基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

摘要

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+ T细胞的溶细胞活性。

摘要

CD8+ T细胞的细胞毒活性很少被评估。本文介绍一种新的基于细胞的检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞杀伤负载其同源肽段的CD4+ T细胞的能力。将靶向的CD4+ T细胞分为两个群体，并用两种不同浓度的CFSE进行标记。其中一个群体用目标肽段致敏（CFSE低表达），另一个群体则未致敏（CFSE高表达）。将致敏与未致敏的CD4+ T细胞按相等比例混合后，与不同数量的纯化CD8+ T细胞共同孵育。在与含有抗原特异性效应CD8+ T细胞的CD8+ T细胞共培养后，通过流式细胞术分析自体靶向CD4+ T细胞的特异性杀伤情况，其中抗原特异性效应CD8+ T细胞通过肽段/MHCI四聚体染色进行鉴定。通过在不同效应细胞与靶细胞比例下测定靶向CD4+ T细胞的特异性裂解程度，可计算出溶细胞单位LU₃₀/10⁶细胞。该检测方法简单直接，能够准确测量CD8+ T细胞杀伤靶向CD4+ T细胞的内在能力。

引言

细胞溶解活性是CD8+ T细胞的主要功能，但目前仍很少被检测，因为用于此目的的检测方法繁琐且难以标准化。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为迄今为止尚未发现可有效预测细胞介导的细胞毒性的可靠指标^1,2。本文中，我们提出一种新的功能性检测方法，用于测量抗原特异性CD8+ T细胞对靶向CD4+ T细胞的细胞毒活性。已有多种方法被开发出来，以替代传统的“金标准”——铬释放实验。本文介绍的是一种基于细胞的检测方法，能够反映整个杀伤过程，通过测量活靶细胞的死亡情况来实现。该方法源自基于流式细胞术的小鼠体内in vivo^4,5和人类体外in vitro⁶细胞毒检测方案。在本实验方案中，使用总CD8+ T细胞群体中含有的抗原特异性CD8+ T细胞作为效应细胞，同源CD4+ T细胞作为靶细胞。通过MHCI/肽段四聚体⁷对感兴趣的效应性CD8+ T细胞进行计数。靶细胞的死亡率通过加载肽段与未加载肽段的CD4+ T细胞之间的比例来计算。我们先前已证明，该方法具有可重复性、高灵敏度、高特异性，且不依赖于总CD8+ T细胞群体中效应细胞的数量⁸。通过在共培养实验中同时对效应细胞和靶细胞进行计数，可计算出CD8+ T细胞杀伤靶细胞的内在能力，并以裂解单位表示⁹。

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方案

1. 效应CD8+ T细胞的制备

1. 将自体冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（2-3管，每管50 x 10⁶个细胞）从液氮中取出，放入37 °C水浴中解冻。
2. 用完全RPMI培养基（含4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和链霉素，并添加10%胎牛血清）将细胞管加至50 ml，洗涤细胞。计数PBMC，并以5 x 10⁶/ml的浓度重悬于完全RPMI培养基中。
3. 向PBMC中加入特异性肽段（5 µg/ml）和IL-2（10 ng/ml）。
4. 在96孔深孔板中建立培养体系；每孔接种1 ml细胞悬液。
5. 培养3天后，更换一半的细胞培养基为新鲜的完全RPMI培养基。
6. 培养6天后，用多通道移液器收集所有PBMC，并转移至无菌储液槽中。
7. 计数、洗涤PBMC，并以5 x 10⁷/ml的浓度重悬于14 ml圆底管中的推荐分离缓冲液中。按每毫升细胞加入50 µl人CD8+ T细胞富集混合液。混匀后室温孵育10分钟。再按每毫升细胞加入150 µl磁性颗粒，孵育5分钟。
8. 通过加入分离缓冲液将细胞悬液体积调整至7 ml。将试管放入磁铁中，进行未接触式CD8+ T细胞的免疫磁分离。5分钟后，保持试管仍在磁铁中，将目标细胞倾倒入新的15 ml锥形管中。取少量细胞样本，在4 °C条件下，用含1X PBS-2% FBS的缓冲液与....

