使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

摘要

了解韧皮部汁液的组成及其装载和长距离运输的机制，对于理解植物发育以及胁迫/病原体响应中的长距离信号传导和同化物运输至关重要。本文描述了利用EDTA促进法收集韧皮部渗出物的方法。

摘要

植物韧皮部对于（光合）同化物以及传递生物或非生物胁迫信号的长距离运输至关重要。韧皮部含有糖类、氨基酸、蛋白质、RNA、脂质及其他代谢物。尽管人们对了解韧皮部的组成和功能有极大兴趣，但其中许多分子的作用及其在植物发育和胁迫响应中的重要性仍有待确定。韧皮部分析的一个障碍在于，韧皮部在受到损伤时会自我封闭。因此，能够获取韧皮部汁液的植物种类十分有限。本文所述的EDTA辅助韧皮部渗出物收集法是一种无需额外设备即可从多种植物物种中收集韧皮部渗出物的方法。该方法虽然操作简便，但会导致细胞损伤，因此必须小心去除受损细胞的内容物。此外，还需设置多个对照以验证渗出物的纯度。由于这是一种渗出过程，而非直接采集韧皮部汁液（在许多物种中不可行），因此只能对其中成分进行相对定量。该方法相较于其他方法的优势在于，它适用于多种草本或木本植物物种（Perilla、Arabidopsis、poplar、etc.），且所需设备和培训极少。该方法可获得相对大量的渗出物，可用于后续的蛋白质、糖类、脂质、RNA、病毒及代谢物分析。其操作足够简单，既可用于科研实验室，也可用于教学实验室。

引言

植物无法移动以逃避不利环境。因此，它们必须进化出检测环境胁迫、在全株范围内引发并传递相关信号，以及相应调整发育过程的机制。植物体内存在两种运输系统，用于水分、养分及其他（信号）化合物的分配。第一种是木质部，通常负责将根部吸收的水分和矿物质输送到整个植株。第二种是韧皮部。人们对韧皮部的认识已从简单的同化物运输系统，转变为认识到它是RNA、蛋白质、病毒、脂类及其他小分子的运输通道。韧皮部在同化物和养分运输、对生物和非生物胁迫的响应，以及植物生长与发育过程中发挥着重要作用。如今，它被称为植物的"信息高速公路"¹⁸。

韧皮部由多种细胞类型组成：韧皮薄壁细胞，以及特化的伴胞和筛管分子。筛管分子是长距离运输的场所。为了实现畅通的纵向流动，筛管分子缺失了大部分细胞器和细胞核，被认为最多仅含有有限的翻译机制^{21, 33}。人们认为伴胞合成蛋白质和其他化合物，这些物质随韧皮部汁液流动而运输。随后，这些化合物通过胞间连丝转运至筛管分子中，并可作为长距离信号分子发挥作用^4,16。

韧皮部渗出物中可发现几类化合物：

• 糖通常是光合作用的产物，并以 "携带能量的" 分子可被运输至植物的其他部位用于储存或作为结构单元，但也可能发挥抗冻剂或信号传导分子的作用。
• 在韧皮部渗出物中也可以发现蛋白质。这些蛋白质包括代谢酶，同时也具有信号传导功能。一个作为发育信号的蛋白质例子是成花位点T蛋白（Flowering locus T protein），它在植物中可传递成花诱导以及季节性叶片脱落的信号。⁶
• 韧皮部渗出物中含有核酸，其形式包括mRNA、小RNA和微小RNA以及病毒RNA。这些核酸似乎主要参与信号传导过程 ^{27, 28, 39}同时，在葫芦科植物的韧皮部汁液中已观察到几乎所有氨基酸的rRNA和tRNA。⁴²它们似乎被选择性地转移到筛管系统中。这些tRNA经过修饰，具备将氨基酸转运至翻译装置的能力。然而，它们似乎并不参与翻译过程，反而可能抑制该过程。或者，它们可作为细胞分裂素的来源，或传递植物的代谢状态信号。⁴².
• 在韧皮部渗出物中也发现了脂肪酸、氧脂类及其他脂质 ^{3, 13, 14, 23}茉莉酸是一种氧化脂质，在植物对病原体感染的响应过程中通过韧皮部进行运输。^{22, 29, 31, 32}尽管大多数韧皮部脂质的功能尚不明确，但其中一些可能具有信号传导功能⁴.

