小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

摘要

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。

摘要

心肌细胞是心脏的功能细胞，其内部含有高度有序的细胞骨架和收缩元件，能够产生用于泵血的收缩力。40多年前首次成功分离出单个心肌细胞，以更深入地研究心肌的生理学与结构。技术迅速发展，现已包括通过冠状动脉灌流进行酶消化的方法。近年来，对分离心肌细胞的收缩功能和钙离子流的分析，已成为研究心力衰竭在细胞和亚细胞水平变化的重要工具。超声心动图和心电图仅能提供器官层面的心脏信息。虽然存在心肌细胞培养系统，但这些细胞缺乏在生理上至关重要的结构，例如有序排列的肌节和横管系统，而这些结构是心肌细胞在心脏内正常发挥功能所必需的。本文所介绍的方案中，心肌细胞通过朗根多夫（Langendorff）灌流法进行分离。将小鼠心脏取出后，通过主动脉连接至套管，以消化酶进行灌流，并逐步提高钙离子浓度以恢复细胞活性。利用边缘和肌节检测软件分析细胞的收缩性，同时使用钙离子结合荧光染料来观察电刺激下心肌细胞的钙瞬变，从而加深对细胞变化在心脏功能障碍中作用的理解。该系统传统上用于检测药物对心肌细胞的影响，而我们则利用此系统比较来自野生型（WT）小鼠与携带扩张型心肌病致病突变的小鼠的心肌细胞。本方案的独特之处在于能够对比具有已知心脏功能和明确遗传背景的小鼠的活细胞。该方法可稳定地比较多种实验条件，包括基因或环境干预、感染、药物处理等。除生理学数据外，分离的心肌细胞也易于固定并进行细胞骨架成分的染色。通过灌流法分离心肌细胞是一种极为灵活的方法，适用于在多种实验条件下研究伴随或导致心力衰竭的细胞变化。

引言

心肌细胞为心脏提供收缩力。每个心肌细胞都含有对收缩功能至关重要的有序细胞骨架和收缩元件。心脏不仅包含心肌游戏副本，还包括成纤维细胞、结缔组织以及浦肯野纤维等特化的肌细胞。在心力衰竭中，这些细胞类型中的一种或多种均可能发生改变，使得确定心脏功能障碍的根本原因变得困难。心力衰竭心脏的收缩功能下降之前，通常会先后出现不同程度的纤维组织积聚、心肌细胞肥大及功能障碍¹。心律失常可由传导细胞功能异常²、纤维化干扰心脏电传导³，或心肌细胞中离子通道表达的改变所引起^1,4。事实上，这些问题常常以复杂的方式共存。

分离并研究心肌细胞可使研究者在整体心脏功能的背景下，观察单个心肌细胞的收缩和电功能障碍。40 多年前，为了更深入地研究心脏这一“主力”细胞的生理特性，人们开发出了分离单个心肌细胞的技术。随着技术的不断改进，细胞的得率和质量得以提高，其中关键进展是通过主动脉插管实现冠状动脉灌流，该方法首次于 1970 年实现⁵。本文描述了心肌细胞的分离过程，随后利用比率荧光法及细胞尺寸数据采集软件，检测细胞的收缩功能和钙瞬变。在遗传性和环境性心脏病模型中，采用该方案可获得有关细胞收缩力、肌节收缩与舒张、钙瞬变以及细胞骨架紊乱的关键信息。该系统常用于测试药物对分离心肌细胞的作用^6,7。我们利用该系统比较野生型小鼠与导致扩张型心肌病突变小鼠之间心肌细胞的收缩功能和钙瞬变差异。

与研究心脏解剖学和生理学的其他常用方法相比，研究单个心肌细胞具有多种优势。超声心动图和心电图可提供有关心脏整体收缩功能和电传导的信息，但这些方法均无法解释器官整体水平以下功能障碍的原因或本质。利用边缘检测和肌节长度算法测量单个心肌细胞的收缩力，可以揭示心脏收缩细胞内的变化与整体心脏功能障碍之间的关联。通过测量钙瞬变，可揭示离子流在细胞水平上的改变对收缩功能障碍或心律失常的影响。

除了补充完整器官研究外，本方案还提供了易于对亚细胞结构进行染色的细胞。虽然可以通过对完整心脏组织切片染色来观察细胞骨架的变化，但只能看到细胞的横截面。由于完整的心肌细胞比典型的组织切片更厚，加之心肌细胞的排列方式和长度特点，很难在单个切片中观察到完整的心肌细胞。分离后的心肌细胞可立即固定，并对多种细胞骨架成分和离子通道进行染色。共聚焦图像可整合为细胞全厚度的z轴层扫图像。此外，对分离的心肌细胞进行染色，还能标记在组织切片中无法观察到的结构成分，例如被称为横小管（t-tubules）的细胞膜内陷结构。

