸化6,16。在PRRs感知PAMP并发生磷酸化之后，下游会依次引发一系列胞质蛋白的磷酸化，包括激酶17,18、E3泛素连接酶19、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）20,21、钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPK）22,23以及转录因子24,25，最终诱导PAMP触发的免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）。

除了模式识别受体（PRRs）介导的胞外识别外，病原体的胞内识别通过胞质受体实现。这些多结构域抗性（R）蛋白包含一个可变的N端结构域、一个中央核苷酸结合（NB）基序以及C端的富含亮氨酸重复序列（LRR），因此被称为NB-LRR蛋白26,27。R蛋白可直接或间接识别病原体来源的毒力分子，即效应子（effectors），这些效应子也已知会靶向PRRs及免疫系统的其他节点。识别过程可诱导强烈的防御反应，从而引发效应子触发的免疫（ETI）28-31。NB-LRR蛋白在其NB结构域内含有必需的ATP结合基序30,32，但缺乏激酶结构域。已有大规模蛋白质组学研究报道NB-LRR保守结构域可发生磷酸化33，但其在ETI中的作用尚不明确。与PTI类似，NB-LRR蛋白的激活可导致包括MAPKs34-37和CDPKs38-40在内的胞质蛋白发生磷酸化。尤为重要的是，效应子的识别可导致与NB-LRR蛋白直接相互作用的辅助蛋白发生磷酸化41。其中一些例子包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的RIN4蛋白和番茄（Solanum lycopersicum）中的Pto蛋白，它们分别与NB-LRR蛋白RPM142,43和Prf44相互作用。在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）感染过程中，效应子蛋白AvrB可诱导RIN4的磷酸化，这一过程极有可能由受体样激酶RIPK介导45,46。类似地，在番茄中，P. syringae的效应子AvrPto和AvrPtoB可诱导Pto的磷酸化47。与缺乏激酶结构域、必须通过反式磷酸化修饰的RIN4不同，Pto是一种具有活性的激酶，能够进行自磷酸化48，并可对底物进行反式磷酸化49,50。尽管Pto需要其激酶活性来启动依赖效应子的信号传导，但激酶失活的Pto突变体仍能在不依赖效应子的情况下传递信号51。我们最近通过研究发现Prf/Pto复合物为寡聚体结构，包含多个Prf和Pto分子52，且同一复合物内的Pto分子可相互进行反式磷酸化，从而解释了上述现象47。我们提出一个模型：其中一个Pto分子（传感器）与效应子蛋白结合，引起NB-LRR蛋白（Prf）的构象变化，进而激活复合物内的另一个Pto分子（辅助因子）。随后，辅助Pto分子对传感器Pto进行反式磷酸化，最终实现抗性复合物的完全激活47。

这些实例表明，在效应子识别过程中，免疫复合物组分及其潜在的翻译后修饰（PTMs）的鉴定有助于深入理解信号如何从效应子感知传递至下游靶标。本文描述了一种用于分离与NB-LRR相互作用蛋白的蛋白质纯化方法，以及后续对其翻译后修饰的鉴定。我们采用 Nicotiana benthamiana 以及番茄Prf/Pto复合物作为模型，但该相同方案也可轻松应用于其他RLKs N. benthamiana 和 拟南芥53 稍作修改，具体修改内容将在本方案中予以说明。

