急性肝衰竭中带门静脉动脉化流量调节的异位辅助性大鼠肝移植

摘要

辅助性肝移植可在急性肝衰竭时提供临时支持，直至衰竭肝脏再生。异位辅助性肝移植（HALT）联合门静脉动脉化（PVA）可提供充分的肝功能。我们建立了大鼠的类似技术，以研究门静脉动脉化对移植物形态和功能的影响。

摘要

在急性肝衰竭中，辅助性肝移植是一种颇具吸引力的替代治疗方案。其目的是在功能衰竭的原位肝脏再生之前提供暂时性支持^1-3。APOLT 方法，即辅助肝段的原位植入，可避免大多数技术难题。但该方法需要对原位肝脏和移植肝组织进行广泛切除⁴。1998年，Erhard 开创了利用门静脉动脉化（PVA）的异位辅助性肝移植（HALT）技术（图1）。该技术在早期临床应用中显示出良好的效果^5-6。我们建立了一种在大鼠中采用血流调控型门静脉动脉化（PVA）的 HALT 技术，以研究血流调控型 PVA 对移植肝组织形态和功能的影响（图2）。

将肝脏移植物缩小至其原始体积的30%，在切除受体右肾后，异位植入受体的右肾区。  移植物的肝下腔静脉与受体的肝下腔静脉进行吻合。通过受体的右肾动脉，采用支架技术对供体门静脉进行动脉化。使用内径为0.3 mm的支架实现动脉化门静脉的血流调节。移植物的腹腔干以端侧吻合方式连接至受体的腹主动脉，胆管则植入十二指肠。对受体自身肝脏行次全切除术以诱导急性肝功能衰竭。 ⁷

采用该方法共进行了112例移植手术。围手术期存活率为90%，术后6周存活率为80%。术后6周，受体自身肝脏再生，重量由2.3±0.8 g增加至9.8±1 g；而移植肝的重量则由3.3±0.8 g减少至2.3±0.8 g。

在移植物形态和功能方面，我们获得了令人鼓舞的长期结果。采用流量调节型PVA的HALT可有效桥接急性肝衰竭，直至患者自身肝脏再生。

引言

急性肝衰竭在临床医学中是一个严重问题，其死亡率高达60-80%。⁸ 在急性肝衰竭中，辅助性肝移植是一种有前景的替代疗法，可用于度过急性期。保留受体自身肝脏以促使其再生，待再生完成后可停用免疫抑制药物，从而使移植物逐渐萎缩。然而，辅助性肝移植的手术技术仍存在争议。^1-3 在此背景下，Terpstra 报道了移植物空间不足、门静脉窃血现象以及静脉淤血和引流困难等问题。^9-10 供体门静脉以端侧吻合方式连接至受体门静脉，这会导致移植物与原肝之间的门静脉血流竞争，并引发门静脉血栓形成。大多数此类技术问题可通过采用APOLT法（辅助肝段原位植入）加以避免。⁴ 然而该方法需要对受体原肝和移植物进行广泛切除。⁴ 1998年，Erhard 及其团队开发了异位辅助性肝移植（HALT）技术，并结合使用门静脉动脉化（PVA）（图1）。该方法保留了受体原肝的肝门结构和门静脉，从而避免了门静脉血栓形成和门静脉窃血现象等不良副作用，有利于原肝的再生恢复。此外，该方法无需对受体原肝或移植物进行大范围肝切除，因此术中出血更少，且可保留更多的总肝实质质量，以支持过渡期（移植物）和再生过程（原肝）。该技术已显示出良好的初步临床效果。^5-6 本实验研究的目标是在大鼠模型中建立一种用于科研目的的、结合门静脉动脉化的HALT技术（图2）。在前期实验中，我们未考虑对动脉化的门静脉血流进行调控，结果再灌注后出现移植物淤血及肝包膜大量出血。¹¹  此后，我们通过使用内径0.3 mm、长度8 mm的支架来调控动脉化门静脉的血流量。预实验表明，0.3 mm直径的支架可使动脉化门静脉内的平均血流量维持在生理范围的上限水平（1.7 ± 0.4 ml/min/g肝重）。¹²  我们在未调控血流情况下的结果与Hong的研究一致，后者通过受体髂动脉实施了PVA途径的HALT。¹³ 在其未调控血流的实验中，也出现了严重的门静脉和窦状隙淤血。