已存在培养的心肌细胞系，其中一些具有与心肌细胞相似的转录谱和表型特征。例如HL-1细胞系，甚至保留了一定的肌节结构组织和初步的收缩能力⁸尽管具有这些特性，培养的细胞仍缺乏心肌细胞特有的“车厢”状形态和横小管结构，且肌节排列较为松散。这些结构对心肌细胞的功能至关重要。 体内此外，使用培养细胞可实现遗传操作，但无法 体内 生理学操作。分离的心肌细胞能够长时间保持其细胞结构，便于研究，同时仍易于成像甚至转导⁹.

分离的心肌细胞具有极高的多功能性，可作为研究来自不同实验条件下细胞的均一化分析基质。众多实验室已采用心肌细胞的分离与生理学分析方法，开展多种实验，包括研究药物^6,7或小分子¹⁰、环境应激因素¹¹、感染¹²、疾病¹³或基因突变^14,15对心肌细胞收缩功能和/或钙瞬变的影响，以及探究心肌细胞内收缩功能和钙释放的调控机制^15-17。在施加上述任何应激因素后，心脏功能的改变可能源于心肌细胞自身的变化与心脏周围环境变化的任意组合，例如瘢痕形成、传导性改变或细胞外基质的改变。本方案是针对各种病因所致心力衰竭背景下，研究单个心肌细胞结构与功能的理想方法。

尽管与其他技术相比具有众多优势，但分离心肌细胞的生理学分析并不适用于所有研究问题。细胞分离是一种终末性操作，因此只能在小鼠生命中的某一时间点对其进行评估。这一局限性可通过使用不同时间点的实验队列，或在疾病发展过程中分批处死小鼠，或在分离前监测小鼠是否已出现临床意义的心力衰竭，从而部分克服。尽管本方案能够确定心肌细胞功能障碍是否发生，但在缺乏额外实验数据的情况下，无法得出该功能障碍是心力衰竭根本原因的结论。心肌细胞功能障碍本身也可能是心脏其他变化的继发性结果。尽管存在这些挑战，结合其他实验手段，对心肌细胞的研究仍可为揭示心脏功能障碍的本质提供重要信息。

以下方案改编自范德堡大学 Chee Lim 博士提供的方案。尽管心肌收缩力和钙离子流数据具有高度可重复性，且在比较经遗传或环境干预处理的心脏时具有重要价值，但心脏分离本身仍是一种依赖于技术操作的实验步骤，需要进行优化。为获得高质量的心肌细胞消化效果，必须尽量缩短心脏从小鼠体内取出至通过主动脉插管灌流之间的时间。此外，消化时间和酶浓度也可进一步优化，以获得最佳质量的心肌细胞。下文列出了可能需要优化的步骤及相关优化建议。

方案

确保所有涉及动物的实验程序均已获得相应的动物使用与护理管理机构的批准。

1. 提前配制储备缓冲液

1. 配制 2 L 的无 Ca²⁺ Tyrode 液（表 1）。用 NaOH 将 pH 调至 7.4。
2. 配制 2 L 的 1.2 mM Ca²⁺ Tyrode 液（表 2）。用 NaOH 将 pH 调至 7.4。

2. 实验当天，准备灌注、转移和消化缓冲液

1. 在无 Ca²⁺ 的 Tyrode’s 液（表 3）中配制 150 ml 灌注缓冲液，并通过 0.2 μm 滤器过滤。
2. 配制 35 ml 含 Ca²⁺ 的转移缓冲液“缓冲液 A”（表 4）和 25 ml 含 Ca²⁺ 的“缓冲液 B”（表 5）。每种缓冲液均通过 0.2 μm 滤器过滤。
3. 根据 表 6，通过混合缓冲液 A 和缓冲液 B 配制 0.06、0.24、0.6 和 1.2 mM Ca²⁺ 的溶液。
4. 根据小鼠体重（BW），将消化酶溶解于 25 ml 灌注缓冲液（表 7）中，配制 25 ml 消化缓冲液。使用前通过 0.2 μm 滤器过滤。