研究植物韧皮部的难点在于其受伤后具有自我封闭的能力。目前有四种主要方法用于收集韧皮部分泌物，但这些方法仅适用于特定物种：

1) 在葫芦科植物中，可通过切去叶柄获得较大量的韧皮部渗出液。去除最初含有受损细胞污染物的液滴后，即可获得相对大量且较为纯净的韧皮部汁液。 ^{1, 15}然而，随着收集时间的延长，该渗出液逐渐变稠，越来越不适合用于液相色谱分析方法（未发表）。近期研究表明，根据物种的不同，这种韧皮部汁液可能来源于维管束内韧皮部（FP）或维管束外韧皮部（EP），并且尽管其中含有 "移动的" 来自筛管分子的韧皮部汁液（FP）也容易受到包括木质部在内的其他细胞类型的污染^{40, 41}.

2）第二种方法是通过在茎或叶柄上制造浅层切口或穿刺来获取韧皮部汁液。该方法已成功应用于羽扇豆^{17, 25}、葫芦科植物³⁶以及Brassica napus¹²。此法所获得的汁液细胞损伤污染极少，渗出物非常纯净。然而，植物必须保持健康且水分充足，因为精准穿刺筛管分子极具挑战性。若刺伤木质部导管，所有渗出液将被吸入木质部液流中。因此，该方法不适用于叶柄或茎部极为脆弱或高度木质化的植物。

3) 蚜虫吻针切除术允许蚜虫将其吻针插入筛管分子，随后用激光去除蚜虫，韧皮部汁液会通过残留的吻针渗出^{2, 9, 10, 35, 38}。理论上，任何可被蚜虫感染的植物均可用于该方法。然而，大多数温室或人工气候室管理者不会允许使用病原体。此外，蚜虫会通过唾液向韧皮部引入多种蛋白质^{19, 33}，导致有限的转录重编程³⁰，并可能改变韧皮部的成分²⁶。

4) 此处所述方法为EDTA辅助的韧皮部汁液渗出法。该方法利用EDTA防止韧皮部闭合²⁰。EDTA通过螯合Ca²⁺离子，阻止其参与导致韧皮部闭合的生理过程。尽管EDTA可能引起细胞损伤³⁰，但已有多个研究团队使用该方法，并发现10 mM至20 mM浓度范围内的EDTA对细胞超微结构以及韧皮部装载和运输均无不良影响^{5, 24}。为减少EDTA可能造成的损伤及其在色谱分析和凝胶电泳中的干扰，植物在处理1小时后需转移至水中，且仅使用后期渗出的汁液进行分析¹⁴。因此，实际收集的是在EDTA辅助下渗出至水中的韧皮部汁液（即EDTA辅助渗出法）。这是一种操作简便、成本低、技术要求低的韧皮部渗出物收集方法。通过该方法获得的韧皮部汁液可用于分析蛋白质、小分子、脂质和RNA，并已在多种植物中成功应用。尽管在单子叶植物中进行的实验较为有限¹¹，但该方法似乎更适用于双子叶植物（Perilla^{17, 20}、Arabidopsis^{8, 13, 14}、Poplar⁷）。渗出物的收集必须在高湿度环境中进行，以避免因蒸腾作用导致汁液损失。根据植物种类不同，在EDTA中孵育一至两小时足以防止韧皮部或筛管元件闭合。随后可将渗出物收集至水中。这种方法的优势在于避免了EDTA对细胞结构和稳定性的负面影响，同时消除了EDTA对高效液相色谱（HPLC）或SDS-PAGE等分析技术的干扰。文中示例以Arabidopsis为例。对于较大的植物，EDTA孵育和渗出物收集需相应放大规模，通常使用烧杯而非1.7 ml离心管进行操作。

方案

1. 植物的准备

1. 拟南芥 种子可直接在土壤或MS平板上萌发。将植株置于培养室中生长4至6周，光照周期为12小时 光周期（22 °C 白天，15 °C 夜间）¹⁴每周浇水一至两次。采用底部托盘浇水法；切勿从上方直接浇水；再次浇水前需确保托盘已干燥。收获时应确保植株水分充足。

2. 溶液与培养皿的准备

1. K₂-EDTA 溶液：配制 100 mM 的 K₂-EDTA 储存液，可保存于冰箱中。在取样当天，将该溶液按 1:5 的比例稀释（1 份 EDTA 溶液，4 份水），得到 20 mM 的 K₂-EDTA 溶液。
2. 用 20 mM 的 K₂-EDTA 溶液将玻璃皿或培养皿（直径 7–15 cm）填充至一半。若需采集不同处理的样品（例如对照组和盐胁迫处理的植株，或不同基因型的植株），应为每种处理分别准备独立的培养皿。
3. 将所需数量的 1.7 ml 反应管分别加入 1.4 ml 的 20 mM K₂-EDTA 溶液；另取相同数量的反应管，每管加入 1.4 ml 经高压灭菌的去离子水或 Millipore 水。
4. 在实验台上铺上纸巾用于放置植株；准备一把新的剃须刀片，并戴上手套。