方案

注意：所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。

1. 植物材料与缓冲液的制备

  1. 对于 N. benthamiana
    1. 培养 根癌农杆菌 感兴趣的菌株用于瞬时表达（本示例中为 Prf-FLAG、Prf-3xHA、Pto-FLAG 及作为空白对照的空载体），在 28 °C 下于液体培养基（L 培养基，含适当抗生素）中以 200 rpm 振荡培养至稳定期。
    2. 通过离心收集并沉淀农杆菌（3,000 × g，5 分钟）。弃上清液，将沉淀的农杆菌重悬于侵染缓冲液中。
    3. 通过在600 nm波长处（Abs 600 nm）测定吸光度值（OD值）来测量农杆菌的数量。将菌液的OD值调整至0.1–0.8。
    4. 浸润 4 周 老的 N. benthamiana 植物（22 °C，16小时光照）通过农杆菌进行手工注射（使用1 ml无针头注射器）或真空浸润法转化（添加0.02% v/v表面活性剂）。
      注意：使用第一个接近完全展开的叶片及其紧邻的两片较老叶片，以获得最有效的蛋白质表达。若要检测泛素化或乙酰化蛋白质，分别在浸润后1天和2天，用100 nM MG-132或100 ng/ml Trichostatin A浸润叶片。
    5. 在侵染后2-5天采集侵染叶片，用液氮速冻，将样品置于-80 °C冰箱中保存。
      注意：通过在5天的时间过程中取样，并利用免疫印迹检测目标蛋白的表达水平，提前确定该蛋白的最佳表达水平。
  2. 对于 A. thaliana 稳定转基因品系
    1. 培养 A. thaliana 将种子接种于6孔板中，每孔加入5 ml液体MS培养基（含1% w/v蔗糖）。每孔放入3至5粒目标转基因株系或未转化对照株系的种子（已灭菌并经过春化处理）。200 rpm振荡培养2天后，将培养板转移至生长室，继续培养2周（22 °C，10小时光照）。
    2. 采集样品并用液氮速冻。
      注意：可使用表达与目标蛋白带有相同标签的无关蛋白的转基因品系作为对照。
  3. 缓冲液
    1. 配制缓冲液A。将缓冲液脱气1–2小时（对于RLKs、其他膜结合蛋白和核蛋白，加入1% v/v IGEPAL CA-630）53).
      注意：缓冲液A可在4 °C长期保存。可使用1% v/v Triton替代IGEPAL CA-360。
    2. 至少在提取前1-2小时准备好80 ml冰冷的Buffer B。
      注意：组织与提取缓冲液的理想比例为 1:4（w/v）。

2. 蛋白质提取

  1. 提取前立即准备 80 ml 冰冷的缓冲液 C。
    注意：若需检测泛素化蛋白，请添加 10 μM MG-132。
  2. 使用研钵和研杵在液氮中研磨 20 g 的 N. benthamiana 组织（约 15 片叶片）或 A. thaliana 幼苗（每 6 孔板 2–4 g）。
  3. 向 20 g 研磨后的组织中加入 80 ml 冰冷的缓冲液 C，充分混匀，并在冰上解冻。
    注意：请同时研磨所有样品（目标蛋白样品与对照样品）。
  4. 使用组织匀浆器在 4 °C 预冷条件下，以全速进行 3 次、每次 10 秒的匀浆处理。用 22–25 μm 滤膜过滤后，在 4 °C 下以 30,000 × g 离心 30 分钟。
    注意：也可使用预先冰冻的新鲜研钵和研杵进行匀浆。
  5. 为亲和介质的封闭和洗涤步骤，准备 20 ml 缓冲液 D。
  6. 用含 1% BSA 的 500 ml 冰冷缓冲液 D 在 4 °C 下封闭 100 ml 合适的亲和介质 5 分钟。
    注意：推荐的亲和介质包括抗 FLAG M2 琼脂糖、链霉亲和素琼脂糖、GFP-Trap_A 以及抗 HA 琼脂糖。
  7. 用 1 ml 冰冷缓冲液 D 洗涤 3 次。
  8. 移除叶片提取物的上清液，并通过 0.45 μm 注射器滤膜过滤至冰上的新离心管中。
    注意：提取物颜色应为绿色或黄色；若样品变褐，则应弃去并重新开始。
  9. 取一部分粗提物用于免疫印迹分析，加入 5× SDS-PAGE 上样缓冲液，涡旋混匀后，在金属浴中 80–100 °C 加热 10 分钟以使蛋白变性。

