从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

摘要

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。

摘要

病变心脏的心肌细胞会经历复杂的重构过程，涉及细胞结构、兴奋-收缩耦联以及膜离子电流的变化。这些变化很可能 是导致心脏疾病患者心律失常风险增加以及收缩功能改变进而引起收缩期和舒张期功能障碍的原因。然而，目前关于心脏疾病中心肌细胞功能改变的大多数信息均来自动物模型。

本文描述并验证了一种从接受心脏手术的患者心室心肌小块外科样本中分离出有活性心肌细胞的方案。该方案进行了详细阐述。通过电生理学和细胞内钙离子浓度测定，证明了利用该方法获得的人心室心肌细胞进行多种单细胞检测的可行性。

本研究报道的方案可用于未来探讨不同心脏疾病存在时人类心脏功能改变的细胞和分子基础。此外，该方法可用于在细胞水平上识别新的治疗靶点，并测试新化合物对人心肌细胞的有效性，具有直接的转化价值。

引言

自单个心肌细胞分离技术发展以来，对心肌电生理特性的研究取得了显著进展。近年来，由于能够分离出保持完整组织全部生理特性的活性单个心肌细胞，人们对心脏兴奋-收缩耦联（EC-Coupling）的理解也得以深化。膜片钳技术被常规用于研究心肌细胞肌膜离子电流的功能及其药物调控作用。利用对Ca²⁺敏感的荧光染料记录细胞内钙动态变化，也常在多种健康与疾病模型的单个心肌细胞上进行，为兴奋-收缩耦联的生理机制以及导致机械功能障碍和心脏疾病中致心律失常风险增加的细胞内Ca²⁺稳态异常提供了关键数据。这些研究获得的信息对于理解药物在临床环境中的电生理和机械效应至关重要。然而，不同物种之间在跨膜电流和兴奋-收缩耦联蛋白方面存在特异性差异，这些差异决定了心脏动作电位和心脏力学特性的种属特征。因此，尽管对非人类哺乳动物来源的心肌细胞的研究阐明了特定跨膜离子通道和兴奋-收缩耦联蛋白的生物物理特性及其生理功能，但它们未必能准确反映人类心肌细胞的真实情况。因此，从人类心肌组织中分离出活性心肌细胞，对于全面理解心脏疾病的病理生理机制以及验证新的治疗策略至关重要。

在手术过程中，心耳组织通常会被丢弃，因此人类心房组织易于获取。早期对成人人类心脏动作电位和离子电流的定量研究采用了酶解法分离的心房细胞^1-4。随后也有报道对分离的成人人类心室细胞进行动作电位或电流记录^3,5-10。这些研究大多使用来自移植心脏的细胞，通过胶原酶灌注冠状动脉节段，或将相对大量的切除组织暴露于胶原酶中以获得分离细胞。这些研究实现了对健康心脏以及终末期心力衰竭患者心室心肌细胞跨膜离子电流的详细表征。已有研究报道了L型Ca²⁺电流（I_Ca-L）^5-7、瞬时外向钾电流（I_to）⁸、内向整流钾电流（I_κ1）⁸，以及延迟整流钾电流（I_κ）的不同组分⁹。随着细胞分离方法的改进与优化¹⁰，已能明确表征终末期心力衰竭中致心律失常电位增加的离子基础，包括动作电位延长¹¹、延迟后除极¹²以及“funny电流”增强¹³，从而导致舒张期除极和早搏的发生。

通常通过逆行灌流整个心脏并使用多种酶混合物的方法从小型动物中分离成年心肌细胞，该技术可获得大量耐受 Ca²⁺ 的细胞¹⁴。相比之下，从组织碎片中分离心肌细胞的成功率天然较低，这可能是由于酶对单个心肌细胞的接触受限，无法达到冠状动脉灌流时的效果。由于未使用供体心脏的资源极为有限，常规获取正常人左心室细胞的唯一可行方法是对择期手术中切除的、通常非常小的组织碎片进行酶消化。目前在细胞水平上研究最充分的人类疾病模型是终末期心力衰竭，原因在于可供移植的心脏相对容易获得。然而，仅少数患者会发展为终末期心力衰竭，且该阶段常表现为心肌细胞严重重塑的共同通路，与原发病因相对无关¹⁵。能够在疾病早期、尚未出现心功能失代偿阶段的患者中评估单个心肌细胞功能，对于理解不同遗传性或获得性疾病的特异性病理生理机制至关重要。肥厚型心肌病（HCM）即为一个典型例子。HCM 是一种常见（每 500 人中约有 1 例）的可遗传性心脏病，其特征为心脏肥厚、心律失常风险增加以及由于流出道梗阻和舒张功能障碍导致的收缩功能异常¹⁶。HCM 心脏的心肌细胞经历复杂的重塑过程，涉及细胞结构（肥大、肌原纤维排列紊乱）和兴奋-收缩耦联（EC-Coupling）的改变¹⁷。然而，目前关于 HCM 心肌细胞功能障碍的大多数信息均来自转基因动物模型。由于仅有少数 HCM 患者会进展至终末期心力衰竭并需要心脏移植，因此使用标准方法可获得的 HCM 心脏极为罕见。然而，至少 30% 的 HCM 患者会因室间隔显著肥厚导致收缩期流出道血流受阻而出现梗阻症状（HCM）¹⁸。目前缓解 HCM 梗阻最有效的治疗选择是外科室间隔切除术：在此手术过程中，通过经主动脉途径切除大小不一的上段室间隔组织。因此，这部分肥厚的室间隔组织可用于新鲜组织的心肌细胞分离。