3. 韧皮部渗出物的收集（见图1中的流程图）

1. 用剃刀在莲座叶叶柄基部靠近莲座中心处切割，采集四至六周龄植株的莲座叶。
2. 立即将叶片放入含有 20 mM K 的培养皿中₂-EDTA。确保叶柄的切割端浸没在溶液中（图2).
3. 当采集到约15片叶片（相当于3至4株植物）后，将叶片轻轻叠放，使叶柄切口相互对齐。重新剪切叶柄基部（约1 mm），并立即将叶片转移至含有20 mM K的反应管之一中₂-EDTA 溶液中。叶片稍卷曲后更容易放入。避免用力挤压叶片，因为这可能导致细胞损伤，从而引起叶片细胞内容物的释放。
4. 如需更多材料，用湿润的纸巾轻轻覆盖样品。若需收集不同处理或基因型的样品，应使用一套新的器皿。
5. 将所有样品放入反应管后，应在黑暗或光照条件下收集渗出物。
6. 为在黑暗条件下收集，将一个大型浅底容器的底部铺上湿润的纸巾。将装有叶片的反应管置于支架上，并放入该容器中，然后用湿润的纸巾覆盖，或将其放入带有通气狭缝的黑色塑料袋中。将整个装置放置于柜子或暗室中。
7. 在光照条件下收集时，用湿润的纸巾铺满透明有机玻璃容器底部。将装有叶片反应管的支架放入容器中，并盖上盖子。
8. 1小时后，轻轻将叶片从容器和反应管中取出，用蒸馏去离子水或Millipore水充分冲洗，以彻底去除所有EDTA。此步骤具有三个目的：（1）去除EDTA以尽量减少对细胞的损伤；（2）消除EDTA对SDS-PAGE和层析分析的干扰；（3）去除因切割或损伤细胞而积累的各类化合物。立即将叶片转移至预先准备好的含有高压灭菌水的反应管中，并放回加湿的收集容器内，用于收集渗出物。此时，若后续需进行RNA提取，可加入RNase抑制剂。可选：如需进行蛋白质分析，可加入蛋白酶抑制剂。
9. 在预定的收集时间结束后，取出并丢弃叶片，将韧皮部渗出物在液氮中速冻₂ 以备后续使用。如需长期保存，请将样品冻干后于 -80 °C 保存。
10. 在……的情况下 拟南芥，代谢物在收集渗出液1小时后即可被检测到。然而，建议收集5-8小时 如果计划分析丰度较低的组分，则建议对较大的植物如 紫苏建议延长采集时间（8 小时）。
    从15片叶片收集的渗出液通常足以用于SDS-PAGE凝胶电泳（蛋白质分析）、mRNA提取以及GC-MS分析（糖类和代谢物）中的一个泳道。对于脂质分析，建议合并2-3个样本（来自30-45片叶片的渗出液），以获得更清晰的结果。

4. 后续分析（视频中仅展示 4.4）

1. 用于蛋白质分析时，将样品重悬于15 μl水和30 μl Lämmli缓冲液中，95 °C加热5分钟，短暂离心去除沉淀，将全部样品加载至SDS-PAGE凝胶（上样孔体积为45 μl）。由于蛋白质含量极低，样品应使用胶体考马斯亮蓝或其他高灵敏度染色方法进行染色。
2. 用于糖类和小分子代谢物分析时，按照文献所述向干燥样品中加入衍生化试剂¹⁴.
3. mRNA 可通过 RT-PCR、微阵列或 RNA-Seq 分析进行检测。
4. 用于脂质分析时，立即混合两到三个样本，并在通风橱中用氯仿:甲醇（1:1）进行分相，具体步骤如下：向每个样本中加入等体积的氯仿:甲醇，涡旋震荡数秒，然后离心4分钟 在400 × g条件下离心。收集下层（有机相）至带聚四氟乙烯盖的玻璃管中，并与上层水相再分配三次。将合并的有机相在氮气流下干燥₂ 并提交进一步分析（薄层色谱：TLC）^{14, 37}液相色谱-质谱联用：LC-MS¹⁴).

