斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

摘要

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。

摘要

光片显微镜是研究斑马鱼胚胎发育的理想成像技术。由于其光毒性极低且光漂白效应微弱，特别适用于持续数小时至数天的长期延时成像。然而，需要一种合适的样品固定策略，既能实现样品的稳定固定，又能保证其正常发育。多层固定法是一种新型包埋技术，采用低浓度琼脂糖置于光学透明的管中，现已克服了这一限制，充分释放了光片显微镜在实时发育生物学研究中的潜力。

引言

为了理解胚胎发生过程中的复杂事件与相互作用，发育生物学的研究正日益从单个细胞和器官的显微观察转向 体内 对整个生物体进行成像。传统的显微镜技术通常无法提供足够的空间和时间分辨率以长期追踪快速发生的事件，且常常导致样品发生漂白或光毒性效应¹我们及其他研究者发现，光片显微镜技术（图1理想的实验技术 体内 斑马鱼成像^2-4使用与检测轴正交的薄层激光光照射样品，可实现快速光学切片和高空间分辨率，同时最大限度降低光毒性。⁵与此同时，由于这种独特的光学结构，使用培养皿或培养腔室的传统样品装载技术并不适用。在典型的光片显微镜中，样品由三个平移电机和一个旋转电机固定，从而能够实现精确的位置调节、旋转，并从任意方向进行观察。过去，光片显微镜的样品通常被包埋在玻璃毛细管内的1-2%琼脂糖中。^6,7在此情况下，含有嵌入样本的凝固琼脂糖圆柱体会从玻璃毛细管中被推出，进入充满类水介质的样品室以进行成像。琼脂糖的折射率与水相近，因此非常适用于 体内 光片显微镜，可实现水介质校正的照明和检测光学。样品被固定在刚性琼脂糖中，可在短时间内获得良好的成像效果，但在持续数小时的成像过程中，胚胎的形态发生变化和生长会受到显著抑制。^7,8. 尽管已开发出用于其他应用的解决方案⁹传统的1.5%琼脂糖包埋方法无法利用光片显微镜实现斑马鱼的无创长期延时成像潜力。

因此，我们开发了一种新的封片策略 体内 斑马鱼胚胎的光片显微成像¹⁰样品被固定在含有0.1%琼脂糖和200 mg/L Tricaine的氟化乙烯丙烯（Fluorinated Ethylene Propylene, FEP）透明聚合物管中。由于该介质黏度较低，包埋的胚胎能够正常发育。同时，FEP管在整个实验过程中有效限制了介质和样品的移动。本文提供了这种新型固定技术的详细操作方案，并展示了其相较于传统方法的优势数据。我们证明，利用该方法可对斑马鱼发育过程进行连续成像，时间超过两天，且具有高空间和时间分辨率。

图1. 光片显微镜的原理。 固定在氟化乙烯丙烯（FEP）管中的斑马鱼可穿过检测物镜的焦平面进行平移和旋转。照明物镜将一束薄层激光（光片）投射到检测物镜的焦平面内，仅照亮样品的一个薄层光学切片。发射的荧光信号由检测物镜收集，并记录在相机芯片上。