既往已建立并发表了一种从单个小型经静脉心内膜活检标本中分离人类心室肌细胞的方法¹⁹。我们采用了一种从接受心脏手术患者的心室心肌样本中分离单个室间隔心肌细胞的方法，包括接受室间隔切除术的肥厚型心肌病（HCM）患者以及接受瓣膜置换术的患者。本文除详细描述细胞分离方案外，还展示了典型的电生理学和Ca²⁺荧光测量结果，以证明所分离的人类心室肌细胞具有活性，并且适用于膜片钳和细胞内Ca²⁺研究。

方案

涉及人体组织的实验方案已获得卡雷吉大学医院伦理委员会批准（2006/0024713；2009年5月更新）。每位患者均签署了书面知情同意书。

1. 溶液与设备准备

溶液配方见表1。细胞分离流程的简化流程图见图1。

溶液		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
试剂 (mM)	KH2PO4	50
	MgSO4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	adenosine	5
	glucose	140	10	20	10		10	10
	mannitol	100
	taurine	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl2				1.2	5
	KH2PO4		0.6	30			0.6	0.6
	Na2HPO4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO3		12				12	12
	KHCO3		10				10	10
	Na-pyruvate		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	succinic acid			5
	EGTA			0.5
	K2-ATP			2
	pyruvic acid			5
	creatine			5
	KMES					115
酶 (U/ml)	Collagenase Type V						250	250
	Protease Type XXIV						4
pH		7.4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

表1. 用于标本采集、细胞分离及心肌细胞功能表征的溶液。 CP= 心肌停搏液；DB= 解离缓冲液；KB= Kraft-Brühe溶液；TB= 台氏液；PS= 灌流液；EB1= 酶缓冲液1；EB2= 酶缓冲液2。

1. 准备停跳液（CP 溶液）。CP 溶液可在 4℃ 保存 °C，最长可保存1周。
2. 准备 Ca²⁺无钙解离缓冲液（DB）。该溶液应在当日内使用。
3. 配制 Kraft-Brühe (KB) 溶液。KB 溶液可在 4℃ 保存 °C，最长可保存1周。
4. 准备 Ca²⁺无钙台氏液（TB）。该溶液应在当天使用。
5. 使用注射器滤器在使用前过滤所有溶液。
6. 准备消化装置（图 2），一个由两个相对的硅酮弹性体刷子制成的刮取容器，其中一个刷子由电动马达驱动旋转。该消化装置为定制设备。有关消化装置的详细信息见于 图 8；该设备的图像位于 图2C 和 二维用70%乙醇和水清洗组织培养皿。

2. 心肌样本的采集与处理

1. 将40 ml停搏液（CP溶液）倒入50 ml离心管中，置于冰上，用于将标本从手术室运输至细胞分离实验室。
2. 从手术室获取切除的室壁心肌标本后立即收集，用冰冻的CP溶液冲洗，并储存于试管中。使用开放心脏手术期间从室间隔上部切除的内心膜标本，称重 >100 mg
3. 迅速将样本转移至实验区域，并在10分钟内开始样本处理 从标本切除开始。
4. 将标本置于冰冻的CP缓冲液中，于体视显微镜下用精细剪刀小心去除心内膜纤维化层；随后将心肌组织剪成小块（长约2-3 mm）。根据组织样本大小，每次分离选取100 mg至1 g之间的左心室心肌组织。
5. 组织切碎完成后，将心肌碎块转移至消化装置中，并加入洁净的冰冻CP溶液。心肌碎块的体积不应填满两个硅胶刷之间的整个空间（3–4 ml），总组织量不超过1 g。