本视频旨在逐步演示大鼠中一种新的实验性外科技术。从长远来看，该技术可用于肝脏再生、肝间竞争、门静脉动脉化、门静脉高灌注以及门静脉血流调节的相关研究。

方案

1. 实验动物

1. 根据动物保护FELASA指南（K 40, 17/99），为将要开展的所有实验获取当地伦理委员会的批准。
2. 使用可从任何商业供应商处购买的雄性Lewis大鼠（例如， Charles River Wiga GmbH，德国苏尔茨费尔德）。本研究共使用224只动物（112只供体，112只受体）进行112次移植手术。受体动物于术后6周被处死。手术时动物体重应为250–350 g。
3. 将动物饲养于温湿度可控的房间内，自由摄食和饮水。

2. 麻醉与手术准备

1. 将大鼠置于连接麻醉机的有机玻璃箱中，氧气流速为 1 L/min，异氟烷蒸发器设置为 5% 麻醉气体以诱导麻醉。维持麻醉时使用 1.5% 异氟烷。
2. 将大鼠仰卧位放置于加热板上。
3. 使用脱毛膏去除腹部毛发。
4. 按以下步骤准备无菌手术区域：使用消毒剂清洁操作台面；对手术切口部位的消毒，先使用氯己定，再用酒精，最后使用擦洗液（e.g., 含氯己定和 70% 异丙醇的溶液）。穿戴一次性手术衣和手术手套。
5. 使用无菌显微外科器械。
6. 使用手术显微镜，放大倍数为 12–20 倍。

3. 手术操作

1. 供体手术
   
   准备
   1. 行正中腹切口，按照 Higgins 描述的方法切除移植用的左外侧叶和正中叶。¹⁴
   2. 随后准备肝十二指肠韧带。首先结扎胆管以诱导小胆管充血和扩张。然后结扎并横断胃十二指肠静脉和动脉。之后分离腹腔干和肝总动脉，并横断胃左动脉和脾动脉。切开充血的胆管，将一根 20 号支架置入其中。支架的位置必须确保整个肝门部胆管系统能够引流通畅。在支架远端横断胆管。
   3. 分离下腔静脉的膈下段，位置位于右肾静脉上方。
      
      灌注
   4. 在腹腔干上方结扎腹主动脉后，夹闭门静脉并切开。将灌注导管（14 G）插入门静脉，用 30 ml 组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）溶液（12 cm H2O，4°C）进行灌注。
   5. 切开膈肌和肝上段下腔静脉，以便灌注液流出。
   6. 连同主动脉补片一并切除腹腔干，并用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液冲洗。
      
      摘取
   7. 在右肾静脉上方横断下腔静脉的膈下段。
   8. 然后，在门静脉内放置一根直径为 0.3 mm 的支架，并用结扎线固定。在接下来的手术中，通过右肾动脉实现门静脉的动脉化。在支架远端横断门静脉。
   9. 结扎肝上段下腔静脉后，连同膈肌袖状组织一并横断。
   10. 摘取移植肝并将其置于盛有组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）溶液的塑料袋中，冰上保存，温度为 4 °C。在膈下段下腔静脉处放置角缝线（8-0 Ethilon）。
2. 受体手术
   1. 行正中腹切口，暴露受体的膈下段下腔静脉。然后分离右肾动脉和输尿管，结扎输尿管并予以横断。在右肾动脉起始处夹闭该动脉，随后结扎右肾静脉。在结扎并横断双侧肾血管后，行肾切除术。随后缩短右肾动脉，并用肝素盐水溶液（每毫升生理盐水含 40 IU 肝素）冲洗。
   2. 在膈下段下腔静脉近端和远端夹闭后，于结扎线近端横断右肾静脉，从而在膈下段下腔静脉形成椭圆形管腔。用肝素盐水溶液冲洗下腔静脉。将移植肝植入受体腹部右侧肾区。
   3. 用 8-0 Ethilon 连续缝合线将供体的膈下段下腔静脉与受体的下腔静脉行端侧吻合。
   4. 用肝素/生理盐水溶液冲洗后，将门静脉内的支架置入右肾动脉内（图 3）。用两针缝线（8-0 Ethilon）连接门静脉与肾动脉。用结扎线（黑色编织丝线 7-0）将连接用支架固定于肾动脉内。
   5. 为实现再灌注，首先移除动脉夹，然后移除两枚静脉夹（图 4）。
   6. 准备肾下腹主动脉，放置近端和远端微血管夹，并在两夹之间正中切开腹主动脉。利用主动脉补片，用 10-0 Ethilon 连续缝合线在腹主动脉与供体腹腔干之间行端侧吻合。
   7. 将胆管插入十二指肠：在十二指肠壁上行荷包缝合，在荷包缝合中心处做一小切口。将带支架的胆管插入十二指肠内，收紧荷包缝合线。最后，用两针缝线（8-0 Ethilon）将十二指肠与胆管紧密固定（图 5）。
   8. 随后行原位肝的次全切除术，该方法最早由 Emond et al. 描述，用于模拟急性肝功能衰竭。⁷
   9. 用 4-0 Vicryl 缝线将移植肝的肝上段下腔静脉连同膈肌袖状组织固定于受体侧腹壁。用生理盐水冲洗腹腔（图 6）。
   10. 肌肉层采用 4-0 Vicryl 连续缝合，皮肤层采用 3-0 Vicryl 连续缝合。