方案

1. 材料准备

1. FEP 管的制备
   1. 清洁FEP管（图2A）通过将液体（如下述步骤中所述）冲洗过管路，并使用连接有钝端套管的注射器图2B). 注1： 整个操作过程中请佩戴手套。 注释2： 我们建议将试管切成若干小段 ca1 米长，并行清洁。
      1. 首先用1 M NaOH反复冲洗该管。然后将该管转移至装有0.5 M NaOH的50 ml离心管中，超声处理10分钟。
      2. 将聚合物管转移至含有ddH₂O的小型容器中₂O. 先用 ddH₂O 冲洗管子₂O，然后用70% EtOH处理。
      3. 随后将FEP管转移至含有70% EtOH的新离心管中，再次对该离心管进行超声处理10分钟。
   2. 将清洗后的FEP管剪成约3 cm长的片段（适用于斑马鱼固定和成像的典型长度），必要时将其拉直。将清洗后的FEP管保存在装有ddH₂O的洁净50 ml离心管中。₂O (图2C).
2. 三卡因储备液的制备
   1. 配制0.4% Tricaine储存液：将400 mg Tricaine（MS-222）溶于97.9 ml ddH₂O中₂O. 待粉末完全溶解后，加入2.1 ml 1M Tris（pH 9.0）调节pH至7.0。避光保存溶液。分装后于-20 °C.
3. 3% 甲基纤维素的制备
   1. 制备3%甲基纤维素溶液用于FEP管内层涂覆，具体步骤如下。将E3加热¹¹ 在玻璃瓶中至大约60-70 °C 并加入适量甲基纤维素粉末。放入搅拌子，在搅拌条件下于 4 °C溶液冷却至以下时立即 30 °C，加入Tricaine溶液至终浓度为100 mg/L。持续搅拌于 4 °C 过夜。
4. 1.5% 和 0.1% 琼脂糖E3溶液的配制
   1. 将适量低熔点琼脂糖粉末溶于一定体积的E3溶液中，置于玻璃烧瓶内。使用微波炉加热混合物，并不时摇动，直至琼脂糖溶液呈现均匀状态，无任何未溶解的晶体残留。
   2. 在1.5 ml离心管中分装1 ml 0.1%琼脂糖溶液。分装后的溶液可保存于 4 °C.
   3. 使用1.5%的溶液涂布塑料培养皿。琼脂糖层的厚度应为 ca2 毫米。琼脂糖凝固后，加入 E3 培养基覆盖表面，以防止干燥。包被后的培养皿可存放于 4 °C.
5. 斑马鱼的制备
   1. 保持斑马鱼（Danio rerio成虫和胚胎 28.5 °C 并根据既定的规程进行处理^11,12.
   2. 下午将雄性和雌性鱼放入繁殖缸并用隔板隔开。次日早晨移除隔板，以确定鱼类交配时间。
   3. 将胚胎收集到盛有E3的培养皿中，使用体视显微镜进行观察。
   4. 在24 hpf（或您感兴趣的发育阶段），根据荧光表达情况筛选斑马鱼胚胎，并将呈阳性的胚胎转移至含有新鲜E3培养基的新培养皿中。
   5. 使用两把锋利的镊子小心地去除胚胎的卵膜（图2D 和 2E）。用第一把镊子夹住并固定卵壳膜，用第二把镊子将其撕开并撕下。 注1： 在体视显微镜的辅助下进行此步骤。

2. 多层封片

1. 包被 FEP 管
   1. 将钝头针头连接至注射器上。小心地将针头插入一段已清洗并切割好的 FEP 管的一端约 3 mm 深（图 2F 和 2G）。注意 1：操作时需佩戴手套，避免弯折或挤压管子。
   2. 将 FEP 管的自由端浸入 3% 甲基纤维素溶液中，并用该溶液充满管腔。
   3. 通过推动注射器缓慢排出甲基纤维素，弃去溶液。
   4. 使用 E3 溶液重复步骤 2.1.2 和 2.1.3。注意 1：包被后的管子应立即用于样品固定。
2. 将斑马鱼转移至琼脂糖中
   1. 将一份 0.1% 琼脂糖置于加热块中加热至 70°C。短暂涡旋反应管后，将其转移至设定为 38°C 的加热块中（图 2H）。
   2. 从加热块中取出反应管，短暂冷却。加入三卡因（Tricaine），使其终浓度达到 133–200 mg/L，再次涡旋混匀（图 2I）。
   3. 选取一个去壳的斑马鱼胚胎，用玻璃巴斯德移液管将其转移至含有预热 0.1% 琼脂糖的反应管中（图 2J 和 2K）。注意 1：尽量减少额外 E3 溶液的带入。
3. 固定斑马鱼
   1. 使用连接注射器的 FEP 管吸取胚胎（图 2L）。管内应完全充满 0.1% 琼脂糖，胚胎应靠近管子任一端，头部朝向管口方向。注意 1：在吸取胚胎前，确保先吸入部分琼脂糖。注意 2：轻柔抽吸注射器，避免产生气泡。注意 3：保持管子水平放置，防止内容物泄漏（图 2M 和 2N）。
4. 封堵管子
   