3. 心肌组织块的洗涤与消化

1. 将组织块转移至消化装置的刮取室后，用冷的Ca²⁺无钙解离缓冲液（DB）
2. 将消化装置置于恒温水浴中，使腔室与水浴中的加热用水接触（图1）。将浴槽温度设定为 37.5 °C并打开，以缓慢升高组织浴槽的温度。开启消化装置的电机，将转速设定为1转/秒。
3. 用 DB 进行 3 次洗涤循环，每 8 分钟更换一次灌流 chamber 中的溶液为新鲜 DB。DB 已预热至 37 °C）并在接触心肌组织块之前用氧气饱和。
4. 通过向DB溶液中加入250 U/ml V型胶原酶和4 U/ml XXIV型蛋白酶制备酶缓冲液1（EB1）。通过向DB溶液中加入250 U/ml V型胶原酶制备酶缓冲液2（EB2）。将溶液预热至37 °C）并用氧气饱和 EB1 和 EB2。
5. 在旋转消化装置中，使用100%氧合的EB1溶液进行两次12分钟的消化循环（37 °C）。 °C). 每个循环使用约 3 ml EB1。每次循环后用移液器抽吸去除溶液并弃去。
6. 准备6个15 ml离心管用于细胞收集，并准备约80 ml冷（4 °C）的KB溶液 °C) 用于洗脱缓冲液的KB溶液。
7. 进行第一次15分钟 在37℃下用3 ml 100% 氧化的EB2进行消化循环 °C. 消化循环结束后，收集含有首次解离心肌细胞的溶液至15 ml离心管中，并用12 ml冷KB溶液稀释细胞悬液。将离心管平放于室温下保存。
8. 将剩余的EB2溶液与等体积的DB混合，以使后续消化循环中胶原酶V的浓度减半。
9. 执行另外5次，每次12分钟 在37℃下用3 ml EB2进行消化循环 °C；每次收集含心肌细胞的缓冲液至15 ml锥形管中，并加入12 ml KB溶液稀释。将6个含细胞的试管于室温下静置30分钟。

4. 细胞重悬与 Ca²⁺ 重新适应

1. 加入 1 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）至20 ml Ca²⁺无钙台氏液（TB）。过滤该溶液。
2. 将含有心肌细胞的六个锥形管在100 × g条件下离心5分钟，使心肌细胞沉淀。弃去上清液，于室温下用不同体积（1–3 ml，根据细胞得率确定）含牛血清白蛋白（BSA）的TB缓冲液重悬各管中的细胞。
3. 逐步增加 Ca²⁺ 通过添加少量 100 mmol/L 的溶液，调节细胞所含缓冲液中的浓度 CaCl₂ 溶液。在第一和第二步中，Ca²⁺ 浓度升高至50 μmol/L 和 100 μmol/L，分别。随后的 Ca²⁺ 每5分钟执行一次附加步骤 且浓度增加100 μmol/L 逐步稀释至终浓度为 0.9 mmol/L。
4. 评估分离过程的得率。取0.5 ml含心肌细胞的溶液转移至显微镜的玻璃底培养皿中。在10倍物镜放大下观察15个显微镜视野，计算健康心肌细胞所占百分比（例如 具有清晰横纹且无明显包涵物的杆状细胞 图 2预期得率约为 20%。

5. 分离心肌细胞的功能评估。

以下方案是人类心肌细胞功能评估的一个示例，包括动作电位和细胞内Ca²⁺流的同步记录。

1. 为穿孔膜片钳配置的膜片钳实验配制电极内液（PS）。该溶液可在 -20 °C 下保存长达 3 个月。
2. 向无 Ca²⁺ 的 Tyrode 缓冲液（TB）中加入 1.8 mmol/L CaCl₂。在膜片钳/荧光实验期间，用此溶液灌流心肌细胞。
3. 将 1 ml 细胞悬液转移至 1.5 ml 离心管中，加入 10 μmol/L Fluoforte 和 10 μl Powerload Concentrate。室温孵育 30 分钟。随后将离心管垂直放置，静置 5 分钟使细胞沉降；再用含 Ca²⁺  的 TB 重悬细胞。
4. 将 0.25 ml 细胞悬液转移至小型（0.5 ml）温度可控的显微镜载物台记录浴槽中，通过重力驱动的加热微灌流系统以 0.3 ml/min 的流速进行灌流（温度：37 ± 0.5 °C）。
5. 使用微电极拉制仪制备膜片钳电极，使其尖端直径为 3 至 5 μm，充满 PS 后电阻为 3 至 4.5 MΩ。
6. 将两性霉素 B 加入一批 PS 中（终浓度 250 μg/ml），并用此溶液填充电极。 
7. 选择杆状、横纹清晰且无颗粒物的细胞，形成吉欧封接（giga seal），等待 5 至 10 分钟，直至接入电阻降至 20 MΩ 以下。
8. 在电流钳模式下，使用短脉冲（< 3 msec）以不同刺激频率（0.2 Hz、0.5 Hz 和 1 Hz，每种频率持续 1 min ）诱发动作电位。记录过程中，开启波长为 492 ± 3 nm 的明场照明，并在 505–520 nm 范围内检测 Fluoforte 荧光信号。使用 Digidata 1440A 和 pClamp 10.0 软件采集荧光和膜电位信号。可根据需要重复记录序列；但每个细胞的总记录时间应控制在 15 min 以内。