3. 蛋白质免疫沉淀

  1. 将蛋白提取物均分至两个 50 ml 离心管中，每管加入 50 μl 用缓冲液 D 悬浮的亲和基质。4 °C 条件下轻柔旋转孵育 2 小时。
    注意：延长孵育时间并未发现可提高得率。
  2. 通过向缓冲液 D 中添加以下成分（终浓度）配制 600 μl 洗脱缓冲液（为亲和基质体积的 6 倍）：0.5% BSA、0.25 mg/ml FLAG 多肽（用于抗 FLAG M2 琼脂糖）或 10 mM D-生物素（用于链霉亲和素琼脂糖）。
    注意：对于 GFP-Trap_A 和抗 HA 基质，不建议进行洗脱，因此直接进入步骤 3.11，即在 1× SDS-PAGE 上样缓冲液中煮沸。
  3. 在 4 °C 下离心沉淀亲和基质（1,000 × g，5 分钟）。
  4. 取部分未结合的提取物用于免疫印迹分析，弃去其余上清液，仅保留约 500 μl 于管底。
  5. 使用宽口吸头重悬浆液。
  6. 将两管中的混合浆液转移至一个 1.5 ml 离心管中。
    注意：此后均使用 1.5 ml 低蛋白结合微离心管。
  7. 使用台式离心机脉冲离心 3 次，每次 5 秒，以沉淀亲和基质并去除上清液。
  8. 用 1 ml 冷缓冲液 D 洗涤 3–5 次。每次洗涤后按前述方法沉淀亲和基质并弃去上清液。最后一次洗涤时，使用注射器针头吸除多余的缓冲液 D。
    注意：可使用含 0.1% IGEPAL 的缓冲液 D 进行最终洗涤，以进一步减少非特异性结合。
  9. 用适当的洗脱缓冲液（抗 FLAG M2 或链霉亲和素琼脂糖参见步骤 3.2）洗脱 3 次，每次 200 μl，振荡孵育 5 分钟。
  10. 将 3 次洗脱液合并至同一管中。使用 30 μl 吸附树脂浓缩蛋白。涡旋混匀，静置 5 分钟，然后离心沉淀树脂（10,000 × g，2 分钟）。弃去上清液。
    注意：对于 GFP-Trap_A 和抗 HA 琼脂糖，跳过步骤 3.9 和 3.10。
  11. 向沉淀的亲和基质或吸附树脂中加入 50 μl 1× SDS-PAGE 上样缓冲液。涡旋混匀后，在金属浴中 80–100 °C 煮沸 10 分钟。
  12. 将煮沸后的亲和基质或树脂在 10,000 × g 下离心 2 分钟。取 5 μl 上清液用于免疫印迹分析，并将各组分上样至长约 ~10 cm 的 SDS-PAGE 胶进行电泳（图 2）。
  13. 若需进一步分离以通过质谱鉴定磷酸化蛋白，可将剩余的 45 µl 上样至长约 ~19 cm 的 SDS-PAGE 胶（图 2）。
    注意：可在各样品之间留出空泳道，以减少样品间的交叉污染。