   
   图 2. 斑马鱼胚胎的多层固定方法。 A) 准备前缠绕在卷轴上的氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管。B) 连接钝头针头的注射器。C) 已清洗并切割的 FEP 管。D, E) 脱膜 24 小时斑马鱼胚胎。F) 将 FEP 管连接至钝头针头。G) 连接针头和管子的注射器。H) 将一份 0.1% 琼脂糖转移至加热块中的反应管内。I) 涡旋熔化的琼脂糖。J) 使用玻璃移液管吸取去壳胚胎。K) 将胚胎转移至熔化的琼脂糖中。L) 将胚胎及其周围琼脂糖吸入 FEP 管中。M, N) FEP 管内的斑马鱼胚胎。O) 在样本与针头之间切断管子。P) 利用涂有琼脂糖的培养皿封堵管子。Q) 封堵后管内的胚胎。R) 金属支架中的最终样品制备。点击此处查看高清图像。
   
   1. 使用剃须刀片将管子从针头上切断（图 2O）。
   2. 缓慢将含有胚胎的一端管子垂直穿过塑料培养皿中 1.5% 琼脂糖的整个厚度，以实现封堵（图 2P）。注意 1：避免产生气泡，并保持管子与琼脂糖表面完全垂直，以获得平整的封堵面。注意 2：轻微旋转管子以形成良好的封堵。
   3. 将固定好的样品保存在含有 E3 溶液的 1.5 ml 反应管中，以防干燥。样品现已准备好进行成像。成像前，请检查胚胎是否正好位于封堵面上方（图 2Q 和 2R）。同时确保成像腔室内的培养基中也加入与固定介质相同浓度的三卡因（Tricaine）。

结果

斑马鱼血管发育的多日成像

我们使用1 dpf的Tg(kdrl:GFP)¹³斑马鱼来展示多层固定策略在长期光片显微镜成像中的优势。目标是对整条斑马鱼在为期2天的过程中血管系统的发育进行成像。将斑马鱼胚胎包埋于0.1%琼脂糖中，并置于经甲基纤维素包被的聚合物管内。在此条件下，斑马鱼不受包埋介质的限制，能够正常发育。其头部抬起，尾部伸展，血管出芽过程也未受阻碍（图3）。

图 3. 斑马鱼血管系统发育的多日成像。 一只多层装载的1天龄Tg(kdrl:GFP) ¹³斑马鱼在光片显微镜下连续两天内无阻碍地发育其血管系统。使用488 nm激光光片激发荧光信号，并通过10X/0.3 W物镜和EMCCD相机检测信号。每10分钟在四个相邻位置采集Z轴层扫图像，随后使用Fiji ¹⁵进行图像拼接。图中显示了部分时间点的最大强度投影图像。比例尺：500 μm。 点击此处查看高分辨率图像。

斑马鱼早期胚胎发育的成像

在此，我们展示了FEP管作为光片显微镜观察受精后第一天早期斑马鱼胚胎发育的载样支撑能力。Tg(H2A:GFP)¹⁴ 斑马鱼胚胎在8 hpf时连同完整的绒毛膜一起被装载于内径为1 mm、充满E3培养基的管中，从而对绒毛膜产生轻微夹持作用。该装载方式不影响胚胎发育过程中的任何发育事件，并可利用光片显微镜实现最佳可视化观察。在本示例中，我们对样品进行了长达12小时的成像（图4）。在传统方法中，若去除绒毛膜并将胚胎嵌入1.5%琼脂糖进行装载，则早期胚胎发育过程中典型的形态变化（如卵黄逐渐伸长以及沿中线组织增厚）会受到抑制。

图 4. 斑马鱼早期胚胎发生的成像。 一条 Tg(H2A:GFP)¹⁴ 斑马鱼经历了早期胚胎发生过程。使用 488 nm 激光片层激发 GFP，荧光信号通过 10X/0.3 W 物镜和 EMCCD 相机检测。每隔 3 分钟从两个角度采集 Z 层扫描图像，持续 12 小时。图中显示了部分延时图像的归一化最大强度投影。19 hpf 时可见的运动模糊是由于胚胎在成像过程中抽动所致，实验未使用麻醉剂。比例尺：150 μm。 点击此处查看高分辨率图像。