结果

近年来越来越明确的是，韧皮部汁液的复杂性可能是解释植物如何传递多种发育和胁迫信号以实现最佳响应的关键。利用EDTA促进的韧皮部分泌方法，可能为分析那些不适合采用其他方法、但在经济或生理上具有研究价值的植物的韧皮部渗出物提供了机会。

该方法可收集到足量的韧皮部渗出物用于鉴定 韧皮部定位蛋白 并检测其在发育或胁迫条件下水平的变化（图3）。如图所示，蛋白质的含量虽然极低，但其浓度已足以进行后续的蛋白质组学实验，如LC-MS/MS，或用于Western blot分析。在葫芦科植物中的研究发现，茎部切割会导致水势平衡被破坏，进而引起水分及可能的污染物从质外体渗入⁴¹然而，收集时间从一到八小时并不影响韧皮部蛋白质谱/组成 拟南芥 （仅绝对含量有所不同 Guelette） 等），所收集的蛋白质含量及检测到的蛋白质谱在不同物种间存在差异（拟南芥：A.t.； 紫苏，泳道 I 和 NI）以及处理（紫苏 在不同光周期下生长的植株（I 和 NI 泳道）。因此，可以对蛋白质类信号进行可视化、鉴定和追踪。

mRNA 和 micro RNA 也可通过此方法在韧皮部渗出物中被鉴定。然而，必须使用RNase抑制剂处理，以防止mRNA在较长的渗出时间内发生降解。由于筛管分子不含功能性叶绿体，因此核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基或大亚基（RbcS 或 RbcL）的mRNA可作为阴性对照，而已知在韧皮部定位于的泛素结合酶mRNA则可作为阳性对照（图4）。

同样，糖类或小分子代谢物可采用GC-MS或LC-MS进行分析。需要指出的是，韧皮部渗出物中含有大量具有功能的酶类，包括几乎完整的糖酵解途径¹²。因此，采用多个时间点取样可能揭示渗出物收集过程中的代谢动态。如图5所示：在所有渗出物中，蔗糖均为最丰富的代谢物，这在收集1小时后最为明显。然而，经过5小时收集后，蔗糖与果糖的比值略有下降。若将同一份渗出物收集1小时后，在室温下放置接下来的4小时，其蔗糖与果糖的比值则显著降低，表明韧皮部渗出物中活性酶在室温下导致蔗糖降解（更多峰的解析参见¹⁴）。该结果与已有研究一致，即从伴胞向筛管分子装载和运输分子的过程在渗出期间可能持续进行，直至系统失去活力³⁴。

脂质在韧皮部渗出物中的存在，以及由此延伸出的长距离脂质信号传导，是植物科学中一个相对较新的研究领域。由于脂质具有疏水性，其在渗出物中仅以较低浓度存在，并可能与其他分子结合以实现溶解。然而，通过EDTA促进的渗出方法，能够收集到足够的样品，用于对多种植物物种的韧皮部脂质进行可视化分析（薄层色谱法，TLC；图6）和鉴定（液相色谱-质谱联用，LC-MS；图7）。如图所示，可以实现多种脂质组分的分离与鉴定。LC-MS技术不仅可用于鉴定不同的脂质种类，还可用于监测不同基因型或处理条件下脂质谱的变化，从而有助于研究脂质在植物发育及胁迫响应过程中的作用。

图1. 拟南芥或紫苏韧皮部渗出物采集流程图。不同路径通向不同的最终产物，以蓝色标示。制备RNA时，需在收集韧皮部渗出物的水中加入RNase抑制剂（100 U/ml，Roche）。
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图 2. 韧皮部渗出液采集的材料准备装置。该装置展示了步骤 3.1–3.4 所需的全部材料。
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图3. 在两种不同植物物种——拟南芥（Arabidopsis，A.t.）和紫苏（Perilla，I 和 NI；不同光照时长）的韧皮部渗出物中发现的蛋白质；MW：分子量标记（第2道）；使用10-20%的梯度SDS-PAGE进行蛋白质分离。
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图 4. Rubisco 小亚基和大亚基（分别为 RbcS 和 RbcL）以及泛素结合酶（UBC）mRNA 存在性的分析。mRNA 来源于拟南芥（Arabidopsis）叶片（L）、叶柄（P）和韧皮部渗出物（Ph），经逆转录后通过 PCR 检测特异性转录本。该图改编自 Guelette et al.¹⁴。
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图 5. 不同收集时间下韧皮部渗出物的气相色谱-质谱（GC-MS）分析图谱。注意蔗糖的相对含量在收集1小时（A）与收集5小时（B）之间的变化。收集1小时后，在室温（RT）下“孵育”4小时的渗出物图谱（C）。叶片代谢物图谱（D）。
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图6. 薄层色谱图比较不同脂质 紫苏 （左）和 拟南芥 （右）叶片与韧皮部渗出物。星号表示韧皮部渗出物中特有的脂质。DGDG：二半乳糖基二酰基甘油；PG：磷脂酰甘油；MGDG：单半乳糖基二酰基甘油；图中显示的部分为 拟南芥 脂质的提取方法已根据Guelette的方法进行了修改 等¹⁴.
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图 7. 利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）负离子模式分析拟南芥（Arabidopsis）韧皮部渗出物的脂质谱（氯仿相）。上方（突变体，A）和下方（野生型，B）的图谱显示了两种不同基因型之间脂质谱的差异（由箭头指示）。
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讨论