4. 蛋白质消化

  1. 使用胶体考马斯亮蓝（cCBB）染色液对SDS-PAGE凝胶进行染色。
    注意：尽量减少对凝胶的操作，以降低角蛋白污染的风险。确保所有设备和工具均未用于免疫印迹或其他可能导致残留蛋白质污染的操作。
  2. 用大量水充分漂洗凝胶，建议过夜。用洁净的刀片从凝胶中切下目标条带。
    注意：如有必要，将凝胶与免疫印迹对齐以定位正确区域。由于磷酸化可能延缓蛋白质在SDS-PAGE中的迁移，因此应切割目标条带上下方紧邻的区域。
  3. 将凝胶切片切成 2-4 mm 的小块（这能确保凝胶被管内溶液完全覆盖，同时避免堵塞移液器吸头）。放入离心管中。
  4. 估算保持凝胶孔内液体浸没所需的体积。该体积用于衍生化、蛋白酶孵育及肽段提取步骤，而洗涤步骤则使用两到三倍体积。
    注意：在含有约 100 μl 切胶样品的典型消化反应中，使用 500 μl 溶液进行洗涤，180 μl 脱水两次，150 μl 用于还原，120 μl 用于烷基化，120 μl 用于消化。
  5. 用50%乙腈（溶于50 mM碳酸氢铵，ABC）清洗凝胶条2次，每次20分钟（或直至脱色完全）。用移液器小心吸去溶液，注意勿吸出凝胶条。
  6. 用100%乙腈脱水5分钟，去除游离液体。
    注意：凝胶应呈现收缩且发白的状态。如果蓝色仍未褪去，需在乙腈/ABC 中延长孵育时间，和/或在较高温度（45–55 °C）下孵育。
  7. 加入10 mM DTT水溶液以还原蛋白质二硫键，56 ºC振荡孵育30–45分钟。去除游离液体。
  8. 加入55 mM氯乙酰胺（溶于50 mM ABC中），室温避光孵育20–30分钟，使半胱氨酸残基烷基化。去除游离液体。
  9. 用50%乙腈（溶于50 mM ABC中）清洗凝胶碎片，每次10分钟，共洗两次。去除残留液体。
  10. 用100%乙腈脱水凝胶碎片5分钟，去除游离液体。
  11. 进行胰蛋白酶消化时，加入40 μl胰蛋白酶工作液（含100 ng胰蛋白酶的消化缓冲液：50 mM ABC，5%乙腈，适用于平均染色强度的考马斯亮蓝条带）。让胶粒在溶液中再水合10分钟。如需要，可补充消化缓冲液至完全覆盖胶粒。37 ºC孵育过夜（O/N）。
  12. 为终止消化并从胶粒中提取肽段，加入5%甲酸（溶于50%乙腈中）（加入体积与消化液体积相等），超声处理5–10分钟。将上清液转移至新管中，重复提取3次。
  13. 通过冷冻干燥（首选）或真空浓缩仪（如 Speed-Vac 或 Savant）干燥多肽。于 -20 ºC 保存。
  14. 提交样品进行质谱分析。
    注意：我们将样品提交至塞恩斯伯里实验室（英国诺里奇）的质谱分析平台。各质谱平台的操作流程差异较大，但通常情况下，肽段在上样至与电喷雾串联质谱联用的液相色谱系统前，需溶解于含0.2%三氟乙酸和2%乙腈的溶液中。

结果

本文介绍了一种从稳定转基因拟南芥（A. thaliana）株系或在本氏烟草（N. benthamiana）中瞬时表达蛋白后纯化标签蛋白的方案。如图1所示，目标蛋白的纯化与质谱分析相结合，可用于鉴定与目标蛋白相互作用的蛋白及其翻译后修饰（PTMs）。该方案最初设计用于植物免疫相关蛋白的纯化及其翻译后修饰的鉴定，但也可适用于任何带标签植物蛋白的纯化。

以纯化N. benthamiana中的Prf/Pto复合物为例。我们使用表达35S:Pto的转基因N. benthamiana株系38-1254，瞬时转化35S:Prf-FLAG，并通过抗FLAG M2琼脂糖树脂进行免疫沉淀（图2A）。图2A中的免疫印迹（IB）显示，大部分目标蛋白（Prf）已被成功免疫沉淀。Pto及其相互作用的效应蛋白AvrPtoB与Prf共纯化，并通过抗体和质谱分析检测到（图2A和图2B）。我们发现，当Pto与效应子构建体35S:AvrPto和35S:AvrPtoB共表达时，其在SDS-PAGE凝胶上的迁移速度更慢（图2A）。两种效应蛋白均诱导了Prf相互作用蛋白Pto的迁移减缓（图2A）。这种依赖效应子识别的Pto迁移减缓现象此前被认为与磷酸化有关，因为经磷酸酶处理后该现象可被消除44。为了鉴定导致Pto迁移减缓的磷酸化位点，我们对与Prf共纯化的Pto进行了质谱分析。尽管Pto表达量较高且可通过免疫印迹轻松检测，但我们仅获得了覆盖Pto序列57%的肽段，并未能鉴定出任何磷酸化位点（图2B）。