讨论

先进的显微技术（如光片显微镜）使我们能够在数天内以高时间和空间分辨率记录图像数据，但也需要改进样品制备技术。本文介绍了一种用于斑马鱼发育研究的光片显微镜多层封装制样的详细方案。该方法操作简便，已在本实验室日常使用。

FEP 管

我们固定策略的关键组件是由氟化乙烯丙烯（FEP）聚合物制成的管材。选择FEP主要因其折射率为1.338，与水相近，因此特别适用于使用浸水物镜且样本需置于水相介质中的光片显微镜成像。内径为0.8 mm、壁厚为0.4 mm的FEP管材非常适用于发育中的斑马鱼胚胎，可兼容通常用于1.6 mm毛细管的样品支架，是我们所介绍的固定方法的首选。我们已在自主搭建的成像系统以及商用系统中对这些管材进行了充分测试。 "Lightsheet Z.1" 由卡尔·蔡司显微镜公司研究发现，FEP管具有长期稳定性，对光学性能影响极小，且无荧光性¹⁰然而，它们不适用于需要不同折射率样品的应用。 例如 透明化样本

FEP 制成的管材和箔材具有多种直径和厚度可供选择。此外，FEP 可在 260 °C 下熔化，因此为定制样品支撑装置提供了几乎无限的可能性。聚合物管通常以非无菌状态提供，因此清洗方案包含多个步骤，以确保最佳的光学质量。使用甲基纤维素进行包被，可确保发育中的斑马鱼胚胎任何部分均不会粘附于聚合物表面。

封片剂

选择0.1%琼脂糖是基于对不同浓度琼脂糖和甲基纤维素中斑马鱼生长速率与固定效果的大量测试结果¹⁰。当琼脂糖浓度高于0.1%时，已明显影响24小时受精后（hpf）斑马鱼的生长速率。此外，我们使用低剂量的麻醉药物Tricaine。Tricaine可阻断动作电位，从而抑制大脑与肌肉之间的信号传导，并抑制肌肉收缩¹⁶。浓度为133–200 mg/L的Tricaine可有效固定24–72 hpf阶段的斑马鱼。然而，我们测试的Tricaine及其他麻醉药物均表现出剂量依赖性的副作用，例如心脏水肿。此外，Tricaine所需剂量随胚胎发育阶段的不同而变化。因此，我们建议将Tricaine浓度降低至成像所需发育阶段的最低必要用量。为确保最佳效果并防止有毒副产物的生成，应使用新配制或解冻后的Tricaine储备液，并避光保存，且温度不得超过30 °C。

使用FEP管包埋还便于轻松调整封固介质以满足特定需求。对于心脏的延时成像，我们建议使用3%甲基纤维素和100 mg/L三卡因作为封固介质，而非0.1%琼脂糖和200 mg/L三卡因。甲基纤维素比0.1%琼脂糖更粘稠，因此自身即可提供更强的固定效果，同时需要使用的三卡因更少，即可确保胚胎被有效固定。

Tricaine 在高于 30 °C 的温度下不稳定，且可被成像室中的培养基稀释，从而导致麻醉效果下降并可能引起胚胎抽搐。因此，务必在固定样本所浸没的成像培养基中也添加 Tricaine。如果实验需要使用较高温度，我们建议通过灌流系统持续更换成像室中的培养基，或在两个时间点之间使用导管和注射器手动更换。

关键步骤

样品固定过程中的关键步骤包括将样本吸入管中以及插入琼脂糖凝胶塞。样本的吸入位置决定了胚胎的初始方位，而后续调整该位置较为困难。应准备多个样本用于固定，并使用体视显微镜监测固定质量。如果样本方向不理想，可通过调节吸入样本的速度并避免活塞的后续移动来改善，因为后者常会导致胚胎发生扭转。1.5%的琼脂糖凝胶塞对于防止0.1%琼脂糖泄漏至关重要。管内凝胶塞的表面应保持平整，以免影响胚胎在发育过程中的方向。为获得良好的表面，需尝试不同厚度的琼脂糖层，并确保将管垂直插入琼脂糖表面。轻微旋转管子并小心将其拔出，可使凝胶塞从培养皿中顺利脱出。在成像前，应使用体视显微镜检查固定的样品质量。

多视角成像

光片显微镜的一个主要优势是多视角成像，即能够旋转样本，从多个角度获取z轴层扫图像，并随后对这些图像进行配准与融合。一种已建立的在三维空间中对z轴层扫图像进行配准的方法是基于荧光微珠的配准，即利用围绕样本的荧光微珠作为基准标记物¹⁷。然而，该方法依赖于如1.5%琼脂糖之类的固体封埋介质，因此似乎与本文所介绍的多层封埋方法不兼容。但根据具体应用，存在多种替代方案可供选择。第一，可将荧光微珠掺入琼脂糖凝胶块中，且在图像采集过程中该凝胶块必须位于视野范围内。第二，可在正式实验前使用含有荧光微珠的1.5%琼脂糖柱对载物台位置进行校准。第三，可采用其他替代性标记物，例如荧光标记的细胞核，用于确定各z轴层扫图像之间的相对位置。

蒸发

典型的光片显微镜装置使用开放式的样品腔，这不可避免地会导致介质蒸发。由于介质对样本的存活至关重要，为了限制封片介质的蒸发，并保证光学元件与样品之间具有正确的折射率，我们建议采取以下一项或多项措施以防止蒸发。首先，可通过灌流系统持续更换样品腔中的介质；其次，可手动补充介质；第三，可用盖子或柔性薄膜覆盖样品腔。

氧气供应

聚合物FEP被设计用于耐受多种化学物质，因此具有坚固、化学惰性和不透气的特性。在多层固定的情况下，氧气只能通过琼脂糖塞和琼脂糖-空气界面渗透，但尚需验证多层固定时的氧气供应是否显著低于使用1.5%琼脂糖而无支撑聚合物管的固定方式。然而，由于使用1.5%琼脂糖固定仅能维持约两小时，之后斑马鱼形态即受到影响，因此多层固定似乎是长期成像的整体更优方案。

成像发育的早期阶段

多层封片现已成为我们对24 hpf以上斑马鱼进行延时成像光片显微镜观察的标准包埋技术。此外，我们还使用聚合物管对更早期胚胎进行成像。胚胎保留在其卵膜内，并置于内径为1 mm的FEP管中，管内充满E3培养基。斑马鱼胚胎可在卵膜内自由发育，仍能通过光片显微镜获得良好的成像效果。

展望

本文展示的多层样品固定方法充分释放了光片显微镜在斑马鱼实时发育生物学研究中的潜力。该方法可轻松适用于其他显微成像技术（如光学投影断层成像，OPT）以及其他生物体。我们认为，标准尺寸的FEP管仅为针对特定需求定制样品固定技术的第一步。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氟化乙烯丙烯（FEP）管	Bola	S 1815-04	内径/外径 0.8/1.6 mm，也可提供其他规格
1 ml Omnifix-F Solo 注射器	B. Braun Melsungen AG	9161406 V
Sterican 一次性钝头套管针	B. Braun Melsungen AG	9180109	0.8 mm × 22 mm，也可提供其他规格；套管针外径必须与 FEP 管内径匹配
50 ml 聚丙烯离心管	Corning	430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH
70% EtOH
甲基纤维素	Sigma	M0387	以粉末形式提供
E3 培养基（用于斑马鱼胚胎）
1.5 ml 离心管	Eppendorf	3810X
低凝胶温度琼脂糖	Sigma	A9414	以粉末形式提供
培养皿	Greiner	633180	塑料材质，94 mm × 16 mm
三卡因	Sigma	E10521	别名：  3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐、MS-222、TS 222、三卡因甲磺酸盐
10X/0.3 W 显微镜物镜	Leica	HCX APO L
EMCCD 相机	Andor Technology	iXon 885 EMCCD