为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
心肌细胞是心脏的功能细胞，其内部含有高度有序的细胞骨架和收缩元件，能够产生用于泵血的收缩力。40多年前首次成功分离出单个心肌细胞，以更深入地研究心肌的生理学与结构。技术迅速发展，现已包括通过冠状动脉灌流进行酶消化的方法。近年来，对分离心肌细胞的收缩功能和钙离子流的分析，已成为研究心力衰竭在细胞和亚细胞水平变化的重要工具。超声心动图和心电图仅能提供器官层面的心脏信息。虽然存在心肌细胞培养系统，但这些细胞缺乏在生理上至关重要的结构，例如有序排列的肌节和横管系统，而这些结构是心肌细胞在心脏内正常发挥功能所必需的。本文所介绍的方案中，心肌细胞通过朗根多夫（Langendorff）灌流法进行分离。将小鼠心脏取出后，通过主动脉连接至套管，以消化酶进行灌流，并逐步提高钙离子浓度以恢复细胞活性。利用边缘和肌节检测软件分析细胞的收缩性，同时使用钙离子结合荧光染料来观察电刺激下心肌细胞的钙瞬变，从而加深对细胞变化在心脏功能障碍中作用的理解。该系统传统上用于检测药物对心肌细胞的影响，而我们则利用此系统比较来自野生型（WT）小鼠与携带扩张型心肌病致病突变的小鼠的心肌细胞。本方案的独特之处在于能够对比具有已知心脏功能和明确遗传背景的小鼠的活细胞。该方法可稳定地比较多种实验条件，包括基因或环境干预、感染、药物处理等。除生理学数据外，分离的心肌细胞也易于固定并进行细胞骨架成分的染色。通过灌流法分离心肌细胞是一种极为灵活的方法，适用于在多种实验条件下研究伴随或导致心力衰竭的细胞变化。
引言
心肌细胞为心脏提供收缩力。每个心肌细胞都含有对收缩功能至关重要的有序细胞骨架和收缩元件。心脏不仅包含心肌游戏副本，还包括成纤维细胞、结缔组织以及浦肯野纤维等特化的肌细胞。在心力衰竭中，这些细胞类型中的一种或多种均可能发生改变，使得确定心脏功能障碍的根本原因变得困难。心力衰竭心脏的收缩功能下降之前，通常会先后出现不同程度的纤维组织积聚、心肌细胞肥大及功能障碍1。心律失常可由传导细胞功能异常2、纤维化干扰心脏电传导3，或心肌细胞中离子通道表达的改变所引起1,4。事实上，这些问题常常以复杂的方式共存。
分离并研究心肌细胞可使研究者在整体心脏功能的背景下，观察单个心肌细胞的收缩和电功能障碍。40 多年前，为了更深入地研究心脏这一“主力”细胞的生理特性，人们开发出了分离单个心肌细胞的技术。随着技术的不断改进，细胞的得率和质量得以提高，其中关键进展是通过主动脉插管实现冠状动脉灌流，该方法首次于 1970 年实现5。本文描述了心肌细胞的分离过程，随后利用比率荧光法及细胞尺寸数据采集软件，检测细胞的收缩功能和钙瞬变。在遗传性和环境性心脏病模型中，采用该方案可获得有关细胞收缩力、肌节收缩与舒张、钙瞬变以及细胞骨架紊乱的关键信息。该系统常用于测试药物对分离心肌细胞的作用6,7。我们利用该系统比较野生型小鼠与导致扩张型心肌病突变小鼠之间心肌细胞的收缩功能和钙瞬变差异。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
确保所有涉及动物的实验程序均已获得相应的动物使用与护理管理机构的批准。
1. 提前配制储备缓冲液
- 配制 2 L 的无 Ca2+ Tyrode 液（表 1）。用 NaOH 将 pH 调至 7.4。
- 配制 2 L 的 1.2 mM Ca2+ Tyrode 液（表 2）。用 NaOH 将 pH 调至 7.4。
2. 实验当天，准备灌注、转移和消化缓冲液
- 在无 Ca2+ 的 Tyrode’s 液（表 3）中配制 150 ml 灌注缓冲液，并通过 0.2 μm 滤器过滤。
- 配制 35 ml 含 Ca2+ 的转移缓冲液“缓冲液 A”（表 4）和 25 ml 含 Ca2+ 的“缓冲液 B”（表 5）。每种缓冲液均通过 0.2 μm 滤器过滤。
