隔离与人类心室肌细胞的功能研究从新鲜手术样品

Summary

心脏疾病的细胞基础上的现有知识大多依赖于对动物模型的研究。在这里，我们描述和验证了一种新的方法从人心肌小型手术样品得到单一可行的心肌细胞。人心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。

Abstract

从患病心脏的心肌细胞受到涉及改变细胞结构，激发收缩偶联和膜离子流复杂重塑过程。这些变化很可能是负责增加心律失常的风险和收缩变化导致的收缩和舒张功能不全的心脏病患者。然而，在心脏疾病心肌细胞功能的改变大部分信息都来自动物模型。

在这里，我们描述和验证协议从心室肌从接受心脏外科手术的病人手术小样本分离出可行的心肌细胞。的协议进行详​​细说明。电生理学和细胞内钙的测量报告来演示了一些在用这种方法获得的人左心室心肌细胞的单细胞测量的可​​行性。

该协议的报道，他再可用于功能性改变人的心脏在不同心脏疾病的存在的细胞和分子基础的未来的调查非常有用。另外，该方法可用于鉴定在细胞水平上新的治疗靶点，并测试新化合物的效力对人心肌细胞，用直接平移值。

Introduction

的心肌的电生理特性解剖技术的发展为单个心肌细胞分离后已取得进展显着。在心肌兴奋收缩偶联（EC-耦合）的认识的最新发展，也已成为可能，可行的隔离单个心肌细胞可在保留完整的组织的所有生理特性的能力。膜片钳方法被常规使用，研究心肌细胞膜离子电流的功能和药理学调制。细胞内钙动力学与^钙离子敏感染料的录音也定期进行单心肌细胞从不同的健康和疾病模型，提供对EC-耦合的生理以及对病理改变细胞内Ca ^{2 +}的重要数据动态平衡，导致机械损伤和心脏疾病的增加心律失常的负担。信息tion从这些研究对于了解药物在临床上的电和机械作用的关键。但是，也有物种的跨膜电流和在该占心脏动作电位和心脏力学的具体特征对EC-偶联蛋白特异性差异。因此，当细胞从非人类哺乳动物中分离的研究已阐明的生物物理属性和特定的跨膜离子通道和EC-偶联蛋白的生理功能，它们不一定提供人类心肌细胞的相关模型。因此，从人类心肌存活心肌细胞的隔离是必要的，充分了解心脏疾病的病理生理学和验证新的治疗方法。

人类心房组织是现成的作为心耳在手术过程中通常被丢弃。成人人心肌动作电位和离子立方米初步定量研究rrents采用酶解分离心房细胞^1-4。动作电位或从孤立的成人心室肌细胞电流记录已随后报告^3,5-10。大部分这些研究使用了从外植心脏获得和利用胶原酶或冠状动脉段或数量较大的切除的组织暴露于胶原酶，得到分离的细胞的灌注细胞。这些研究使一些来自健康人的心脏心室肌细....

Protocol

对人体组织的实验方案已获大学Careggi酒店，医院（2006/0024713; 2009年续签5月）的伦理委员会。每个患者的书面知情同意书。

1，解决方案和设备的准备

解决方案是在表1中说明。细胞分离方法的简化流程图，在图1中找到。

解		CP	DB	KB	结核病	PS	EB1	EB2
试剂（MM）	KH 2 PO 4	50
	硫酸镁	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES

<....

Results

上面描述的方法进行表征的心肌细胞从患者的肥厚型心肌病（HCM）谁接受切除术手术室间隔分离的功能异常，如与非故障非增生性手术的患者²¹进行比较。在包含在本节中的结果是来自于该工件^21，在这里被示为如何使用此技术可用于表征在心脏疾病状况的心肌细胞功能的改变的例子。

从与HCM患者的代表性手术样品如图2A所示。手术样本的大小和心内膜纤维条纹的厚度方面都非常的变量。在我们使用的每个分离过程中从样品的HCM心肌组织的量为1g左右。相反，组织的用于控制样本量较小（100-500毫克）中，由于劳ř组织的可用性。产率为显著更高时对照样品处理相对于HCM，可能是因为在组织中存活的心肌细胞的相对量减少HCM中的心肌和心内膜心肌纤维化增加^22。从这些观察，我们得出结论，根据心肌病的存在或不存在所需要的组织的量，获得的活细胞可以是可变的。

样品被切成小方块， 如图2B所示 。此后，块转移到消化设备（ 图.......

