小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

摘要

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。

摘要

视网膜血流的改变可能促成或源于眼部疾病和视觉功能障碍。因此，定量测定灌注变化有助于研究视网膜病变的机制。通过活体荧光示踪剂视频显微镜技术，可测量视网膜血管的血管直径和血流速度，特别是由中央视网膜动脉分支出的动脉以及汇入中央视网膜静脉的静脉。通过血管直径和血流速度可计算血流量，将所有小动脉血流和小静脉血流分别加总，即可获得总的视网膜血流量。本文及配套视频描述了在小鼠中应用该技术的方法，包括：1）对麻醉动物进行活体显微观察前的眼部准备；2）静脉输注荧光微球以测量血流速度；3）静脉输注高分子量荧光葡聚糖，以增强视网膜微血管的显微可视性；4）使用数字显微相机获取灌注后视网膜的视频；以及 5）使用图像处理软件分析视频。这些相同技术也可用于测量大鼠的视网膜血流速率。

引言

视网膜是人体中代谢最活跃的组织之一，因此需要充足的血液供应。两套独立的循环系统满足这一需求：脉络膜循环供应视网膜外层，视网膜循环供应视网膜内层。对视网膜灌注的研究对于理解糖尿病性视网膜病变、氧诱导性视网膜病变、视网膜动脉或静脉阻塞以及中风的病理机制和后果至关重要。已有多种方法用于定量测量视网膜血流，每种技术都有其优势、劣势、局限性和假设条件。这些技术包括注入直径为7-8 μm的微球，使其嵌顿于毛细血管前微动脉^1,2、定量放射自显影^3,4、光学微血管成像-光学相干断层扫描^5,6、磁共振成像^7,8以及活体视频显微技术^9-16。其中，活体视频显微技术的优势包括可直接实时观察视网膜血管及其血流、所需假设较少，以及对于配备荧光显微镜和连接视频相机的实验室而言成本较低。在以往的活体视频显微研究^9-16中，通常使用荧光标记的葡聚糖作为血浆标记物，使用荧光标记的红细胞（来自供体动物）作为流速标记物。在本实验方案中，采用直径为1.9 μm的荧光标记微球代替红细胞来测量流速，这一改进消除了对血液供体动物的需求。

方案

涉及动物使用的实验方案均经路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校机构动物照护与使用委员会审查并批准，并依照美国国立卫生研究院规定的要求执行。

1. 灌注溶液的制备

1. 对浓度为1%（重量比）的1.9 µm直径微球储备液进行超声处理。
2. 用300 µl注射器吸取约25–30 × 10⁶个绿色荧光微球（即约10 µl储备液），再吸入240 µl生理盐水，将微球稀释。
3. 配制50 µl无菌生理盐水溶液，其中溶解有分子量为2 × 10⁶的荧光葡聚糖，注射剂量范围为3–10 mg/kg。在使用前，将葡聚糖溶液用铝箔包裹避光保存。

2. 动物麻醉与血管插管

1. 为进行血管插管手术以及在显微镜物镜下固定动物，需对动物实施麻醉。可选择的麻醉方案有多种，各有其优缺点，并可能对全身生理参数产生不同影响。常用方案包括 氯胺酮（100–150 mg/kg）、赛拉嗪（10 mg/kg）和乙酰丙嗪（2 mg/kg）的联合使用，或氯胺酮（50 mg/kg）与戊巴比妥（50 mg/kg）联合使用。  本实验为急性实验，最终通过过量戊巴比妥（150 mg/kg）实施安乐死，随后行胸廓切开术；终末性操作无需使用镇痛剂。
2. 实验剩余时间内，将加热垫置于动物下方以维持体温。
3. 在后续进行血管插管手术期间，使用磷酸盐缓冲液保持眼睛湿润。
4. 准备用于后续注射荧光示踪剂的血管插管。取一段20 cm长的聚乙烯导管（例如，内径0.28 mm，外径0.61 mm），将其套在注射器针头尖端，使用止血钳反复弯折预先折断针头的锐利端。
5. 用肝素化生理盐水（25 U/ml）填充注射器及导管。
6. 剃除下腹部一侧毛发，并做切口以暴露股静脉。
7. 为插入股静脉，先用5.0缝线结扎血管，然后对血管进行部分切开（约血管直径的一半），将导管插入血管，并用缝线结扎固定插管段。

3. 活体显微镜检查的准备

1. 使用一滴1%托吡卡胺滴眼液使瞳孔散大，随后再使用一滴2.5%羟丙甲纤维素滴眼液。
2. 用一片5 mm的玻璃盖玻片覆盖眼睛。
3. 将动物放置在一块聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）板上，该板将置于直立显微镜的物镜下方。在动物头部下方适当放置外科纱布，以确保物镜与视网膜中央及视盘之间形成直接的光轴通路。
4. 通过显微镜对准视盘，先使用低倍率4X 物镜并配合荧光素滤光片找到视盘位置。

