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基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

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DOI：

10.3791/51105

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2013年12月17日

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1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

本文内容

摘要

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+ T细胞的溶细胞活性。

摘要

CD8+ T细胞的细胞毒活性很少被评估。本文介绍一种新的基于细胞的检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞杀伤负载其同源肽段的CD4+ T细胞的能力。将靶向的CD4+ T细胞分为两个群体，并用两种不同浓度的CFSE进行标记。其中一个群体用目标肽段致敏（CFSE低表达），另一个群体则未致敏（CFSE高表达）。将致敏与未致敏的CD4+ T细胞按相等比例混合后，与不同数量的纯化CD8+ T细胞共同孵育。在与含有抗原特异性效应CD8+ T细胞的CD8+ T细胞共培养后，通过流式细胞术分析自体靶向CD4+ T细胞的特异性杀伤情况，其中抗原特异性效应CD8+ T细胞通过肽段/MHCI四聚体染色进行鉴定。通过在不同效应细胞与靶细胞比例下测定靶向CD4+ T细胞的特异性裂解程度，可计算出溶细胞单位LU30/106细胞。该检测方法简单直接，能够准确测量CD8+ T细胞杀伤靶向CD4+ T细胞的内在能力。

引言

细胞溶解活性是CD8+ T细胞的主要功能，但目前仍很少被检测，因为用于此目的的检测方法繁琐且难以标准化。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为迄今为止尚未发现可有效预测细胞介导的细胞毒性的可靠指标1,2。本文中，我们提出一种新的功能性检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞对靶向CD4+ T细胞的细胞毒活性。已有多种方法被开发出来，以替代传统的“金标准”——铬释放实验。本文介绍的是一种基于细胞的检测方法，能够反映整个杀伤过程，通过测量活靶细胞的死亡情况来实现。该方法源自基于流式细胞术的小鼠体内in vivo4,5和人类体外in vitro6细胞毒检测方案。在本实验方案中，使用总CD8+ T细胞群体中含有的抗原特异性CD8+ T细胞作为效应细胞，同源CD4+ T细胞作为靶细胞。通过MHCI/肽段四聚体7对感兴趣的效应性CD8+ T细胞进行计数。靶细胞的死亡率通过加载肽段与未加载肽段的CD4+ T细胞之间的比例来计算。我们先前已证明，该方法具有可重复性、高灵敏度、高特异性，且不依赖于总CD8+ T细胞群体中效应细胞的数量8。通过在共培养实验中同时对效应细胞和靶细胞进行计数，可计算出CD8+ T细胞杀伤靶细胞的内在能力，并以裂解单位表示9。

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方案

1. 效应CD8+ T细胞的制备

  1. 将自体冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（2-3管，每管50 x 106个细胞）从液氮中取出，放入37 °C水浴中解冻。
  2. 用完全RPMI培养基（含4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和链霉素，并添加10%胎牛血清）将细胞管加至50 ml，洗涤细胞。计数PBMC，并以5 x 106/ml的浓度重悬于完全RPMI培养基中。
  3. 向PBMC中加入特异性肽段（5 µg/ml）和IL-2（10 ng/ml）。
  4. 在96孔深孔板中建立培养体系；每孔接种1 ml细胞悬液。
  5. 培养3天后，更换一半的细胞培养基为新鲜的完全RPMI培养基。
  6. 培养6天后，用多通道移液器收集所有PBMC，并转移至无菌储液槽中。
  7. 计数、洗涤PBMC，并以5 x 107/ml的浓度重悬于14 ml圆底管中的推荐分离缓冲液中。按每毫升细胞加入50 µl人CD8+ T细胞富集混合液。混匀后室温孵育10分钟。再按每毫升细胞加入150 µl磁性颗粒，孵育5分钟。
  8. 通过加入分离缓冲液将细胞悬液体积调整至7 ml。将试管放入磁铁中，进行未接触式CD8+ T细胞的免疫磁分离。5分钟后，保持试管仍在磁铁中，将目标细胞倾倒入新的15 ml锥形管中。取少量细胞样本，在4 °C条件下，用含1X PBS-2% FBS的缓冲液与抗CD3和CD8抗体孵育30分钟。随后可通过流式细胞术检测CD8+ T细胞纯度，预期纯度为95%或更高。
  9. 将CD8+ T细胞重悬于450 µl完全RPMI培养基中。
  10. 向5个螺帽管中各加入225 µl完全RPMI培养基。
  11. 通过将225 µl CD8+ T细胞悬液转移至下一管，进行系列稀释（从1:2至1:32）（见 图1 上图）。