随后，我们改变策略，改用抗FLAG抗体靶向Pto蛋白。将N. benthamiana野生型植株瞬时转化35S:Prf-3HA和35S:Pto-FLAG，并分别共转化或不共转化35S:AvrPto与35S:AvrPtoB。利用抗FLAG M2琼脂糖沉淀总Pto蛋白（包括与Prf结合的形式和游离形式），随后进行SDS-PAGE分离、胶内胰蛋白酶消化及质谱分析（图2C）。通过该方法，我们鉴定出覆盖Pto蛋白序列约80%的肽段，以及一个未知的100 kDa互作蛋白。我们鉴定出Pto肽段187-202和188-202的一系列单磷酸化和双磷酸化位点（表1）。其中Ser-198和Thr-199为主要的磷酸化位点，但也检测到其他磷酸化位点（表1）。最重要的是，仅在存在效应蛋白AvrPto或AvrPtoB时，才检测到Ser-198和Thr-199的双磷酸化修饰（表1）。我们近期已鉴定出一组类似的Pto磷酸化位点，并阐明了双磷酸化事件在信号转导中的重要意义47。按照本文所述方案，我们能够鉴定目标蛋白磷酸化状态的动态变化。

Protein expression and extraction workflow; immunoprecipitation, electrophoresis, mass spectrometry.
图1. 通用实验设计。 用于免疫沉淀（IP）的目标蛋白带有标签并得以表达 在植株中，瞬时在 Nicotiana benthamiana 或稳定地在 拟南芥蛋白提取后，利用亲和基质对目标蛋白进行免疫沉淀。通过电泳将蛋白在丙烯酰胺凝胶上分离。切下凝胶条带，从凝胶条带中提取蛋白并进行质谱分析。鉴定磷酸化位点及相互作用蛋白。 单击此处查看大图。

Protein interaction analysis; immunoblot; SDS-PAGE results; Prf, AvrPtoB, Pto; molecular weight bands.
图2. Prf 和 Pto 免疫共沉淀。 A）。该构建体 35S:Prf-FLAG 在38-12细胞系中瞬时表达35S:Pto）以及空载体（EV）， 35S:AvrPto 或 35S:AvrPtoB接种后第三天，使用抗FLAG亲和树脂免疫沉淀Prf。随后进行Prf、AvrPtoB和Pto的免疫印迹（IB）检测。如Pto免疫印迹图底部箭头所示，AvrPto和AvrPtoB可诱导Pto迁移速率变慢。 B）。构建体 35S:Prf-FLAG 在38-12细胞系中瞬时表达35S:Pto）以及空载体（EV）， 35S:AvrPto 或 35S:AvrPtoB接种后第三天，使用抗FLAG琼脂糖对Prf进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE分离。凝胶用胶体考马斯亮蓝（cCBB）染色，将可见的Prf、Pto和AvrPtoB蛋白条带从凝胶中切下，进行质谱分析。图中所示为质谱鉴定到的Pto和Prf序列的肽段覆盖百分比。 C）。这些构建体 35S:Prf-3xHA 和 35S:Pto-FLAG 与……共同瞬时表达 35S:AvrPtoB, 35S:AvrPto 或空载体（EV）在 N. benthamiana接种后第三天，使用抗FLAG琼脂糖对Pto-FLAG进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE分离。将凝胶上可见的Pto及Pto互作蛋白条带切下，进行质谱分析。在胶体考马斯亮蓝染色（cCBB）凝胶中，Pto和100 kDa的Pto互作蛋白条带清晰可见，而Prf条带可见度略低（如箭头所示）。IP：免疫沉淀；IB：免疫印迹；CBB：考马斯亮蓝染色；cCBB：胶体考马斯亮蓝染色。 单击此处查看大图。