4. 恢复与术后管理

1. 在红外线加热灯下让动物从麻醉中恢复。
2. 皮下注射布托啡诺，剂量为0.03–0.05 mg/kg体重，每8–12小时一次 2天。
3. 观察动物的一般状况以及疾病或感染的迹象。

5. 初始原位肝脏重量的计算

以如下方法计算初始的正常肝脏重量：从完整肝脏重量中减去被切除的肝叶重量（完整肝脏重量为体重的2.66%（该数值的标准差为±0.49%，基于先前使用同品系、同龄动物共80只的实验结果得出））。¹⁵

结果

移植手术的平均持续时间约为150分钟。冷缺血时间为64 ± 7分钟，热缺血时间少于25分钟。

围手术期存活率为90%，6周存活率为80%。20%的死亡病例中，有4例动物在术后第一周因支架移位和胆汁泄漏导致腹膜炎而死亡，另有7例动物在随后的五周内因肺炎、腹腔脓肿和肠梗阻而死亡。存活的动物总体状况良好。

术后六周，肝脏合成功能指标（Quick值：110 ± 7.8%，AT III：104 ± 6%）均在正常范围内。

在此时间点，原位肝脏已再生，重量从 2.3±0.8 g 增加至 9.8±1 g（P：0.0065）。移植物的重量则从 3.3±0.8 g 减少至 2.3±0.8 g（P：0.06）。两部分肝脏的总重量处于肝脏重量/体重的生理比例范围内（图 7）。

HALT术后6周，移植物的苏木精-伊红组织学染色显示肝细胞结构正常，无水肿或脂肪变性（图8）。所...

讨论

1966年，Lee et al.¹⁶ 首次描述了异位辅助性大鼠肝移植，随后由Hess¹⁷ 进一步开展。移植物的门静脉与受体的门静脉进行吻合。在此手术过程中，受体自身肝脏的门静脉血供会受到影响。

1991年，Hong通过受体的髂动脉使用PVA进行HALT¹³，由于未调控血流，导致门静脉和窦状隙出现严重充血。

此外，Aguirrezabalaga 等 采用PVA进行了HALT，但未充分关注动脉化门静脉中的血流调节。¹⁸

使用内径为 0.3 mm、长度为 8 mm 的支架，可在动脉化门静脉再灌注后获得处于生理范围上限的平均门静脉血流量。¹²

胆道引流是肝移植的薄弱环节。受体动物可能因胆汁渗漏和腹膜炎而面临死亡危险。为此，我们采用支架进行胆总管-十二指肠吻合术。此外，我们还使用荷包...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
编织丝线黑色 7-0	Ethicon 产品	892100
Vicryl 3-0	Ethicon 产品	J285G
Vicryl 4-0	Ethicon 产品	J284G
Ethilon 8-0	Ethicon 产品	1714G
Ethilon 10-0	Ethicon 产品	7770G
Vasofix 安全型 14G	B Braun	2758853
Vasofix 安全型 20G	B Braun	2758818
2 French（0.012”/0.3 mm 内径 × 0.025”/0.6 mm 外径）× 24”/60 cm 聚氨酯导管	Access Technologies，Norfolk Medical, Inc. 的分支机构，伊利诺伊州，美国	CNC-2P
HTK 溶液，Custodiol	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH，Alsbach-Hänlein，德国
异氟烷 5%			任意通用品牌
肝素			任意通用品牌
0.9% 生理盐水			任意通用品牌
丁丙诺啡			任意通用品牌