2. 靶向CD4+ T细胞的制备

  1. 将自体冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（1 小瓶，含 50 × 106 个细胞）从液氮中取出，转移至 37 °C 水浴中解冻。
  2. 将细胞悬液转移至含有 10 ml RPMI 培养基的 50 ml 圆底离心管中。
  3. 用分离缓冲液洗涤细胞，并将 PBMC 重悬于 14 ml 圆底管中，浓度为 5 × 107/ml。按每毫升细胞加入 50 µl 人 CD4+ T 细胞富集混合液，混匀后室温孵育 10 分钟。再按每毫升细胞加入 100 µl 磁性颗粒，室温孵育 5 分钟。
  4. 用分离缓冲液将细胞悬液补至 7 ml。将离心管放入磁架中，开始分离 CD4+ T 细胞。5 分钟后，在保持离心管处于磁架中的情况下，将未被磁性捕获的细胞倾入新的 15 ml 圆底离心管中。取少量细胞 aliquot，用含 CD3 和 CD4 抗体的 1× PBS-2% FBS 溶液在 4 °C 染色 30 分钟，随后通过流式细胞术检测 CD4+ T 细胞纯度，预期纯度应达到 95% 或更高。
  5. 计数 CD4+ T 细胞，将其分装至两个 15 ml 圆底离心管中，并用预热的 1× PBS 洗涤。
  6. 在预热的 PBS 中配制 0.4 µM 的 CFSE 高浓度工作液。
  7. 取部分 10× CFSE 高浓度工作液，用预热的 PBS 稀释，配制 0.04 µM 的 CFSE 低浓度工作液。
  8. 将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 20 × 106/ml（若 CD4+ T 细胞数量少于 10 × 106/ml，则用 0.5 ml PBS 重悬），取一半细胞加入等体积的 0.4 µM CFSE 高浓度工作液（终浓度为 0.2 µM）。例如，1 ml 细胞加入 1 ml CFSE 工作液。剩余另一半 CD4+ T 细胞则加入等体积的 0.04 µM CFSE 低浓度工作液（终浓度为 0.02 µM）。所有细胞在 37 °C、5% CO2 条件下染色 15 分钟。
  9. 染色结束后，以 1,500 rpm 离心 5 分钟，弃上清，用 1 ml 预热的完全 RPMI 培养基重悬细胞，以终止标记反应。
  10. 向 CFSE 低浓度标记的 CD4+ T 细胞中加入目标肽段，终浓度为 5 µg/ml，置于完全 RPMI 培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 分钟。
  11. 用完全 RPMI 培养基洗涤 CFSE 高浓度和低浓度标记的 CD4+ T 细胞，共洗涤两次。洗涤后分别用完全 RPMI 培养基重悬，浓度均为 2 × 105 个细胞/ml。
  12. 将两种目标细胞群体按 1:1 比例混合（CFSE 高浓度 : CFSE 低浓度）（见 图 1 下图）。

3. 共培养

  1. 从每种稀释度的 CD8+ T 细胞中，取 100 µl 加入圆底 96 孔板中，每个样本设两个复孔。
  2. 向每种效应细胞稀释液中加入混合的靶向 CD4+ T 细胞（100 µl），使终体积为 200 µl。
  3. 为检测基础凋亡水平，单独接种靶细胞于 3 个孔中。
  4. 将共培养体系在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 小时。

4. 流式细胞术染色与采集

  1. 将细胞转移至V型底96孔板中，在37 °C、5% CO2条件下，用PE标记的pMHC四聚体染色15分钟。
  2. 用1× PBS-2% FBS洗涤一次，在4 °C避光条件下，用Far Red LIVE/DEAD可固定死细胞染料、αCD3-Alexa700、αCD8-Percp和αCD4-Brilliant Violet 650染色30分钟。
  3. 用1× PBS-2% FBS洗涤细胞一次，重悬于含2%甲醛的1× PBS溶液中，体积为100 µl。
  4. 在流式细胞仪上检测细胞。

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结果

图1中的示意图总结了该检测方法。将纯化的CD8+ T细胞（效应细胞）重悬于450 µl完全RPMI培养基中，并通过将225 µl CD8+ T细胞加入含有225 µl培养基的下一试管中进行系列稀释（上图）。对纯化的CD4+ T细胞（靶细胞）进行计数后，分装至两个试管中，并按照方案所述用两种不同浓度的CFSE（高浓度和低浓度）进行染色。CFSE低染的CD4+ T细胞用目标肽段进行刺激，而CFSE高染的CD4+ T细胞则不加肽段作为对照。将CFSE高染和CFSE低染的CD4+ T细胞均重悬至2 × 105/ml，并以1:1的比例混合（下图）。每孔加入100 µl混合的CD4+ T细胞。使用三孔仅含混合CD4+ T细胞的样本作为CD4+ T细胞单独培养的三复孔（红色孔）。将每种CD8+ T细胞稀释液各100 µl以双复孔形式加入其余含有混合CD4+ T细胞的孔中（绿色孔）。共培养6小时后，通过流式细胞术评估靶细胞的杀伤情况。

孵育后，细胞的分析和设门方法如图2所示。从一个较小的FSC-A/SSC-A...

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讨论

此处所述的检测方法可用于量化CD8+ T细胞的主要功能：细胞毒活性。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为既往研究报道，抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒活性与其细胞因子分泌之间存在不一致性。10,11由于共培养孵育时间较短（6小时）且使用自体靶细胞，靶细胞的非特异性杀伤率较低。因此，该检测方法具有高度特异性和可靠性。该检测方法还可轻松修改以分析不同的细胞亚群。效应CD8+ T细胞可替换为其他细胞类型，例如CD4+ T细胞，正如近期文献所述 体内 杀伤实验12靶向的CD4+ T细胞也可替换为其他细胞类型，正如我们此前描述的，可使用自体B细胞作为靶细胞8在此系统中，抗原的来源也可被替换。例如，靶细胞可通过病毒感染，而非使用肽段致敏。本方案提供了一种准确定量抗原特异性CD8+ T细胞溶细胞活性的方法。由于该方法具有良好的通用性和操作简便性，检测效应细胞的杀伤能力或可更频繁地用于CD8+ T细胞功能的量化分析。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由佛罗里达州旅游、贸易和经济发展办公室资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EasySep 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒Stem Cell19052
EasySep 人 CD8+ T 细胞富集试剂盒Stem Cell19053
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒 - 用于流式细胞术InvitrogenC34554
Far Red LIVE/DEAD 可固定死细胞染料InvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 小鼠抗人 CD3 抗体BD557943
Brilliant Violet 650 抗人 CD4 抗体Biolegend317435
PerCP 抗人 CD8 抗体Biolegend344707
RPMI 1640 培养基 1xVWR10-040-CV
青霉素-链霉素 100x 溶液Invitrogen15070063
胎牛血清 - 金标，热灭活PAAA15-252
96 孔板；经处理；U 型底；带盖BD Falcon353077
25 ml 无菌聚苯乙烯储液槽，独立包装USA Scientific2321-2230
96 孔 U 型底，无菌 2 ml 深孔板Thermo Scientific275743
人 IL-2 (v126)，研究级Miltenyi Biotec130-093-096
RoboSep 缓冲液，分离缓冲液Stem cell20104
15 ml 聚丙烯圆锥形离心管BD Falcon352097
14 ml 圆底管，聚丙烯材质BD Falcon352059
The Big Easy EasySep 磁力架Stem cell18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96 孔 V 型底板，带盖Fisher12-565-481
甲醛溶液，ACS 级试剂，37 wt % 溶于 H2OSigma-Aldrich252549-500ML
1.5 ml 螺口盖微量离心管，锥形Sarstedt72.692.005

参考文献

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CD8 T MHC CFSE

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