心脏疾病的细胞基础上的现有知识大多依赖于对动物模型的研究。在这里,我们描述和验证了一种新的方法从人心肌小型手术样品得到单一可行的心肌细胞。人心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。
从患病心脏的心肌细胞受到涉及改变细胞结构,激发收缩偶联和膜离子流复杂重塑过程。这些变化很可能是负责增加心律失常的风险和收缩变化导致的收缩和舒张功能不全的心脏病患者。然而,在心脏疾病心肌细胞功能的改变大部分信息都来自动物模型。
在这里,我们描述和验证协议从心室肌从接受心脏外科手术的病人手术小样本分离出可行的心肌细胞。的协议进行详细说明。电生理学和细胞内钙的测量报告来演示了一些在用这种方法获得的人左心室心肌细胞的单细胞测量的可行性。
该协议的报道,他再可用于功能性改变人的心脏在不同心脏疾病的存在的细胞和分子基础的未来的调查非常有用。另外,该方法可用于鉴定在细胞水平上新的治疗靶点,并测试新化合物的效力对人心肌细胞,用直接平移值。
的心肌的电生理特性解剖技术的发展为单个心肌细胞分离后已取得进展显着。在心肌兴奋收缩偶联(EC-耦合)的认识的最新发展,也已成为可能,可行的隔离单个心肌细胞可在保留完整的组织的所有生理特性的能力。膜片钳方法被常规使用,研究心肌细胞膜离子电流的功能和药理学调制。细胞内钙动力学与钙离子敏感染料的录音也定期进行单心肌细胞从不同的健康和疾病模型,提供对EC-耦合的生理以及对病理改变细胞内Ca 2 +的重要数据动态平衡,导致机械损伤和心脏疾病的增加心律失常的负担。信息tion从这些研究对于了解药物在临床上的电和机械作用的关键。但是,也有物种的跨膜电流和在该占心脏动作电位和心脏力学的具体特征对EC-偶联蛋白特异性差异。因此,当细胞从非人类哺乳动物中分离的研究已阐明的生物物理属性和特定的跨膜离子通道和EC-偶联蛋白的生理功能,它们不一定提供人类心肌细胞的相关模型。因此,从人类心肌存活心肌细胞的隔离是必要的,充分了解心脏疾病的病理生理学和验证新的治疗方法。
人类心房组织是现成的作为心耳在手术过程中通常被丢弃。成人人心肌动作电位和离子立方米初步定量研究rrents采用酶解分离心房细胞1-4。动作电位或从孤立的成人心室肌细胞电流记录已随后报告3,5-10。大部分这些研究使用了从外植心脏获得和利用胶原酶或冠状动脉段或数量较大的切除的组织暴露于胶原酶,得到分离的细胞的灌注细胞。这些研究使一些来自健康人的心脏心室肌细胞,并从患者的终端心脏衰竭跨膜离子电流的详细特征。 L型的录音的Ca 2 +电流(I CA-L)5-7,瞬时外向钾电流(I 至 )8,内向整流钾电流(Iκ1)8,延迟整流钾电流的不同组成部分(我κ )9已有报道。进步和精炼分离过程10,允许在终端心脏衰竭,包括动作电位延长11增加的潜在致心律失常的离子基础的明确表征,去极化12后延迟并增加有趣电流13到舒张期去极化和早搏。
成年心肌细胞通常是从小型动物的整个心脏与各种酶的混合物,一种能够产生的Ca 2 +的容错电池14的高产量技术的逆行灌注隔离。从组织碎片心肌细胞的分离是可能是因为酶的有限访问单个肌细胞与由冠状动脉灌注取得了比较本来就不太成功。由于未使用捐助者的心非常有限的,唯一可行的方法,以获得正常的人心肌细胞定期是通过酶digestio不适用不择期外科手术的切除往往非常小的组织碎片。已经彻底的特点在细胞水平上的唯一人类疾病模型是终端心脏衰竭,因无障碍移植后的心脏。然而,终端心脏衰竭发生在少数患者并且经常涉及心肌细胞的严重重塑,这是相对独立的根本原因15的共同通路。以评估患者的单个心肌细胞的功能在疾病的早期非故障段的能力是至关重要的理解不同遗传或后天条件的特定病理生理学。肥厚型心肌病(HCM)是一个生动的例子。 HCM是一种常见的(1/500的个体)的特征在于心脏肥大可继承的心脏状况,由于流出道梗阻和舒张功能障碍16增加心律失常风险和收缩变化。从HCM心心肌ündergo参与细胞结构的变化(肥大,肌原纤维混乱)和EC-17耦合复杂的重塑过程。然而,在胡志明市心肌功能障碍多数信息都来自转基因动物模型。由于HCM患者,只有少数演变对终端心脏衰竭,需要心脏移植,HCM的心中都很少适用于细胞的分离与标准方法。然而,HCM患者中至少有30%的收缩(HCM)18发展过程中由于大量室间隔肥厚改变流出道血流梗阻症状。最有效的可用的治疗选择梗阻的HCM的救济是手术室间隔心肌切除术:这种手术过程中,上部隔一个大小可变的部分是由反式主动脉瓣的方法去除。肥大隔膜的这一部分,因此可用于从新鲜组织细胞的分离。
一种用于人类ventricula的分离方法r是单一的,小静脉心内膜心肌活检标本细胞先前已经制定和公布19。我们实现了一个方法,从接受心脏手术,包括HCM患者接受室间隔心肌切除术和心脏瓣膜置换手术的患者患者分离单个心肌细胞室间隔从心室心肌标本。除了 隔离协议,有代表性的电生理学和Ca 2 +的荧光的详细描述测量呈现,显示了分离的人心肌细胞的生存能力和膜片钳和细胞内Ca 2 +的研究的可行性。
对人体组织的实验方案已获大学Careggi酒店,医院(2006/0024713; 2009年续签5月)的伦理委员会。每个患者的书面知情同意书。
1,解决方案和设备的准备
解决方案是在表1中说明。细胞分离方法的简化流程图,在图1中找到。
解 | CP | DB | KB | 结核病 | PS | EB1 | EB2 | |
试剂(MM) | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
硫酸镁 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
腺苷 | 5 | |||||||
葡萄糖 | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
甘露醇 | 100 | |||||||
牛磺酸 | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
氯化钠 | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
氯化钾 | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