Prf
EVAvrPtoAvrPtoB
Pto 肽段 188-202
GTELDQ[pT195]HLSTVVK110
GTELDQTHL[pS198]TVVK1075
GTELDQTHLS [pT199]VVK834
G[pT190]ELDQTHLS[pT199]VVK012
GTELDQTHL[pS198][pT199]VVK084
GTELDQTHLSTVVK462648
Pto 肽段 187-202
KGTELDQ[pT195]HLS TVVK010
KGTELDQTHL[pS198]TVVK171712
KGTELDQTHLS[pT199]VVK422
KGTELDQ[pT195]HLS [pT199]VVK011
KGTELDQTHL[pS198][pT199]VVK075
KGTELDQTHLSTVVK213718
肽段 187-202 和 188-202838850
含有两个磷酸化事件的肽段百分比0%26.9%11.2%
Pto 序列覆盖率78%79%82%

表1. 信号激活后Pto肽段的双重磷酸化。 在本氏烟草（N. benthamiana）中瞬时共表达35S:Prf-3xHA和35S:Pto-FLAG，同时分别共表达空载体（EV）、35S:AvrPto或35S:AvrPtoB。侵染后三天，使用抗FLAG亲和基质免疫沉淀总Pto-FLAG蛋白，并通过SDS-PAGE分离。将胶体考马斯亮蓝染色凝胶上可见的Pto条带切下，进行质谱分析。图中显示了检测到的未发生、发生一次和两次磷酸化的Pto肽段数量。

缓冲液列表
L 培养基胰蛋白胨10 g/L
酵母提取物5 g/L
NaCl5 g/L
D-葡萄糖1 g/L
农杆菌浸润缓冲液MgCl210 mM
MES10 mM
调至 pH 5.5
乙酰丁香酮（可选）150 μM
缓冲液 ATris-HCl pH 7.5150 mM
NaCl150 mM
EDTA5 mM
EGTA2 mM
甘油5% (v/v)
缓冲液 B缓冲液 A
PVPP2% (w/v)
缓冲液 C缓冲液 B
二硫苏糖醇（DTT）10 mM
植物蛋白酶抑制剂混合物1% (v/v)
苯甲基磺酰氟（PMSF）0.5 mM
杯状菌素 A50 nM
氟化钠（NaF）50 mM
钼酸钠（Na2MoO4）10 mM
正钒酸钠1 mM
冈田酸100 nM
缓冲液 D不含 PVPP 的缓冲液 C
5x SDS-PAGE 上样缓冲液Tris-HCl pH 6.860 mM
SDS2%
甘油0.15%
溴酚蓝0.10%
DTT（使用前加入）50 mM

表2. 缓冲液和培养基配方。

讨论

阐明PAMPs和效应子激活受体的机制，可极大地促进我们对植物免疫的理解。在过去的20年中，遗传学筛选和酵母双杂交技术在发现PRR和NB-LRR蛋白方面发挥了关键作用。近年来，基于质谱的技术方法已建立，用于鉴定免疫信号转导过程中差异调控的蛋白质55-58、其翻译后修饰11,33,59,60、免疫复合物的组成61以及效应子的作用靶点62。本文中，我们描述了一种用于鉴定调控免疫复合物激活的翻译后修饰的简便实验方案。

与先前描述的方案相比，本方案能够详细鉴定翻译后修饰（PTMs）的动态变化。大规模蛋白质组学方法的方案虽可鉴定蛋白质的翻译后修饰，但由于蛋白量有限，无法揭示翻译后修饰的位点可塑性。以蛋白质磷酸化为例，大规模蛋白质组学方法通常仅能鉴定出主要的磷酸化位点11,33,59。要对蛋白质磷酸化状态进行详细表征，需要大量蛋白，而这些蛋白只能通过部分纯化目标蛋白获得47。本文所述方案结合了可获得大量目标蛋白的蛋白纯化方法，并对纯化后的蛋白进行质谱分析。按照本方案，Pto蛋白的单个磷酸化事件主要归因于Ser-198，这与先前报道一致52；但部分质谱图谱也支持Thr-195或Thr-199上存在单个磷酸化事件。当观察到Pto蛋白发生双重磷酸化时，主要的磷酸化氨基酸组合为Ser-198和Thr-199，尽管也观察到其他位点的组合（表1）。这些结果明确展示了蛋白激酶磷酸化位点的可塑性，以及本方案在详细表征所有可能磷酸化位点方面的优势。