4. 注入荧光微球以测量流速

1. 使用4X 物镜，将视网膜对焦，使视盘位于视野中央。
2. 以250 µl/min/kg的速率输注荧光微球溶液。
3. 使用约8毫秒的相机曝光时间，录像记录视盘周围可见的视网膜区域。
4. 当已录制足够时长的视频（1-2分钟）后，停止微球输注；部分微球溶液可能仍未使用。

5. 注入荧光血浆标记物以测量直径

1. 使用 4X 物镜，将视网膜的视盘置于视野中央并进行聚焦。
2. 将制备好的荧光葡聚糖溶液经股静脉以团注方式在约 5 秒内注入，同时进行视频记录。该视频将有助于区分小动脉与小静脉，其中小动脉会首先被灌注。此步骤的相机曝光时间应设为约 8 毫秒，尽管精确的曝光时间并非关键。
3. 切换至 10X 物镜，并将曝光时间设为 20–40 毫秒，以提高分辨率，对浅层视网膜中的 4–7 条小动脉和 4–7 条小静脉逐一进行视频记录。每次聚焦并视频记录可视视网膜的大约一个象限区域，使视盘中心位于视野的一个角落。应尽量减少显微镜光源照射组织的时间，以降低光/染料诱导的光毒性风险¹⁷。

6. 视频分析

1. 使用微米刻度尺对视频系统进行校准，以实现 µm/像素的换算。
2. 利用图像处理软件回放录制的视频。
3. 根据荧光葡聚糖团注视频，区分微动脉与微静脉。
4. 针对使用10X 物镜记录的每根4-7条微动脉和4-7条微静脉，测量其中被荧光葡聚糖填充的血管直径，并在每条血管可见长度范围内取5个测量值取平均。
5. 对上述相同的微动脉和微静脉，测量荧光微球的轨迹长度，每条血管内选取连续10个微球轨迹以避免选择偏差。将轨迹长度除以曝光时间，计算微球速度，例如：160 µm/8 msec = 20 µm/msec = 2 cm/sec。每条血管取10个速度值取平均。
6. 使用以下公式计算每条血管的体积流量：流量 = 平均速度 × π × 直径²/4。
7. 分别对所有微动脉和微静脉的流量进行加总，得到总的视网膜血流量。

结果

图1 显示一项实验视频的单帧图像，其中图A-D和F-I为使用4X物镜捕获的荧光微球轨迹 物镜，8毫秒曝光时间（及2× binning） 2 像素以减小视频文件大小）。 图1E 显示了图中其他面板中视网膜血管的走向。并非视频的每一帧都会有一个清晰对焦的荧光条带；然而，部分帧可能包含多个可用于分析的条带（例如 C、D、G、H 和 I）。在本实验中，大多数荧光条带（曝光时间为 8 msec 时捕获）的长度在 120–170 范围内 µm，相当于流速为1.5–2.1 cm/sec。

图2展示了通过团注输入2× 10⁶分子量的荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖后视频的九个帧，所选帧之间的时间间隔为0.071秒（为帧采集速率的两倍）。图2中第一幅与最后一幅图像之间的时间长度约为0.57秒。首先被荧光葡聚糖填充的血管（见图A-D）为小动脉，在此对应于约1:30、4:30、7:00和...

讨论

这种活体视频显微技术不仅可用于小鼠，也可用于大鼠。本方案仅基于少数几个假设，但如我们所述，其应用仅限于麻醉和瞳孔扩张条件下。其他假设与局限性如下：

1. 假设由于眼睛的折射特性导致的光学放大误差极小。正如其他研究者所述^18-20，通过在角膜与盖玻片之间填充眼科溶液液体层，可抵消角膜的折射能力。任何未被校正的放大效应都会影响长度和直径的测量结果。

2. 光学分辨率的局限性。我们通常使用10X 物镜（工作距离 = 1.05 cm）进行直径测量，该物镜的数值孔径为0.25，标称分辨率为~1.2 µm（约等于测量的不确定度）。在当前放大倍数下，整体分辨率不受相机/图像处理器分辨率的限制；无像素合并时为0.47 µm/像素，2 x 2像素合并时为0.94 µm/像素。只要工作距离足够，本方案可采用更高数值孔径的物镜以提高分辨率：小鼠和大鼠眼球的轴向长度分别约为3.4 mm和6.3 mm^21-23。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光微球	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (绿色)
高分子量荧光葡聚糖	Molecular Probes	D-7137 (绿色); D-7139 (红色)
显微镜系统	Nikon	Eclipse E600FN + 附件
4X 物镜	Nikon	Plan Fluor 4X	数值孔径 0.13；工作距离 17.2 mm
10X 物镜	Nikon	Plan 10X	数值孔径 0.25；工作距离 10.5 mm
托吡卡胺滴眼液	Bausch & Lomb	1% 托吡卡胺
羟丙甲纤维素滴眼液	HUB Pharmaceuticals	2.5% Goniovisc
图像处理软件	加利福尼亚大学旧金山分校 Vale 实验室	Micro-Manager
显微用数字摄像机	Photometrics	CoolSnap ES	分辨率 1392 x 1040 像素；像素尺寸 6.45 x 6.45 μm