结果

图1中的示意图总结了该检测方法。将纯化的CD8+ T细胞（效应细胞）重悬于450 µl完全RPMI培养基中，并通过将225 µl CD8+ T细胞加入含有225 µl培养基的下一试管中进行系列稀释（上图）。对纯化的CD4+ T细胞（靶细胞）进行计数后，分装至两个试管中，并按照方案所述用两种不同浓度的CFSE（高浓度和低浓度）进行染色。CFSE低染的CD4+ T细胞用目标肽段进行刺激，而CFSE高染的CD4+ T细胞则不加肽段作为对照。将CFSE高染和CFSE低染的CD4+ T细胞均重悬至2 × 10⁵/ml，并以1:1的比例混合（下图）。每孔加入100 µl混合的CD4+ T细胞。使用三孔仅含混合CD4+ T细胞的样本作为CD4+ T细胞单独培养的三复孔（红色孔）。将每种CD8+ T细胞稀释液各100 µl以双复孔形式加入其余含有混合CD4+ T细胞的孔中（绿色孔）。共培养6小时后，通过流式细胞术评估靶细胞的杀伤情况。

孵育后，细胞的分析和设门方法如图2所示。从一个较小的FSC-A/SSC-A.......

讨论

此处所述的检测方法可用于量化CD8+ T细胞的主要功能：细胞毒活性。在表征CD8+ T细胞效应功能时，准确测量该功能至关重要，因为既往研究报道，抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒活性与其细胞因子分泌之间存在不一致性。^10,11由于共培养孵育时间较短（6小时）且使用自体靶细胞，靶细胞的非特异性杀伤率较低。因此，该检测方法具有高度特异性和可靠性。该检测方法还可轻松修改以分析不同的细胞亚群。效应CD8+ T细胞可替换为其他细胞类型，例如CD4+ T细胞，正如近期文献所述 体内 杀伤实验¹²靶向的CD4+ T细胞也可替换为其他细胞类型，正如我们此前描述的，可使用自体B细胞作为靶细胞⁸在此系统中，抗原的来源也可被替换。例如，靶细胞可通过病毒感染，而非使用肽段致敏。本方案提供了一种准确定量抗原特异性CD8+ T细胞溶细胞活性的方法。由于该方法具有良好的通用性和操作简便性，检测效应细胞的杀伤能力或可更频繁地用于CD8+ T细胞功能的量化分析。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EasySep 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒	Stem Cell	19052
EasySep 人 CD8+ T 细胞富集试剂盒	Stem Cell	19053
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒 - 用于流式细胞术	Invitrogen	C34554
Far Red LIVE/DEAD 可固定死细胞染料	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 小鼠抗人 CD3 抗体	BD	557943
Brilliant Violet 650 抗人 CD4 抗体	Biolegend	317435
PerCP 抗人 CD8 抗体	Biolegend	344707
RPMI 1640 培养基 1x	VWR	10-040-CV
青霉素-链霉素 100x 溶液	Invitrogen	15070063
胎牛血清 - 金标，热灭活	PAA	A15-252
96 孔板；经处理；U 型底；带盖	BD Falcon	353077
25 ml 无菌聚苯乙烯储液槽，独立包装	USA Scientific	2321-2230
96 孔 U 型底，无菌 2 ml 深孔板	Thermo Scientific	275743
人 IL-2 (v126)，研究级	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep 缓冲液，分离缓冲液	Stem cell	20104
15 ml 聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352097
14 ml 圆底管，聚丙烯材质	BD Falcon	352059
The Big Easy EasySep 磁力架	Stem cell	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96 孔 V 型底板，带盖	Fisher	12-565-481
甲醛溶液，ACS 级试剂，37 wt % 溶于 H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1.5 ml 螺口盖微量离心管，锥形	Sarstedt	72.692.005