本实验方案中最关键的步骤包括：1）充分提取蛋白质；2）保护翻译后修饰（PTMs）；3）获得足够量的目标蛋白。首先，为了充分提取蛋白质，必须在液氮中研磨组织，随后按照本方案所述使用组织匀浆器。若无组织匀浆器，也可使用研钵和研杵。同时，使用1克组织对应3（或4）倍体积提取缓冲液的比例非常重要。该组织与缓冲液体积比，结合我们推荐的高强度缓冲液，可确保提取过程中pH保持中性。我们发现，这一点在拟南芥（A. thaliana）和番茄的蛋白提取中尤为关键52。为保护翻译后修饰，应在所有缓冲液中加入能够抑制可去除PTMs的酶类的适当抑制剂。此外，所有操作步骤均需在4 °C下进行，并预先将缓冲液和仪器预冷。通过使用表达目标蛋白至足够水平的植物材料以及使用较大量的组织（约20 g），可获得更高的目标蛋白产量。获得足量目标蛋白最关键的步骤是通过直接免疫沉淀富集目标蛋白。这一点在我们尝试通过Prf免疫沉淀检测Pto的翻译后修饰时未能成功得到了印证，原因是共免疫沉淀获得的Pto蛋白量有限（图2B）。相比之下，对Pto进行直接免疫沉淀获得了显著更多的可检测肽段（图2C），实现了约80%的蛋白序列覆盖，并成功鉴定出多个翻译后修饰位点（表1）。我们还强烈建议在蛋白免疫沉淀中使用表位标签。与针对天然蛋白制备的抗体相比，使用表位标签亲和基质通常可以获得更高产量的部分纯化蛋白。在使用针对天然Pto蛋白制备的抗体51（图2A）进行免疫沉淀时，我们仅能鉴定到Pto两个主要磷酸化位点中的一个磷酸化修饰。

该方案主要针对部分纯化 N. benthamiana 细胞质蛋白及其磷酸化位点的后续鉴定. 然而，通过采用本文所述的改进方法，该方案可轻松地进行调整以适用于 A. thaliana 蛋白质和膜结合蛋白。本实验方案的主要目标是获得足量的目标蛋白，以用于翻译后修饰（PTMs）的鉴定，而非获得最高纯度的蛋白复合物。如果需要更高纯度的复合物，可在本方案基础上增加第二步纯化步骤。52在此情况下，第一步可使目标蛋白在不使用高盐或酸性条件的情况下从亲和基质中洗脱，而后续步骤可能涉及需要剧烈洗脱条件的基质。需要强调的是，我们仅针对磷酸化位点的鉴定对该方案进行了测试，目前正在进行其用于其他翻译后修饰精细鉴定能力的验证。

我们的代表性结果清楚地展示了蛋白激酶磷酸化位点的可塑性，以及本方案在表征磷酸化位点方面的有效性。最重要的是，这些结果强调了仅依赖微量蛋白质通过质谱分析或通过自磷酸化位点的单点突变来鉴定磷酸化位点，可能会导致令人困惑的结果。我们在此前的研究47中已表明，Pto蛋白在Ser-198和Thr-199位点的双重磷酸化与Prf/Pto复合物的激活相关。然而，先前发表的研究47,63显示，将Ser-198和Thr-199突变为丙氨酸（阻止这些位点的磷酸化）的单点突变仍具有信号传导能力，提示这些位点的磷酸化并非复合物激活的必要条件。这一矛盾现象现在可以通过次级位点Thr-195的磷酸化来解释。通过本方案，也可获得对其他蛋白激酶磷酸化位点可塑性的类似认识。此外，结合使用磷酸化位点突变、可抑制特定激酶的蛋白（效应因子）、蛋白质免疫共沉淀及质谱分析的综合方法，将有助于更深入理解蛋白激酶磷酸化位点可塑性的进化意义。

