本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。
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本文内容
摘要
摘要
本文所述方法可用于研究细胞在三维受限条件下的一维迁移。该方法基于使用微加工通道，通过物理限制使细胞呈现极化表型。一旦进入通道，细胞仅能沿两个方向移动：向前或向后。这种方向受限的简化迁移模式有利于对细胞进行自动追踪，并提取描述细胞运动的定量参数，包括细胞迁移速度、运动方向的变化以及运动过程中的暂停行为。微通道还可与荧光标记技术兼容，因此适用于在高分辨率下研究细胞迁移过程中细胞器和细胞内结构的定位。此外，通道表面可功能化修饰不同底物，从而调控通道的黏附特性，或用于研究趋触性。总之，本系统旨在分析大量细胞在几何结构和生化环境均受控条件下的迁移行为，有助于不同实验之间的标准化和结果重复性。
引言
迁移是一种复杂的细胞功能，在多细胞生物的多种生理过程中具有重要作用，包括发育、免疫反应和组织再生。此外，某些病理情况（如肿瘤侵袭和转移）也依赖于细胞运动能力1。因此，细胞迁移已成为基础研究和转化研究中的一个重要研究领域。体内大多数组织具有丰富的细胞外基质和高细胞密度，因此在生理条件下，细胞迁移发生在复杂的受限环境中。传统上，由于历史原因和技术限制，细胞迁移研究主要在二维平面系统中进行，而这类系统无法重现组织中的许多环境特性（例如空间限制）。此外，最近研究表明，在二维条件下对运动至关重要的因素（如细胞黏附）在体内或凝胶内部的迁移过程中并非必需，提示调控二维环境与其他环境中细胞运动的机制存在差异2。目前已开发出多种系统用于模拟组织的复杂特性，其中最著名的是胶原凝胶，旨在重现细胞外基质的组成特性3。本文提出微通道作为一种简单且互补的方法，可在受限环境中实现一维条件下的细胞迁移研究。
在此系统中，细胞会沿着微通道自发迁移进入其中。迁移中的细胞随后会获得通道的形状，形成一种管状几何结构，这很可能增强了细胞的极性。细胞在通道中的线性运动使得能够自动追踪细胞，并从实验中提取定量参数。从技术角度来看，该系统操作简便且灵活。可对通道壁进行不同的包被处理，通道的尺寸和形状也可根据需要调整，单次实验即可分析大量细胞。该系统还可扩展用于中等通量的分子筛选分析，以研究参与细胞运动的相关分子。本文所述的实验方案已采用树突状细胞（DC）作为细胞模型进行了标准化。树突状细胞在免疫系统中具有关键作用，因其参与特异性免疫应答的启动和维持4。体外研究表明，DC可在受限环境中自发迁移，因此是研究微通道中细胞运动的良好模型5,6。重要的是，该系统也可推广用于分析其他任何运动型细胞的迁移，如T淋巴细胞、中性粒细胞或肿瘤细胞7-9。
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方案
重要提示：本实验方案假设用于形成目标微通道的模具已经制备完成。有关模具制备的更多信息已有文献发表10。本实验方案还假设读者已掌握骨髓来源树突状细胞（DCs）的培养技术。
1. 芯片制备
- 在塑料杯中按10:1的质量比混合PDMS油和固化剂，充分搅拌均匀。
- 将混合物浇注到带有微通道的模具上，总高度应控制在0.5–1 cm之间。
- 将模具放入真空干燥器中，抽气1小时以去除气泡。
- 将模具置于65 °C烘箱中加热2小时，使PDMS固化成型。
- 待PDMS冷却至室温后，用手术刀在结构周围切下较大一块，并从模具上小心剥离（图1A）。
- 在细胞注入位置钻孔（通常为2 mm），并用手术刀修整PDMS芯片大小，使其适配将用于评估细胞迁移的玻璃底培养皿（图1B）。操作前，使用镜头清洁纸清除培养皿表面残留的灰尘，以利于后续步骤1.10中PDMS与玻璃的键合。
- 通过在PDMS芯片通道结构的两侧反复粘贴并撕下胶带，清洁已修整的PDMS芯片表面。
- 将PDMS部件在70%乙醇中进行超声处理30秒，以去除灰尘和微小的PDMS颗粒；随后用洁净空气快速吹干。
- 使用空气（或氧气）等离子体处理30秒（压力为300 mTorr），对PDMS（结构面朝上）和培养皿表面进行活化。
- 将两个活化后的表面紧密接触，使PDMS永久键合至基底。如有需要，可使用金属镊子轻轻按压PDMS顶部，以确保聚合物与培养皿玻璃充分接触（图1C）。
- 将键合后的芯片置于65 °C烘箱中孵育1小时，以增强键合强度。
2. 微通道的包被
- 在300 mTorr条件下用空气等离子体激活整个结构1分钟。此步骤将促进下一步液体进入通道。
- 迅速用浓度为10 μg/ml的纤维连接蛋白水溶液填充芯片的进样孔。可使用其他底物（如PEG）来调节细胞在通道壁上的黏附性。注意观察液体是否扩散至整个结构，可通过普通光线下肉眼观察或使用常规明场显微镜检查。
注意：在非常小的结构中，由于扩散较困难，可通过将结构置于真空钟罩内至少15分钟，强制液体进入通道。为验证包被效率，可使用荧光底物（图2）。 - 室温孵育1小时，使纤维连接蛋白或其他包被底物吸附到通道壁上。
- 用PBS洗涤结构3次，以去除未结合的底物。
- 洗涤后，立即进行方案3，或将芯片在4 °C保存以备后续使用（最多24小时）。
3. 细胞加载
- 从孔板中移除 PBS，并用细胞培养基填充微系统。孵育 1 小时，使培养基充分浸润通道。
注意：对于涉及分子抑制剂等药物的实验，建议预先用含有适当浓度药物的培养基对通道进行预孵育。此外，某些药物倾向于溶解于 PDMS 结构中，从而降低其有效浓度。已有若干策略被提出以应对这一问题11-12。 - 通过培养基冲洗去除未贴壁的树突状细胞（DCs），并回收半贴壁细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