氯化镁 | </ TD> | 1.2 | 5 | |||||
KH 2 PO 4 | 0.6 | 30 | 0.6 | 0.6 | ||||
的Na 2 HPO 4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
碳酸氢钠 | 12 | 12 | 12 | |||||
KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
丙酮酸钠 | 4 | 4 | 4 | |||||
BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
BHBA | 5 </ TD> | |||||||
琥珀酸 | 5 | |||||||
EGTA | 0.5 | |||||||
K 2 +-ATP | 2 | |||||||
丙酮酸 | 5 | |||||||
肌酸 | 5 | |||||||
KMES | 115 | |||||||
酶(U / ml的) | 胶原酶V型 | 250 </ TD> | 250 | |||||
蛋白酶XXIV型 | 4 | |||||||
pH值 | 7.4 KOH | 7.3氢氧化钠 | 7.1 KOH | 7.35氢氧化钠 | 7.2 KOH | 7.3氢氧化钠 | 7.3氢氧化钠 |
。表1用于标本采集,细胞分离和细胞的功能特性 CP =心脏停搏液解决方案 ; DB =分离缓冲液; KB =卡夫-Bruhe的解决方案; TB =台氏缓冲液; PS =吸管的解决方案; EB1 =酶缓冲液1; EB2 =酶缓冲液2。
2,收集心肌标本和处理
3,洗涤和大块心肌消化
4,细胞再悬浮和Ca 2 +的再改造
隔离型心肌5。功能评价。
下面的协议是人类心肌功能评估,包括动作电位和细胞内Ca 2 +通量的同时记录的一个例子。
我们已经描述和验证的方法从人心肌的手术标本分离出可行的心肌细胞。从前面描述的协议已被成功地用于分离的细胞从心房手术样品,该技术允许从患病心室肌单个活细胞分离的开发和微调开始。早期的报道表明,从心房和心室组织块选择性受损复极钾电流,导致改变的电生理特性和响应于生理刺激8,24,单个心肌细胞的分离,而输送通过冠状动脉灌注含有缓冲液的酶没有损害延迟整流电流的分离细胞25。不幸的是,从心肌的手术标本人类心室肌细胞的分离不能由冠状动脉灌注以来冠状动脉分支的完整性进行丢失,有违植心。心肌利用我们的方法心肌块孤立的显示清晰的适应动作电位时程响应起搏频率的变化或β肾上腺素刺激。为了使这种反应发生,延迟整流钾离子通道的完整性是必需的26-28,这表明这些通道的整体完整性由我们的隔离方法也不会受到损害。此外,细胞分离与我们的方法不仅表明常规 电生理反应( 图3和图4),但也显示出期望的形状和持续时间的钙瞬变( 图3和图5),并定期肌组织( 图2)和缩短的属性(未示出),这表明这些细胞的整体结构完整性是通过这个分离步骤保存。这种方法优于先前的主要进展技术是通过新设计的消解器,它提供了组织块的温和的机械搅拌,使没有过度损伤的单细胞分离设置。此外,使用该消化装置允许我们采用在细胞分离缓冲液的酶的浓度较低;特别是我们在以往报告的方法24使用比较非选择性蛋白酶的浓度低得多。该设备在我们的实验室定制:建筑原理图如图8呈现。
简单的设计和结构使得它很容易复制这个协议的一个成功的结果。 图8的传说还介绍了需要生产硅胶刷子和建设刮室的程序。由于消化设备的优点,可以从相对低的心室组织(低至100毫克)的量而获得相对高的活菌数。先前公布的19方法被证明是从小活检(甚至<20毫克)提供耐钙心肌细胞。不过,报道心肌细胞产率非常低,作者并没有显示出细胞中分离出与该方法是否可行的细胞内钙循环和收缩功能特性。这种技术有可能应用于许多外科病人,由于室间隔的一小部分在瓣膜置换程序( 例如 ,主动脉瓣置换术),经常切除。然而,最关键的一点,以获得成功分离是程序从手术室样品采集后,迅速启动。因此,它是必需的细胞实验室是在靠近心脏外科诊所,为了让这项技术是富有成效的。此外,适当的酶的活性也是极为重要的一个成功隔离。由于非选择性蛋白酶活性Øf,各批次胶原酶通常是不完全测试,每批有可能在细胞分离性能差异。因此,必须进行微调的胶原酶的最终浓度,以达到最佳的效果。我们建议观察细胞悬浮液的显微镜在每一循环下,为了确保活细胞开始出现在周期3的早期外观的细胞表明过高的酶的活性,并提示了为减少酶的浓度;外观周期3后细胞表明酶活力不足。在我们的经验,这是正确的酶浓度的最有效的指标。
我们已经成功地使用这种方法来从HCM患者左室流出道梗阻接受手术室间隔肌切除术,以及来自非失败不可肥大手术患者21的跨室间隔获得的单个心肌细胞。结果从该纸表明,肌细胞分离用这种方法可以为完整的电生理评估可以采用与膜片钳技术,同时评估欧盟耦合异常,通过记录与荧光染料细胞内钙离子动态。这里描述的记录过程使我们能够收集几个生理参数的细胞与来自各小区的单个记录,从而产生大量的数据,与细胞和样品的数量有限。由于这些优点,该方法已成功地用于表征从HCM患者心室心肌细胞的特定功能异常,如与非增生性患者21进行比较。离子电流和动作电位时程,以及动力学异常的异常OD细胞内Ca 2 +的循环被明确使用这种技术,具有很高的重复性。此外,我们已经表明,治疗晚期钠离子的选择性抑制剂</s高达>目前雷诺嗪显著改善HCM心肌的电气和机械功能,提示重要的治疗意义。该结果强调了使用从患者的心脏疾病,对药物测试的人心肌细胞,使结果的直接转换到临床上的可能性。事实上,从前述的工作结果导致了双盲临床试验与雷诺嗪与发展。安慰剂组患者的病29,这是目前正在进行中。
人体心脏标本的可用性也比较适中,即使是在专门的中心,而这可能会限制这种技术的广泛适用性。尽管如此,可以从对心肌功能的疾病相关的变化患者样本可以直接获得的信息质量相媲美,实现HCM和其他心脏疾病的动物模型。鉴于之间的广泛差异人类和小鼠心肌细胞的生理机能,从人类心肌细胞功能评估的数据可以是非常有价值的。作为结论,我们认为,这项技术的未来应用能显著促进心脏疾病的知识,因为我们的协议提供了可能性,从患者样本直接对细胞进行了一套完整的功能评估,并立即平移值。