3. 实验设置

1. 组装一个恒定流速的Langendorff装置，可使用市售产品或由蠕动泵、管路和换热线圈自行搭建，以实现3 ml/min的灌注流速，并将灌注液加热至37 °C。Bell在2011年的综述中提供了简单的示意图。 等¹⁸.
2. 将兰格多夫装置的循环水浴温度设置为约 47 °C，使灌流液以 3 ml/min 的流速从套管流出时温度为 37 °C。
3. 通过灌流系统运行70%乙醇15分钟，随后运行100 ml超纯I型水。运行灌流缓冲液5分钟，同时排除气泡。
4. 使用适当方法对所有手术器械进行灭菌。
5. 通过将一段短PE-50导管（约3 mm）连接至23 G鲁尔接头适配器的末端来制备套管。加热导管末端以形成凸缘，用于固定主动脉。

4. 心肌细胞分离

1. 通过腹腔注射，向小鼠注射 0.2 ml 肝素溶液（1,000 IU/ml）。
2. 5分钟后，用异氟烷麻醉小鼠。当小鼠完全麻醉（对强烈足部夹捏无反应）时，用70%乙醇喷洒胸部。打开胸腔，迅速切除心脏，注意不要损伤主动脉，并将心脏置于4 °C灌注缓冲液中。使用弯头镊子在心脏下方夹住并轻轻提起，以创造操作空间，然后用精细剪刀剪除心脏后方的连接组织。
3. 用两对精细镊子轻轻夹住主动脉边缘，将主动脉开口小心地拉过套管口，完成心脏插管。确保套管尖端未穿过主动脉瓣进入心室，否则会阻碍经冠状动脉对心脏的灌注。
4. 用5-0丝线在插管唇部上方紧邻处结扎一圈，将主动脉固定于插管上。
5. 注意：为了获得最佳质量的消化效果，步骤 4.2 至 4.4 应尽快完成。
6. 注意：可将心脏直接悬挂于已连接兰格多夫装置并有灌注缓冲液流动的套管上。然而，发现在解剖显微镜下将心脏悬挂于连接一小注射器灌注缓冲液的套管上操作最为成功。此方法可推动少量灌注缓冲液通过心脏，便于观察冠状动脉是否通畅，并确保心脏牢固地固定在套管上。随后将该套管悬挂至正在进行灌注缓冲液循环的兰格多夫装置上。
7. 用含 Ca 的溶液灌注心脏²⁺ 以3 ml/min的流速灌注无钙灌流液2-3分钟。
8. 更换为酶消化缓冲液，灌注7-10分钟，心脏组织将变得较软且颜色变浅。
9. 注意：消化时间可根据酶活性和心脏大小进行调整。
10. 当心脏明显松弛后，将其从套管上取下，放入含有缓冲液A（Ca²⁺）的无菌p60培养皿中²⁺ 游离转移缓冲液
11. 去除心房和大血管。如有需要，去除右心室。用镊子将心室分离成小块。使用无菌5 ml移液管反复吹打数次，以进一步分散细胞。
12. 通过250 μm尼龙筛网过滤器将细胞悬液滤入50 ml锥形管中。
13. 让悬液沉淀约10分钟。
14. 将沉淀转移至 0.06 mM Ca²⁺ 溶液。静置细胞沉淀10分钟。健康细胞会形成沉淀，而大多数死细胞会漂浮。
15. 吸弃上清液，将沉淀转移至 0.24 mM Ca²⁺ 溶液
16. 重复10分钟孵育、抽吸，并通过剩余的两个Ca转移²⁺ 溶液，直至细胞处于1.2 mM溶液中。此时，大多数细胞应为杆状心肌细胞。

5. 测量收缩力和钙瞬变

1. 注意：可同时测量收缩力和钙瞬变。
2. 用无水DMSO重悬Fura-2 AM，配制成1 μg/μl的溶液。Fura-2 AM溶液可保存在-20 °C的干燥器中。
3. 向1 ml悬浮细胞中加入1 μl Fura-2 AM。避光孵育10分钟后吸除上清液。用含Ca²⁺的Tyrode's溶液洗涤两次，每次洗涤之间在避光条件下静置10分钟使细胞沉淀。
4. 将玻璃盖玻片放入一个可进行加热灌流/抽吸并能通过心肌细胞场刺激仪进行电极起搏的载物台插入装置中。将该插入装置置于倒置荧光显微镜上，若使用油浸物镜，则在镜头上滴加一滴油。
5. 设置加热重力灌流系统，使用含1.2 mM Ca²⁺的Tyrode's溶液，使载物台上的溶液温度达到37 °C。将抽吸管连接至真空泵，连接电极。
6. 打开显微镜系统，并启动荧光比率及细胞尺寸数据采集软件。
7. 向载物台插入装置中加入数滴负载Fura-2 AM的细胞，暂时阻断灌流以使健康细胞沉降。
8. 使用40X 物镜定位目标细胞。健康细胞应呈杆状，且无自发性收缩；当以5–20 V进行电刺激时，应可见其均匀收缩。
9. 注意：生理学分析需要高质量的消化效果。可能存在外观健康但无法良好起搏的细胞，因此可能需要优化消化方案以获得高质量、健康的肌细胞。此外，突变型或病变心脏可能需要对方案进行调整。
10. 调节镜头旋转角度并调整光圈，使目标细胞在屏幕上呈水平排列，且背景不可见。
11. 将边缘检测条对齐至肌细胞两端，并调节阈值。在肌节排列均匀的区域设置肌节检测条；检测条覆盖的肌节区域越长（但不应跨越两种不同状态的肌节群体），肌节长度的数学模型将越准确。
12. 在记录前以2 Hz频率和5–20 V电压对细胞起搏10–15秒。
13. 开始记录轨迹。为获得最佳的钙瞬变记录效果，应尽量减少环境光。

6. 分析

1. 使用比率荧光和细胞尺寸测量数据采集软件分析荧光信号。

7. 进一步研究

1. 本方案提供的细胞过量，可用于多种其他实验，包括：固定与免疫染色、评估药物直接作用、短期培养以及原子力显微镜分析。

结果

在采集到收缩力和瞬时变化曲线后（图2），可使用适当的软件轻松分析数据。可对整个曲线或其部分进行平均处理（图3）。收缩功能可通过多种方式进行分析：对于收缩期功能，可通过缩短分数评估收缩幅度，通过达到峰值缩短时间或收缩速度评估收缩速率；舒张期功能则可通过达到50%缩短所需时间及舒张速率进行类似分析。对于钙瞬变，也可进行类似比较，包括基础值和峰值Fura-2比值，以及达到峰值或恢复至基础值所需时间（表8）。这些分析可提供来自野生型（WT）和基因敲除型（KO）心脏的细胞水平收缩期与舒张期收缩功能以及钙通量的可比数据，上述任一参数均可能在整体器官功能障碍相似的心脏中发生改变。此外，同一次分离获得的细胞还可用于本方案中列出的其他实验，包括免疫组织化学染色（图4）。

无 Ca2+ ...

讨论

获得高质量的心肌细胞需要一定程度的实践和优化。本方案包含若干关键步骤，这些步骤会显著影响消化的效果。在执行和排查方案问题时应仔细考虑这些因素。从取出心脏到插管和灌注的时间应尽量缩短，理想情况下应少于五分钟。将心脏从小鼠体内取出后立即用冰冻灌注缓冲液冲洗，并在冰冻缓冲液中进行心脏解剖和插管，也有助于提高消化质量。插管本身是一个关键步骤。导管尖端必须置于主动脉的第一分支以下，但不能穿过主动脉瓣进入心室，否则将阻碍冠状动脉的灌注。冠状动脉灌注对于获得高质量的消化至关重要。在本实验室中，导管连接至装有灌注缓冲液的注射器。安装导管后，轻轻注入少量灌注缓冲液，并观察冠状动脉血液是否被清除，以此可检验插管是否到位。

解决本方案中的问题需仔细评估上述关键步骤。如果在消化过程中心脏未明显变软，可能存在几种原因。首先，在插管时，插管尖端可能已越过主动脉瓣，导致无法通过冠状动脉进行灌注。此问题可在将心脏悬挂于朗格多夫装置前进行评估：用注射器向插管内推注少量灌注缓冲液，并仔细观察冠状动脉内血液是否被清除。若灌注充分但心脏消化效果仍不佳，可考虑更换不同批次的酶。由于这些酶实际为混合物，不同批次的作用效果并不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	RPI	S23020
KCl	Sigma	P-3911
MgCl2	Sigma	M-8266
HEPES	EM Science	S320
NaH2PO4	Sigma	S5011
CaCl2·2H2O	Fisher	C79
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7528
2,3-丁二酮一肟（BDM）	Sigma	B-0753
牛磺酸	Sigma	T-0625
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A-7030
胶原酶B	Roche Diagnostics	1-088-823
胶原酶D	Roche Diagnostics	1-088-882
蛋白酶XIV	Sigma	P-5147
肝素	APP Pharmaceuticals, LLC	401586D
异氟烷	Butler Schein	11695-6776-2
Fura-2 AM	Teflabs	103
DMSO – 无水	Sigma	276855
IonOptix细胞刺激与荧光分析系统	IonOptix
250 μm 尼龙筛网滤膜	Sefar America	Lab Pak 03-250/50
23 G Luer-短管接头	Becton Dickinson	1482619E
PE-50导管	Becton Dickinson	427410