结果

采用上述方法对接受肌切除术的肥厚型心肌病（HCM）患者室间隔分离的心肌细胞功能异常进行表征，并与非心力衰竭、非肥厚性外科手术患者进行比较²¹。本节所包含的结果来源于该研究²¹，并作为示例展示该技术如何用于表征心脏疾病状态下心肌细胞功能的改变。

一名肥厚型心肌病（HCM）患者的代表性手术样本如图2A所示。手术样本在心内膜纤维条索的大小和厚度方面表现出极大的变异性。每次从HCM样本中分离细胞所用的心肌组织量约为1 g。而对照样本所用组织量较小（100–500 mg），原因是组织来源有限。处理对照样本时的细胞产量显著高于HCM样本，这可能是因为HCM心肌组织中存活心肌细胞的相对比例减少，且心内膜心肌纤维化程度增加²²。基于这些观察结果，我们得出结论：获取可存活心肌细胞所需的组织量可能因心肌疾病的存在与否而有所不同。

将样品切割成小块，如图2B所示。随后，将这些组织块转移至消化装置的腔室中（

讨论

我们描述并验证了一种从人类心室心肌手术样本中分离出有活力心肌细胞的方法。该技术在先前已成功用于从心房手术样本中分离细胞的方案基础上发展而来，并针对从病变心室心肌中分离单个有活力心肌细胞进行了优化和精细调整。早期研究表明，通过从心房和心室组织块中分离单个心肌细胞的方法会特异性损害复极化钾电流，导致电生理特性及对生理刺激的反应发生改变^8,24，而通过冠状动脉灌注输送含酶缓冲液则不会损害分离细胞中的延迟整流钾电流²⁵。然而，由于手术标本中冠状动脉分支的完整性已丧失，与移植心脏不同，无法通过冠状动脉灌注法从心室心肌手术标本中分离人类心室心肌细胞。采用本方法分离的心肌细胞在起搏频率变化或β-肾上腺素能刺激下，动作电位时程表现出明显的适应性调节。此类反应的发生依赖于延迟整流钾通道的完整性^26-28，提示本分离方法未对这些通道的整体功能造成损害。此外，采用本方法分离的细胞不仅表现出正常的电生理反应（图3和 4），还呈现出形态和持续时间符合预期的钙瞬变（图3和5...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）47H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
腺苷	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625
氢氧化钾（KOH）	Sigma-Aldrich	P5958
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9333
磷酸氢二钠（Na2人类表型本体4)	Sigma-Aldrich	S7907
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	S6297
碳酸氢钾（KHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	237205
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	B0753
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S8045
L-谷氨酸单钾盐一水合物	Sigma-Aldrich	49601
丙酮酸	Sigma-Aldrich	107360
3-羟基丁酸	Sigma-Aldrich	166898
腺苷5′三磷酸二钾盐二水合物（K2-ATP	Sigma-Aldrich	A8937
肌酸	Sigma-Aldrich	C0780
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S3674
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	E0396
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A0281
氯化镁（MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
梭菌胶原酶 V 型	Sigma-Aldrich	C9263
蛋白酶，细菌型，XXIV型	Sigma-Aldrich	P8038
氯化钙溶液，约 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
0.1 M 氯化钙溶液	Sigma-Aldrich	53704
甲基磺酸钾	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte 试剂	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload 浓缩液，100X	Life Technologies	P10020
灌流快速步骤系统	Warner Instruments	VC-77SP
两性霉素B溶解液	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B 膜片钳放大器	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
消化装置	定制	定制	该设备由本实验室使用塑料管、浇铸的Sylgard和电机定制而成；其详细描述见图1C-1D和图7。如有需要，可提供进一步细节。
用于消化装置刷子的硅橡胶弹性体	道康宁	SYLGARD® 184
用于消化装置的变速旋转电机	Crouzet	Crouzet 178-4765
刷子浇铸模具	N.A.	N.A.	模具由标准的聚四氟乙烯（PTFE）2.5 cm直径圆棒定制加工而成。