Discussion

我们已经描述和验证的方法从人心肌的手术标本分离出可行的心肌细胞。从前面描述的协议已被成功地用于分离的细胞从心房手术样品，该技术允许从患病心室肌单个活细胞分离的开发和微调开始。早期的报道表明，从心房和心室组织块选择性受损复极钾电流，导致改变的电生理特性和响应于生理刺激^8,24，单个心肌细胞的分离，而输送通过冠状动脉灌注含有缓冲液的酶没有损害延迟整流电流的分离细胞^25。不幸的是，从心肌的手术标本人类心室肌细胞的分离不能由冠状动脉灌注以来冠状动脉分支的完整性进行丢失，有违植心。心肌利用我们的方法心肌块孤立的显示清晰的适应动作电位时程响应起搏频率的变化或β肾上腺素刺激。为了使这种反应发生，延迟整流钾离子通道的完整性是必需的^26-28，这表明这些通道的整体完整性由我们的隔离方法也不会受到损害。此外，细胞分离与我们的方法不仅表明常规 ​​电生理反应（ 图3和图4），但也显示出期望的形状和持续时间的钙瞬变（ 图3和图5），并定期肌组织（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸二氢钾 （KH2PO4）	Sigma-Aldrich	P9791
七水硫酸镁（MgSO4*7H2O）	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
腺苷	Sigma-Aldrich	A9251
D-（+）-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625
氢氧化钾 （KOH）	Sigma-Aldrich	P5958
氯化钠 （NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653
氯化钾 （KCl）	Sigma-Aldrich	P9333
磷酸氢二钠 （Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	S7907
碳酸氢钠 （NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6297
碳酸氢钾 （KHCO3）	Sigma-Aldrich	237205
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-丁二酮一肟	Sigma-Aldrich	B0753
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S8045
L-谷氨酸 单钾盐 一水合	Sigma-Aldrich	49601
丙酸	Sigma-Aldrich	107360
3-羟基丁酸	Sigma-Aldrich	166898
腺苷 5′-三磷酸二钾盐二水合物 （K2-ATP）	Sigma-Aldrich	A8937
肌酸	Sigma-Aldrich	C0780
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S3674
乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	E0396
来自牛血清的白蛋白	Sigma-Aldrich	A0281
氯化镁 （MgCl2）	Sigma-Aldrich	M8266
V型溶组织梭菌的胶原酶	Sigma-Aldrich	C9263
蛋白酶，细菌，XXIV 型	Sigma-Aldrich	P8038
氯化钙溶液，~1 M 在 H2O	中 Sigma-Aldrich	21115
氯化钙 0.1 M 溶液	Sigma-Aldrich	53704
甲磺酸钾	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte 试剂	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload 浓缩液，100X	Life Technologies	P10020
灌注快速步进系统	Warner Instruments	VC-77SP
两性霉素 B 溶解的	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B膜片钳放大器	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
消化装置	定制	定制	该设备是在我们的实验室使用塑料管、铸造的 Sylgard 和电机定制的;图 1C-1D 和图 7 中有详细描述。如有需要，我们可以提供更多详细信息。
用于消化装置刷子的有机硅弹性体	Dow Corning	SYLGARD® 184
用于消化装置的变速旋转电机	Crouzet	Crouzet 178-4765
用于刷子铸造的模具	N.A.	不适用	该模具由直径为 2.5 厘米的标准 PTFE 棒定制而成。