The authors have nothing to disclose.
Potassium phosphate monobasic (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&region=IT">P9791 </a> | |
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&region=IT">M1880 </a> | |
HEPES | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&region=IT">H3375 </a> | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&region=IT">A9251 </a> | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&region=IT">G8270 </a> | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&region=IT">M4125 </a> | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&region=IT">S7653</a> | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&region=IT">P9333 </a> | |
Sodium phosphate dibasic (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&region=IT">S7907 </a> | |
Sodium bicarbonate (NaHCO<sub>3</sub>) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&region=IT">S6297 </a> | |
Potassium bicarbonate (KHCO<sub>3</sub>) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&region=IT">237205</a> | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&region=IT">P2256 </a> | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&region=IT">B0753 </a> | |
Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&region=IT">S8045 </a> | |
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&region=IT">49601</a> | |
Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&region=IT">107360</a> | |
3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&region=IT">166898</a> | |
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K<sub>2</sub>-ATP) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&region=IT">A8937</a> | |
Creatine | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&region=IT">C0780 </a> | |
Succinic Acid | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&region=IT">S3674 </a> | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&region=IT">E0396 </a> | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&region=IT">A0281</a> | |
Magnesium chloride (MgCl<sub>2</sub>) | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&region=IT">M8266 </a> | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&region=IT">C9263 </a> | |
Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
Calcium chloride solution, ~1 M in H<sub>2</sub>O | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&region=IT">21115</a> | |
Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&region=IT">53704</a> | |
Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&region=IT">83000</a> | |
FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&region=IT">A9528 </a> | |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |