成像细胞膜损伤及参与修复的亚细胞过程

摘要

修复受损细胞的过程涉及特定蛋白质和亚细胞区室向细胞膜损伤部位的转运。本方案描述了监测这些过程的实验方法。

摘要

受损细胞的自我修复能力是一种基本的细胞过程，但参与受损细胞修复的细胞与分子机制目前仍不清楚。本文描述了几种用于监测培养细胞在局部损伤后修复能力及其动力学特征的实验方法。第一种方案介绍了一种基于终点的检测方法，可同时评估数百个细胞的细胞膜修复能力。第二种方案介绍了一种实时成像方法，用于在脉冲激光造成局部损伤后，监测单个细胞细胞膜修复的动力学过程。由于受损细胞的修复涉及特定蛋白质和亚细胞结构向损伤部位的转运，第三种方案描述了如何利用上述基于终点的方法，同时评估大量细胞中发生的某一类转运事件（溶酶体胞吐）。最后一种方案则介绍了结合脉冲激光损伤与全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，以高空间和时间分辨率监测受损细胞中单个亚细胞结构动态变化的方法。尽管本文中的方案主要描述了这些方法在研究培养肌肉细胞中细胞膜修复与溶酶体胞吐之间关系的应用，但这些方法可直接适用于其他任何贴壁培养细胞以及选定的亚细胞结构。

引言

细胞膜通过在细胞与细胞外环境之间形成屏障，维持细胞的完整性。当化学、电或机械刺激超过正常生理阈值，或存在入侵病原体时，均可能导致细胞膜损伤，并触发细胞后续的修复反应。为在细胞膜损伤后存活，细胞具备一种高效的修复机制。该机制依赖于钙离子，涉及多种蛋白质（如annexins和MG53等）的细胞内转运，以及内体、溶酶体、高尔基体来源的囊泡和线粒体等亚细胞结构向受损细胞膜的募集^1-7。然而，参与修复受损细胞膜的分子和亚细胞事件的具体顺序仍不甚清楚。

细胞的修复反应可分为早期反应和晚期反应。早期反应发生在数秒至数分钟的时间尺度内，对决定晚期反应的性质（导致细胞成功修复或细胞死亡）具有极其重要的作用。基于整体生化和细胞分析的终点检测方法，已帮助确立了分子和细胞过程在修复中的参与。然而，由于细胞修复反应具有异质性和快速性，终点检测无法提供修复过程中事件序列的动力学和空间细节。能够实现对细胞膜的可控损伤，并可在高时空分辨率下监测细胞膜修复及相关亚细胞反应的方法，非常适合此类研究。本文介绍了这些方法。其中两个实验方案描述了在激光损伤后，于活细胞中实时监测细胞膜修复动力学及与修复过程相关的亚细胞反应的方法。作为对这些基于活细胞成像检测方法的补充，本文还介绍了终点检测方法，可用于在群体水平上评估单个细胞的修复情况及其相关的亚细胞反应。为展示这些方法的应用价值，已将其用于监测细胞膜损伤后溶酶体的 trafficking（转运）和胞吐作用。

方案

1. 使用群体（玻璃珠）损伤法对细胞膜修复进行成像

该方案可分别标记受损细胞和未能愈合的细胞。定量分析这些细胞群体需要使用三种条件：1. 实验组（C1）——细胞在含有 Ca²⁺ 的环境中进行修复；2. 对照组1（无损伤，C2）——细胞在含有 Ca²⁺ 的环境中孵育，但不造成损伤；3. 对照组2（无修复，C3）——细胞在无 Ca²⁺ 的环境中进行修复。

1. 培养细胞至 >在三个无菌盖玻片上接种至50%汇合度，用37 °C的CIM洗涤C1和C2两次，用37 °C的PBS洗涤C3两次，然后将盖玻片转移至硅胶O型环上。
2. 在C1和C2的CIM中加入100 μl预热的FITC葡聚糖溶液，或在C3的PBS中加入同样体积的溶液。
3. 通过手动将盖玻片在30°角度下前后倾斜6–8次，使40 mg玻璃珠在室温下轻轻滚过盖玻片表面，从而损伤C1和C3处的细胞质膜。
   注意：对于轻度损伤，应确保玻璃珠均匀分布，从而最大限度地减少重复损伤。为提高不同样本间损伤的可重复性，应同时对需比较的不同样本进行玻璃珠损伤处理。
4. 避免珠子进一步滚动，将所有盖玻片转移至37 °C、常氧CO₂培养箱中₂ 并让修复反应进行5分钟。
5. 在不使珠子滚动的情况下，用 CIM（C1 和 C2）或 PBS（C3）在 37 °C 洗涤以去除玻璃珠和 FITC 葡聚糖。
6. 将盖玻片放回O型圈上，在C1和C2中加入100 μl预热的溶于CIM的赖氨酸可固定TRITC葡聚糖溶液，或在C3中加入溶于PBS的相应溶液。
7. 在37 °C、环境CO₂条件下孵育5分钟₂.
8. 用预热的 CIM 洗涤盖玻片两次，然后在室温下用 4% PFA 固定 10 分钟。
9. 用 PBS 洗涤两次，随后在 Hoechst 染料中室温孵育 2 分钟。
10. 用 PBS 清洗样品两次，使用封片剂将样品固定在载玻片上，并使用落射荧光显微镜观察细胞。
11. 使用C2细胞确定红色和绿色染色的背景强度，并利用该值对所有样品（C1-C3）的红色和绿色通道进行阈值设定。
12. 统计 C1 和 C3 样本中 a) 绿色（受损并修复）和 b) 红色或红绿双色（受损但未修复）的细胞总数。
13. 计数 >每种条件下计数100个绿色细胞，并将未能修复的细胞数占所有受损细胞（绿色和红色）的百分比表示。

2. 激光损伤后细胞膜修复动力学的活体成像

1. 用预热的 CIM 洗涤细胞，然后将盖玻片放入含有 FM 染料的 CIM 中。
2. 将盖玻片置于载物台顶部培养箱内的样品 holder 中，并维持在 37 °C。
3. 选择细胞膜上 1–2 mm² 的区域，使用脉冲激光照射 <10 毫秒。通过软件将激光功率衰减至峰值功率的 40–50%。最佳功率应能产生稳定但非致死性的损伤，具体数值需根据所使用的不同仪器和细胞系通过反复试验确定。
4. 为监测修复过程，在损伤前开始，每隔 10 秒采集一次落射荧光和明场图像，持续至损伤后 3–5 分钟 。
   注意：对于无修复对照组，使用含 FM 染料的 PBS 缓冲液重复步骤 2.1–2.4。
5. 为定量分析修复动力学，测量细胞内 FM 染料的荧光强度，并绘制成像过程中荧光强度变化（ΔF/F0）。每种条件下应至少分析 10 个细胞的数据，根据需要绘制平均值或单个细胞的数值。

3. 成像检测大体积（玻璃微珠）损伤诱导的溶酶体胞吐作用

样本包括以下细胞，培养至>50% 汇合度：1. 实验组（C1）— 在存在 Ca²⁺ 的条件下进行修复的细胞；2. 对照组1（C2；无损伤）— 未造成损伤且未与一抗孵育的细胞；3. 对照组2（C3；无修复）— 在无 Ca²⁺ 条件下进行修复的细胞。

