从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

摘要

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。

摘要

病变心脏的心肌细胞会经历复杂的重构过程，涉及细胞结构、兴奋-收缩耦联以及膜离子电流的变化。这些变化很可能 是导致心脏疾病患者心律失常风险增加以及收缩功能改变进而引起收缩期和舒张期功能障碍的原因。然而，目前关于心脏疾病中心肌细胞功能改变的大多数信息均来自动物模型。

本文描述并验证了一种从接受心脏手术的患者心室心肌小块外科样本中分离出有活性心肌细胞的方案。该方案进行了详细阐述。通过电生理学和细胞内钙离子浓度测定，证明了利用该方法获得的人心室心肌细胞进行多种单细胞检测的可行性。

本研究报道的方案可用于未来探讨不同心脏疾病存在时人类心脏功能改变的细胞和分子基础。此外，该方法可用于在细胞水平上识别新的治疗靶点，并测试新化合物对人心肌细胞的有效性，具有直接的转化价值。

引言

自单个心肌细胞分离技术发展以来，对心肌电生理特性的研究取得了显著进展。近年来，由于能够分离出保持完整组织全部生理特性的活性单个心肌细胞，人们对心脏兴奋-收缩耦联（EC-Coupling）的理解也得以深化。膜片钳技术被常规用于研究心肌细胞肌膜离子电流的功能及其药物调控作用。利用对Ca²⁺敏感的荧光染料记录细胞内钙动态变化，也常在多种健康与疾病模型的单个心肌细胞上进行，为兴奋-收缩耦联的生理机制以及导致机械功能障碍和心脏疾病中致心律失常风险增加的细胞内Ca²⁺稳态异常提供了关键数据。这些研究获得的信息对于理解药物在临床环境中的电生理和机械效应至关重要。然而，不同物种之间在跨膜电流和兴奋-收缩耦联蛋白方面存在特异性差异，这些差异决定了心脏动作电位和心脏力学特性的种属特征。因此，尽管对非人类哺乳动物来源的心肌细胞的研究阐明了特定跨膜离子通道和兴奋-收缩耦联蛋白的生物物理特性及其生理功能，但它们未必能准确反映人类心肌细胞的真实情况。因此，从人类心肌组织中分离出活性心肌细胞，对于全面理解心脏疾病的病理生理机制以及验证新的治疗策略至关重要。

在手术过程中，心耳组织通常会被丢弃，因此人类心房组织易于获取。早期对成人人类心脏动作电位和离子电流的定量研究采用了酶解法分离的心房细胞^1-4。随后也有报道对分离的成人人类心室细胞进行动作电位或电流记录^3,5-10。这些研究大多使用来自移植心脏的细胞，通过胶原酶灌注冠....

方案

涉及人体组织的实验方案已获得卡雷吉大学医院伦理委员会批准（2006/0024713；2009年5月更新）。每位患者均签署了书面知情同意书。

1. 溶液与设备准备

溶液配方见表1。细胞分离流程的简化流程图见图1。

溶液		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
试剂 (mM)	KH2PO4	50
	MgSO4	8	1.2	5	....

结果

采用上述方法对接受肌切除术的肥厚型心肌病（HCM）患者室间隔分离的心肌细胞功能异常进行表征，并与非心力衰竭、非肥厚性外科手术患者进行比较²¹。本节所包含的结果来源于该研究²¹，并作为示例展示该技术如何用于表征心脏疾病状态下心肌细胞功能的改变。

一名肥厚型心肌病（HCM）患者的代表性手术样本如图2A所示。手术样本在心内膜纤维条索的大小和厚度方面表现出极大的变异性。每次从HCM样本中分离细胞所用的心肌组织量约为1 g。而对照样本所用组织量较小（100–500 mg），原因是组织来源有限。处理对照样本时的细胞产量显著高于HCM样本，这可能是因为HCM心肌组织中存活心肌细胞的相对比例减少，且心内膜心肌纤维化程度增加²²。基于这些观察结果，我们得出结论：获取可存活心肌细胞所需的组织量可能因心肌疾病的存在与否而有所不同。

将样品切割成小块，如图2B所示。随后，将这些组织块转移至消化装置的腔室中（

讨论

我们描述并验证了一种从人类心室心肌手术样本中分离出有活力心肌细胞的方法。该技术在先前已成功用于从心房手术样本中分离细胞的方案基础上发展而来，并针对从病变心室心肌中分离单个有活力心肌细胞进行了优化和精细调整。早期研究表明，通过从心房和心室组织块中分离单个心肌细胞的方法会特异性损害复极化钾电流，导致电生理特性及对生理刺激的反应发生改变^8,24，而通过冠状动脉灌注输送含酶缓冲液则不会损害分离细胞中的延迟整流钾电流²⁵。然而，由于手术标本中冠状动脉分支的完整性已丧失，与移植心脏不同，无法通过冠状动脉灌注法从心室心肌手术标本中分离人类心室心肌细胞。采用本方法分离的心肌细胞在起搏频率变化或β-肾上腺素能刺激下，动作电位时程表现出明显的适应性调节。此类反应的发生依赖于延迟整流钾通道的完整性^26-28，提示本分离方法未对这些通道的整体功能造成损害。此外，采用本方法分离的细胞不仅表现出正常的电生理反应（图3和 4），还呈现出形态和持续时间符合预期的钙瞬变（图3和5.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）47H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
腺苷	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625
氢氧化钾（KOH）	Sigma-Aldrich	P5958
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9333
磷酸氢二钠（Na2人类表型本体4)	Sigma-Aldrich	S7907
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	S6297
碳酸氢钾（KHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	237205
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	B0753
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S8045
L-谷氨酸单钾盐一水合物	Sigma-Aldrich	49601
丙酮酸	Sigma-Aldrich	107360
3-羟基丁酸	Sigma-Aldrich	166898
腺苷5′三磷酸二钾盐二水合物（K2-ATP	Sigma-Aldrich	A8937
肌酸	Sigma-Aldrich	C0780
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S3674
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	E0396
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A0281
氯化镁（MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
梭菌胶原酶 V 型	Sigma-Aldrich	C9263
蛋白酶，细菌型，XXIV型	Sigma-Aldrich	P8038
氯化钙溶液，约 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
0.1 M 氯化钙溶液	Sigma-Aldrich	53704
甲基磺酸钾	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte 试剂	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload 浓缩液，100X	Life Technologies	P10020
灌流快速步骤系统	Warner Instruments	VC-77SP
两性霉素B溶解液	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B 膜片钳放大器	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
消化装置	定制	定制	该设备由本实验室使用塑料管、浇铸的Sylgard和电机定制而成；其详细描述见图1C-1D和图7。如有需要，可提供进一步细节。
用于消化装置刷子的硅橡胶弹性体	道康宁	SYLGARD® 184
用于消化装置的变速旋转电机	Crouzet	Crouzet 178-4765
刷子浇铸模具	N.A.	N.A.	模具由标准的聚四氟乙烯（PTFE）2.5 cm直径圆棒定制加工而成。