注意：若需进行细胞核成像，可在继续实验步骤前进行 Hoechst 33342 染色，方法为将 2 × 106 个细胞与 200 ng/ml 染料在完全培养基中孵育 30 分钟。染色后通过两次离心洗涤以去除多余染料。 - 将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟（时间和转速可根据细胞类型调整），弃去上清液。重悬细胞沉淀，调节浓度至 20 × 106 个细胞/ml。
- 从孔板中移除多余的培养基，并使用微量移液器吸出 PDMS 结构中的进样孔内液体。向每个进样孔中加入 5 µl 细胞悬液，使每孔含有 1 × 105 个细胞。
注意：较高的细胞密度有助于促进细胞与通道的接触。细胞密度过低可能导致进入通道内的细胞数量不足，进而导致实验失败。 - 将微芯片置于培养箱中，在 37 °C 下孵育 30 分钟。向实验培养皿中加入 2 ml 完全培养基。
注意：必须确保整个 PDMS 结构被培养基覆盖，以防止实验过程中细胞干燥。若 2 ml 不足以完全覆盖，应补充更多培养基以确保完全浸没 PDMS 结构。
4. 成像
- 将培养皿放置于显微镜下之前，先用镜头清洁纸擦拭其外底部表面。
- 为分析大量细胞的迁移情况，应在配备 CO2 和温控装置的视频显微镜下使用 10X 放大倍数和宽场照明（图3）。为便于细胞追踪，可使用 Hoechst 染色结合紫外光（见步骤 3.2）。也可采用共聚焦显微镜进行迁移分析，以获得细胞迁移过程中更高分辨率的细胞结构图像。
- 进行 10X 条件下的延时显微观察 时，应根据预期的细胞移动速度选择合适的时间间隔（例如，对于以约 5 μm/min 速度迁移的树突状细胞，通常设为 2 分钟）。
注意： 本文所述方案不包含细胞迁移参数的分析。讨论部分列出了一些要点，以指导读者如何从延时成像视频中提取相关信息。
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结果
在每次实验中，将根据研究目的选择适当的分子对PDMS表面进行包被。图2展示了在洗涤前后（步骤2.4）用荧光分子PLL-g-PEG包被的微通道。此类实验可用于检测微通道内包被的均匀性。
细胞加载后，可通过视频显微镜观察细胞迁移过程。图3A展示了树突状细胞在微通道中迁移的示例，其密度适合用于追踪细胞。相衬成像和Hoechst染色均可用于此目的（见讨论部分）。该技术也可与高分辨率荧光共聚焦显微镜兼容，可用于追踪细胞器或细胞结构。图4B展示了表达LifeActGFP的迁移树突状细胞中聚合肌动蛋白动态变化的一个示例。
迁移性树突状细胞中细胞运动性分析的定量示例显示于 图5. 图 5A 显示从野生型（WT）或经Y27632处理的树突状细胞（DCs）生成的显微轨迹图。Y27632是一种特征明确的细胞收缩性和迁移性抑制剂，本研究中用于验证该系统检测细胞运动速度变化的能力。这些...
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讨论
本文介绍一种由微通道组成的装置，可用于在单次实验中研究大量细胞的迁移特性。该实验系统模拟了内源性迁移细胞在组织中所遇到的受限环境条件。然而，通过迫使细胞沿单一维度迁移，该装置便于实现自动化的细胞追踪以及可测量参数的提取（图5）。我们还证明，该装置与荧光显微镜兼容，因此可适用于研究细胞运动不同阶段中细胞器的定位情况（图4）。
该方案中的一个关键步骤是通道的质量。必须确保PDMS在玻璃表面的良好粘附性。当出现粘附问题时，首先应检查两个表面的清洁度以及等离子清洗仪的清洁状况。另一个可能至关重要的参数是接种细胞的密度。细胞的自发迁移需要细胞与通道之间保持较近的距离，以促进其进入管道，而针对每种细胞类型均应评估其最佳接种数量。
例如，我们展示了树突状细胞（DCs）的自发迁移，但该系统也可用于分析其他细胞类型的迁移。在实验室中，我们已测试了原代T淋巴细胞、巨噬细胞以及 肿瘤细胞系（数据未展示，参见文献7-9）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者非常感谢居里研究所（CNRS UMR144）的PICT IBiSA平台。本工作获得了以下机构的资助：欧洲研究理事会向A-M.L-D提供的Strapacemi项目资助（243103），法国国家科研署（ANR-09-PIRI-0027-PCVI），InnaBiosanté基金会向M.P.和A-M.L-D提供的Micemico项目资助，以及欧洲研究理事会Strapacemi青年研究者奖对A-M.L-D的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | GE Silicones | RTV615 | 含90%硅胶基础成分和10%固化剂的包装 |
| 核心样品切割器 | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | 直径2.5 mm |
| 玻璃底培养皿 | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| 超声波清洗机 | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC 32 G | 适用于小型样品（35个培养皿），也可提供更大规格型号 |
| 牛血浆来源纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F0895 | |
| 聚赖氨酸接枝聚乙二醇（Pll-g-PEG） | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
参考文献
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