1. 用 37 °C 的 CIM 洗涤盖玻片 C1 和 C2 两次，用 37 °C 的 PBS 洗涤盖玻片 C3 两次，并将它们转移至硅胶 O 形环上。
2. 在 C1 和 C2 上加入 100 μl 预热的可固定 TRITC 葡聚糖溶于 CIM 的溶液，在 C3 上加入溶于 PBS 的相同溶液。
3. 参照步骤 1.3，在 C1 和 C3 上损伤细胞质膜。
4. 避免玻璃珠进一步滚动，将所有盖玻片转移至 37 °C、常压 CO₂ 条件下的培养箱中，孵育 5 分钟以允许修复过程进行。
5. 用冷的生长培养基洗涤盖玻片，去除玻璃珠和 TRITC 葡聚糖，过程中需确保玻璃珠不在细胞表面滚动。
6. 用冷的生长培养基冲洗盖玻片两次，并转移回 O 形环上。
7. 向 C1 和 C3 加入 100 μl 冷的完全生长培养基中稀释的大鼠抗小鼠 LAMP1 抗体，向 C2 加入等量的冷的完全生长培养基。
8. 将盖玻片置于 4 °C 孵育 30 分钟，以允许抗体结合。
9. 用冷的 CIM 洗涤盖玻片三次，并用 4% PFA 在室温下固定 10 分钟 ，然后用 CIM 再洗三次。
10. 将所有盖玻片在室温下用 100 μl 封闭液孵育 15 分钟。
11. 将所有盖玻片在 4 °C 下用 100 μl Alexa Fluor 488 抗大鼠抗体孵育 15 分钟。
12. 用 PBS 洗涤两次，然后在 Hoechst 中室温孵育 2 分钟。
13. 用 PBS 洗涤细胞两次，用封片剂将盖玻片封于载玻片上，并使用落射荧光显微镜进行成像。
14. 根据 C2 细胞的图像，确定红色（TRITC 葡聚糖）和绿色（Alexa Fluor 488 抗体）通道中的非特异性背景染色，并利用这些背景染色值对所有样品（C1–C3）的红绿通道进行阈值设定。
15. 利用 C1 和 C3 中超过 100 个红色标记的细胞>，测量受损细胞中 LAMP1 染色（绿色）的强度。成功的实验中，C3 来源细胞的 LAMP1 染色强度应显著低于 C1 来源细胞。

4. 细胞膜损伤诱导的亚细胞转运的活体成像

1. 荧光标记 通过转染适当的报告基因来标记目标区室例如 溶酶体用 CD63-GFP⁸）或使用荧光染料⁹.
2. 用荧光染料标记溶酶体时，将生长至50%汇合度的细胞在含有FITC-葡聚糖的生长培养基中孵育
3. 在CO₂培养箱中孵育2小时（或根据目标细胞系的需要延长孵育时间，以实现足够的葡聚糖内体标记），使葡聚糖被细胞内吞₂ 培养箱
4. 用预热的生长培养基洗涤细胞，并在CO₂培养箱中孵育2小时₂ 孵育器中孵育，使所有内吞的葡聚糖均积累于溶酶体中。
5. 成像前，用预热的CIM冲洗盖玻片，并将其安装在置于载物台顶部培养箱内的盖玻片架中，于37 °C孵育。
6. 进行宽场成像（用于观察细胞内整体运动）或全内反射荧光成像（TIRF，用于观察细胞表面运动及胞吐作用）——溶酶体未被密集标记FITC葡聚糖的细胞最适合用于成像单个溶酶体的运动与胞吐过程。
7. 对成像显微镜的TIRF激光进行校准：使用60倍或100倍物镜 >1.45 数值孔径。使用制造商提供的方法设置入射全内反射荧光（TIRF）激光束的角度。
8. 通过照射一小块区域（1-2 mm）来损伤细胞膜²区域用于 <100 毫秒，脉冲激光衰减率为 40–50%。
9. 为监测溶酶体对细胞损伤的响应，以每秒4-6帧的速度对细胞成像，持续至少2分钟或更长时间，具体时长取决于目标细胞中外排作用的动力学特征。