利用EDTA促进韧皮部渗出物的收集非常简单，所需设备极少，且适用于大多数植物。总体而言，该方法扩展了对更多物种韧皮部渗出物进行分析的能力。尽管渗出物被稀释，但易于从多株植物或多个样本中大量收集，从而获得足够量的材料。这使得检测那些丰度极低、 otherwise 易被忽略的新化合物成为可能。

该方法适用于多种植物物种，并可按照本文所述用于所列物种。若探索新物种，可能需要调整的两个方面是所用叶片的数量和渗出时间。大多数情况下，5至8小时的渗出时间是合适的。为验证该方法在新植物物种中的适用性，需收集渗出液，并进行第4部分实验方案中描述的一种或多种后续分析。根据观察到的信号强度，可能需要增加收集量。通常，脂质和蛋白质分析所需的样品量多于糖类和代谢物分析，因为前者在韧皮部渗出液中的含量较低。

由于EDTA辅助的渗出液收集方法涉及切面以及EDTA可能带来的细胞损伤效应，需考虑以下几点：（1）在EDTA孵育一小时后，必须彻底清洗叶柄，以去除来自受损细胞的化合物以及EDTA本身，避免其对细胞造成损伤或干扰后续提取过程。（2）需要设置阳性和阴性对照，以确保所获得的数据来源于韧皮部汁液而非受伤细胞（见下文关键步骤）。（3）韧皮部汁液中含有多种酶类，可能在渗出过程中保持活性，因此在某些情况下，采用不同时间长度进行收集可能更为合适。（4）由于该方法是将渗出物收集至水中，因此无法对化合物进行绝对定量。

关键步骤：成功使用该方法的关键在于处理样品时需格外小心，避免损伤任何细胞，同时设置适当的对照（参见参考文献¹⁴）。一种合适的对照是不预先用EDTA处理而直接收集韧皮部渗出物。在此情况下，韧皮部会自行封闭，无法收集到渗出物，从而可检测到由受伤细胞带来的任何污染化合物。第二种对照是对渗出物中的糖类进行分析。在Arabidopsis中，蔗糖应为韧皮部汁液中的主要代谢物，果糖与蔗糖的比例应在1:4至1:8之间（参考文献^{8, 14}）。

进行RNA提取时，必须使用RNase抑制剂。此外，建议设置阳性对照，如先前报道的韧皮部定位mRNA（UBC9：泛素结合酶9，At4g27960；^{8, 14}），以及阴性对照，例如叶绿体mRNA（Rubisco LSU）。

由于渗出液含有活性酶，建议进行时间过程实验，以确保韧皮部谱型的变化并非仅仅源于收集时间的差异。在某些情况下，使用蛋白酶抑制剂可能有益。然而，研究者需要注意，所收集的渗出液将会被浓缩，任何添加的化合物也会被大幅浓缩。本实验方案中的第二个关键步骤是在 EDTA 溶液中重新切割叶柄。此步骤具有双重目的：第一，去除可能已封闭的筛板，同时防止新的堵塞物形成，从而允许韧皮部汁液自由流出；第二，去除切割过程中在木质部中产生的气穴气泡，从而恢复木质部的运输功能。第二次切割的位置取决于所用植物种类。对于叶柄较大的植物，第二次切割应位于第一次切口上方几毫米（最多达 1 cm）处；而对于拟南芥（Arabidopsis）等植物，1–2 mm 即已足够。

采用该方法可发现韧皮部渗出物中具有信号传导、发育或生物医学意义的新化合物。该方法促使人们更加深入地研究长距离脂质信号传导，而这一领域由于难以获取韧皮部样品，在植物科学中此前鲜有研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
浅底玻璃或塑料培养皿（7-15 cm）	PYREX 或 Corning		任何洁净的浅底容器均可使用
氯仿	EMD	CX1054-1	仅可在通风橱中打开容器
甲醇	J.T.Baker	9070-03
带螺口盖的试管	VWR International	53283-800
带螺口盖的试管	Sun Sri	13-425
Eppendorf 管	Denville	C2170