披露

作者声明不存在任何竞争利益（经济或其他方面）。

致谢

VN 由英国皇家学会资助。JPR 是澳大利亚研究理事会未来研究员（FT0992129）。我们感谢 Miriam Gifford 博士对稿件的审阅。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MgCl2西格玛M8266
MES西格玛M8250
乙酰丁香酮西格玛D134406有毒 —— 以DMSO配制1 M储存液
1 ml无菌注射器泰尔茂
注射器针头泰尔茂NN-2525R
Silwet L-77（表面活性剂）Lehle SeedsVIS-01有毒
MG-132（Z-Leu-Leu-Leu-al）西格玛C2211以DMSO配制1 M储存液，-80 °C保存
MS盐西格玛M5524具有氧化性，有毒
蔗糖西格玛16104
Trizma碱西格玛T1503用1 N HCl调节pH，配制1 M Tris-HCl缓冲液
NaCl西格玛S30145 M储存液
EDTA西格玛E6758有毒 —— 0.5 M储存液
EGTA西格玛E4378
甘油National DiagnosticsEC-606
IGEPAL CA-630西格玛I8896腐蚀性
PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮）西格玛P5288勿与PVP混淆
DTT（DL-二硫苏糖醇）西格玛43815有毒 —— 1 M储存液，-20 °C保存
植物蛋白酶抑制剂混合物西格玛P9599避免反复冻融
PMSF（苯甲基磺酰氟）西格玛P7626腐蚀性，有毒
赤霉素ACell Signaling Technology9902
氟化钠（NaF）西格玛S7920有毒 —— 1 M储存液
钼酸钠（Na2MoO4）西格玛S66460.5 M储存液
正钒酸钠（Na3VO4）西格玛450243有毒 —— 配制200 mM正钒酸钠溶液。使用1 N NaOH或1 N HCl将pH调节至10.0。正钒酸钠溶液的初始pH可能因试剂批次不同而异。在pH 10.0时，溶液呈黄色。将溶液煮沸至无色（约10分钟）。冷却至室温。重新调节pH至10.0，并重复上述步骤，直至溶液保持无色且pH稳定在10.0。 
冈田酸Santa Cruz Biotechnologysc-3513
Kinematica Polytron组织匀浆器费舍尔科学08-451-320
Miracloth默克密理博475855-1R
抗FLAG M2琼脂糖西格玛A2220推荐使用该介质
链霉亲和素-琼脂糖赛默飞世尔科技20347推荐使用该介质
GFP-Trap_AChromotekgta-20推荐使用该介质
抗HA-琼脂糖西格玛A2095推荐使用该介质
0.45 μm滤膜VWR513-1902
BSA西格玛A7906
FLAG肽西格玛F3290
D-生物素西格玛47868
StrataClean树脂安捷伦400714推荐用于蛋白质沉淀的吸附树脂
Mini-PROTEAN Tetra电泳槽伯乐
PROTEAN II XL电泳槽伯乐
SimplyBlue SafeStain英潍捷基LC6060推荐使用该染色剂
低吸附蛋白管（LoBind）艾本德0030 108.116推荐使用此类管
碳酸氢铵（ABC）西格玛9830有毒
乙腈VWR83639有毒，易燃
2-氯乙酰胺西格玛22790有毒
胰蛋白酶普洛麦格V5280刺激性，致敏性
甲酸西格玛14265有毒，腐蚀性
水浴超声仪UltravaweUltra BT Ultrasonic Bath
LTQ-Orbitrap XL赛默飞世尔科技
曲古抑菌素A西格玛T8552有毒

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