结果

本文所述的单细胞成像方案用于监测细胞膜修复的能力与动力学过程（方案1和方案2），以及修复过程中溶酶体的亚细胞转运与融合（方案3和方案4）。

方案1展示了一种整体检测方法，可标记所有受损细胞，并识别出那些未能修复的受损细胞。图1结果显示，未受损细胞（图1A）保持无标记状态，而用玻璃珠造成损伤并在FITC葡聚糖存在下处理的细胞则呈现绿色标记（图1B和1C）。当细胞在Ca²⁺存在条件下进行修复时，大多数受损（绿色）细胞能够完成修复，因而不会被TRITC葡聚糖标记为红色（图1B）。而当细胞在无Ca²⁺条件下修复时，大多数受损细胞会被TRITC葡聚糖标记为红色（图1C）。从未受损的细胞不会被TRITC葡聚糖标记。因此，在任意给定样本中，仅被标记为绿色的细胞数量可反映经玻璃珠损伤后成功修复的细胞数量；而被双标（红色和绿色）的细胞数量则可反映未能从损伤...

讨论

细胞膜损伤 体内 由于多种生理应激因素引起，已有多种实验方法被开发用于模拟这些条件。这些方法包括通过刮除贴壁细胞或使其通过细孔注射器以损伤细胞膜^9,10受伤后，这些细胞在悬浮状态下愈合，而非像在组织中那样附着于细胞外基质。另一些情况，例如使用成孔毒素，会通过提取胆固醇等脂质来化学改变细胞膜，因而无法模拟 体内 机械性损伤⁵因此，用于造成细胞损伤的方法可能影响对修复反应的研究结果。这要求不仅在选择细胞损伤检测方法时需谨慎，还应选用更能模拟机械性损伤的方法。 体内此类方法包括划痕损伤（使用手术刀或针头损伤细胞单层）和玻璃珠损伤（通过玻璃珠在贴壁细胞上滚动造成损伤）。这些方法适用于细胞损伤实验 大规模，但无法用于细胞膜修复过程的实时成像。利用微针和脉冲激光在撞击点产生局部且可控的损伤，可模拟机械性与创伤性损伤 体内 并且适用于实时成像修复反应，但仅能提供单个细胞修复过程的信息。值得注意的是，脉冲激光损伤方法不同于使用非脉冲激光对细胞膜进行持续照射的方法，后者通过局部加热造成膜损伤，已知会引发非生理效应，例如对膜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HBSS	Sigma	H1387	用于配制 CIM（HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+，pH 7.4）
HEPES	Fisher	BP410	用于配制 CIM（HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+，pH 7.4）
FITC 葡聚糖（可与赖氨酸交联）	Invitrogen	D1820	2 mg/ml，溶于 CIM 或 PBS
玻璃珠	Sigma	G8772
TRITC 葡聚糖（可与赖氨酸交联）	Invitrogen	D1818	2 mg/ml，溶于 CIM 或 PBS
PFA 16%	EMS	15710	使用时稀释为 PBS 中 4%
Hoechst	Invitrogen	H3570	PBS 中 1/10 000 稀释
FM 染料	Invitrogen	T3163	1 µg/µl，溶于 CIM 或 PBS
FITC 葡聚糖	Sigma	FD40S	2 mg/ml，溶于培养基
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	培养基中 1/300 稀释
Alexa Fluor 488 鸡抗大鼠 IgG	Invitrogen	A21470	封闭液中 1/500 稀释
封片剂	Dako	S3023
盖玻片	Fisher	12-545-86
玻璃底培养皿	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
硅胶 O 形圈	Bellco	1943-33315
盖玻片支架	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	用于配制培养基：DMEM 中含 10% FBS 和 1% P/S
青霉素/链霉素	VWR	12001-350	用于配制培养基：DMEM 中含 10% FBS 和 1% P/S
鸡血清	Sigma	C5405	免疫染色封闭液中使用含 5% 鸡血清的 CIM
PBS（无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）	VWR	12001-664
落射荧光显微镜	Olympus America, PA	IX81
TIRF 照明装置	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
落射荧光照明装置	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD 相机	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
图像采集与分析软件	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
脉冲激光器	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
载物台培养箱	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS