微加工通道中细胞迁移的研究

摘要

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。

摘要

本文所述方法可用于研究细胞在三维受限条件下的一维迁移。该方法基于使用微加工通道，通过物理限制使细胞呈现极化表型。一旦进入通道，细胞仅能沿两个方向移动：向前或向后。这种方向受限的简化迁移模式有利于对细胞进行自动追踪，并提取描述细胞运动的定量参数，包括细胞迁移速度、运动方向的变化以及运动过程中的暂停行为。微通道还可与荧光标记技术兼容，因此适用于在高分辨率下研究细胞迁移过程中细胞器和细胞内结构的定位。此外，通道表面可功能化修饰不同底物，从而调控通道的黏附特性，或用于研究趋触性。总之，本系统旨在分析大量细胞在几何结构和生化环境均受控条件下的迁移行为，有助于不同实验之间的标准化和结果重复性。

引言

迁移是一种复杂的细胞功能，在多细胞生物的多种生理过程中具有重要作用，包括发育、免疫反应和组织再生。此外，某些病理情况（如肿瘤侵袭和转移）也依赖于细胞运动能力¹。因此，细胞迁移已成为基础研究和转化研究中的一个重要研究领域。体内大多数组织具有丰富的细胞外基质和高细胞密度，因此在生理条件下，细胞迁移发生在复杂的受限环境中。传统上，由于历史原因和技术限制，细胞迁移研究主要在二维平面系统中进行，而这类系统无法重现组织中的许多环境特性（例如空间限制）。此外，最近研究表明，在二维条件下对运动至关重要的因素（如细胞黏附）在体内或凝胶内部的迁移过程中并非必需，提示调控二维环境与其他环境中细胞运动的机制存在差异²。目前已开发出多种系统用于模拟组织的复杂特性，其中最著名的是胶原凝胶，旨在重现细胞外基质的组成特性³。本文提出微通道作为一种简单且互补的方法，可在受限环境中实现一维条件下的细胞迁移研究。

在此系统中，细胞会沿着微通道自发迁移进入其中。迁移中的细胞随后会获得通道的形状，形成一种管状几何结构，这很可能增强了细胞的极性。细胞在通道中的线性运动使得能够自动追踪细胞，并从实验中提取定量参数。从技术角度来看，该系统操作简便且灵活。可对通道壁进行不同的包被处理，通道的尺寸和形状也可根据需要调整，单次实验即可分析大量细胞。该系统还可扩展用于中等通量的分子筛选分析，以研究参与细胞运动的相关分子。本文所述的....

方案

重要提示：本实验方案假设用于形成目标微通道的模具已经制备完成。有关模具制备的更多信息已有文献发表¹⁰。本实验方案还假设读者已掌握骨髓来源树突状细胞（DCs）的培养技术。

1. 芯片制备

1. 在塑料杯中按10:1的质量比混合PDMS油和固化剂，充分搅拌均匀。
2. 将混合物浇注到带有微通道的模具上，总高度应控制在0.5–1 cm之间。
3. 将模具放入真空干燥器中，抽气1小时以去除气泡。
4. 将模具置于65 °C烘箱中加热2小时，使PDMS固化成型。
5. 待PDMS冷却至室温后，用手术刀在结构周围切下较大一块，并从模具上小心剥离（图1A）。
6. 在细胞注入位置钻孔（通常为2 mm），并用手术刀修整PDMS芯片大小，使其适配将用于评估细胞迁移的玻璃底培养皿（图1B）。操作前，使用镜头清洁纸清除培养皿表面残留的灰尘，以利于后续步骤1.10中PDMS与玻璃的键合。
7. 通过在PDMS芯片通道结构的两侧反复粘贴并撕下胶带，清洁已修整的PDMS芯片表面。
8. 将PDMS部件在70%乙醇中进行超声处理30秒，以去除灰尘和微小的PDMS颗粒；随后用洁净空气快速吹干。
9. 使用空气（或氧气）等离子体处理30秒（压力为300 mTo....

结果

在每次实验中，将根据研究目的选择适当的分子对PDMS表面进行包被。图2展示了在洗涤前后（步骤2.4）用荧光分子PLL-g-PEG包被的微通道。此类实验可用于检测微通道内包被的均匀性。

细胞加载后，可通过视频显微镜观察细胞迁移过程。图3A展示了树突状细胞在微通道中迁移的示例，其密度适合用于追踪细胞。相衬成像和Hoechst染色均可用于此目的（见讨论部分）。该技术也可与高分辨率荧光共聚焦显微镜兼容，可用于追踪细胞器或细胞结构。图4B展示了表达LifeActGFP的迁移树突状细胞中聚合肌动蛋白动态变化的一个示例。

迁移性树突状细胞中细胞运动性分析的定量示例显示于 图5. 图 5A 显示从野生型（WT）或经Y27632处理的树突状细胞（DCs）生成的显微轨迹图。Y27632是一种特征明确的细胞收缩性和迁移性抑制剂，本研究中用于验证该系统检测细胞运动速度变化的能力。这些.......

讨论

本文介绍一种由微通道组成的装置，可用于在单次实验中研究大量细胞的迁移特性。该实验系统模拟了内源性迁移细胞在组织中所遇到的受限环境条件。然而，通过迫使细胞沿单一维度迁移，该装置便于实现自动化的细胞追踪以及可测量参数的提取（图5）。我们还证明，该装置与荧光显微镜兼容，因此可适用于研究细胞运动不同阶段中细胞器的定位情况（图4）。

该方案中的一个关键步骤是通道的质量。必须确保PDMS在玻璃表面的良好粘附性。当出现粘附问题时，首先应检查两个表面的清洁度以及等离子清洗仪的清洁状况。另一个可能至关重要的参数是接种细胞的密度。细胞的自发迁移需要细胞与通道之间保持较近的距离，以促进其进入管道，而针对每种细胞类型均应评估其最佳接种数量。

例如，我们展示了树突状细胞（DCs）的自发迁移，但该系统也可用于分析其他细胞类型的迁移。在实验室中，我们已测试了原代T淋巴细胞、巨噬细胞以及 肿瘤细胞系（数据未展示，参见文献^7-9）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	GE Silicones	RTV615	含90%硅胶基础成分和10%固化剂的包装
核心样品切割器	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	直径2.5 mm
玻璃底培养皿	WPI	Fluorodish FD 35-100
超声波清洗机	Branson Ultrasonics	Branson 200
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC 32 G	适用于小型样品（35个培养皿），也可提供更大规格型号
牛血浆来源纤连蛋白	Sigma Aldrich	F0895
聚赖氨酸接枝聚乙二醇（Pll-g-PEG）	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254