- 根据 表 6，通过混合缓冲液 A 和缓冲液 B 配制 0.06、0.24、0.6 和 1.2 mM Ca....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在采集到收缩力和瞬时变化曲线后（图2），可使用适当的软件轻松分析数据。可对整个曲线或其部分进行平均处理（图3）。收缩功能可通过多种方式进行分析：对于收缩期功能，可通过缩短分数评估收缩幅度，通过达到峰值缩短时间或收缩速度评估收缩速率；舒张期功能则可通过达到50%缩短所需时间及舒张速率进行类似分析。对于钙瞬变，也可进行类似比较，包括基础值和峰值Fura-2比值，以及达到峰值或恢复至基础值所需时间（表8）。这些分析可提供来自野生型（WT）和基因敲除型（KO）心脏的细胞水平收缩期与舒张期收缩功能以及钙通量的可比数据，上述任一参数均可能在整体器官功能障碍相似的心脏中发生改变。此外，同一次分离获得的细胞还可用于本方案中列出的其他实验，包括免疫组织化学染色（图4）。
| 无 Ca2+ ....... |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
获得高质量的心肌细胞需要一定程度的实践和优化。本方案包含若干关键步骤，这些步骤会显著影响消化的效果。在执行和排查方案问题时应仔细考虑这些因素。从取出心脏到插管和灌注的时间应尽量缩短，理想情况下应少于五分钟。将心脏从小鼠体内取出后立即用冰冻灌注缓冲液冲洗，并在冰冻缓冲液中进行心脏解剖和插管，也有助于提高消化质量。插管本身是一个关键步骤。导管尖端必须置于主动脉的第一分支以下，但不能穿过主动脉瓣进入心室，否则将阻碍冠状动脉的灌注。冠状动脉灌注对于获得高质量的消化至关重要。在本实验室中，导管连接至装有灌注缓冲液的注射器。安装导管后，轻轻注入少量灌注缓冲液，并观察冠状动脉血液是否被清除，以此可检验插管是否到位。
解决本方案中的问题需仔细评估上述关键步骤。如果在消化过程中心脏未明显变软，可能存在几种原因。首先，在插管时，插管尖端可能已越过主动脉瓣，导致无法通过冠状动脉进行灌注。此问题可在将心脏悬挂于朗格多夫装置前进行评估：用注射器向插管内推注少量灌注缓冲液，并仔细观察冠状动脉内血液是否被清除。若灌注充分但心脏消化效果仍不佳，可考虑更换不同批次的酶。由于这些酶实际为混合物，不同批次的作用效果并不.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢 Marc Wozniak 提供细胞与发育生物学系的摄像设备。
范德堡大学细胞成像共享资源中心。
本研究由美国心脏协会（AHA）资助，资助号分别为 ERP 的 12PRE10950005 和 DMB 的 11GRNT7690040，以及美国国立卫生研究院（NIH）资助号 R01 HL037675。DMB 担任心血管研究 Gladys P. Stahlman 讲席教授。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
| 2,3-丁二酮一肟（BDM） | Sigma | B-0753 | |
| 牛磺酸 | Sigma | T-0625 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A-7030 | |
| 胶原酶B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| 胶原酶D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| 蛋白酶XIV | Sigma | P-5147 | |
| 肝素 | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| 异氟烷 | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – 无水 | Sigma | 276855 | |
| IonOptix细胞刺激与荧光分析系统 | IonOptix | ||
| 250 μm 尼龙筛网滤膜 | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-短管接头 | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50导管 | Becton Dickinson | 427410 |
参考文献
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
