建立原发性侵袭性原位膀胱癌异种移植模型的传统技术需要开腹手术并游离膀胱。该操作对小鼠造成显著的病痛，技术难度高且耗时。因此，我们开发了一种利用超声引导的高精度经皮穿刺方法。
本文内容
摘要
摘要
原位膀胱癌异种移植模型是体内研究分子细胞调控和新治疗药物的金标准 in vivo。合适的细胞系可通过膀胱内灌注接种（模拟非肌层浸润性生长模型）或直接注射至膀胱壁内（模拟浸润性生长模型）。这两种操作均较为复杂且耗时较长。此外，由于缺乏在灌注后具有致瘤性的细胞系，表浅模型存在明显局限性。而壁内注射则因操作具有侵入性，且会导致宿主小鼠出现相应并发症，因而也存在缺陷。
鉴于上述不足，我们对先前方法进行了改进，开发出一种微创的原位膀胱癌异种移植模型构建方法。在超声引导下，我们成功将膀胱癌细胞系 UM-UC1、UM-UC3 和 UM-UC13 经皮接种至 50 只裸鼠体内。结果表明，该方法具有高效、精确且安全的特点。该技术首先通过 PBS 在膀胱黏膜下创建一个空间，随后在第二步中将肿瘤细胞注射至该空间内。通过生物发光成像和超声技术定期监测肿瘤生长情况。在研究期间，50 只小鼠中除一只外，其余小鼠的平均肿瘤体积均呈稳定增长趋势。
在我们机构，这种能够以微创、快速且高度精确的方式进行膀胱癌异种移植接种的新方法，已取代了传统模型。
引言
癌症研究依赖于利用患者肿瘤来源的细胞系建立的人类癌症动物模型，以加深我们对肿瘤生物学的理解。对于 体内 不同治疗策略下的生长分析，小鼠原位膀胱癌模型仍是参考标准1,2将人膀胱癌细胞接种于免疫缺陷小鼠（异种移植模型）依赖于膀胱内灌注（“膀胱内模型”）3,4,5 或直接注射至膀胱壁内（“壁内模型”）6,7这两种技术也可在大鼠中进行8,9.
膀胱内灌注可诱导膀胱尿路上皮表面形成肿瘤，从而便于后续对这些肿瘤进行新型治疗药物的膀胱内灌注。然而，通过该方法接种后能够稳定成瘤的细胞系数量有限，其中一种常用细胞系KU7最近被证实实为HeLa细胞4,10。此外，由于需要足够的药物留置时间，膀胱内灌注操作耗时较长，且常导致泌尿道邻近部位（包括尿道、输尿管和肾盂）出现肿瘤生长11。更重要的是，膀胱内灌注常引起肿瘤在膀胱底部（输尿管进入膀胱的区域）生长，可能导致上尿路梗阻及随之而来的肾功能衰竭。
适用于全身性治疗的原发性侵袭性膀胱癌异种移植模型可通过将肿瘤细胞直接注射到膀胱壁内建立12。尽管多种细胞系在此模型中均能良好生长，但该模型的局限性在于其侵入性，需进行腹部切口操作13。此外，由于将细胞精确注射至膀胱肌层的技术难度较高，该模型也较难掌握。
我们科室已开发出一种在小鼠体内建立原位原发性浸润性膀胱癌异种移植模型的新方法，以克服现有“壁内模型”的局限性。我们成功优化了经皮超声引导下将膀胱癌细胞注射至膀胱前壁的技术，使该新方法能够有效替代传统的侵入性模型。此外，我们还可能提高了“壁内模型”的准确性和可重复性。
方案
所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南进行。该实验方案已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准（方案编号：A10-0192）。
1. 细胞系的制备
- 通过DNA指纹图谱确认相应的人类膀胱癌细胞系的身份7。
- 为了通过生物发光分析异种移植肿瘤的生长情况，使用携带萤火虫荧光素酶基因的慢病毒载体转染细胞系3。
- 在含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的湿化环境中复苏并扩增现有细胞系。传代细胞至少3次，但避免培养时间超过3个月。
2. 细胞悬液的制备
- 解冻 Matrigel。保持温度低于 4 °C，以避免凝胶黏度增加。
- 在细胞融合度达到 70% 时进行胰酶消化，并将细胞悬浮于正常生长培养基中。
- 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
- 将细胞悬液在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
- 加入适量体积的 DMEM（10% FBS）和 Matrigel（1:1 比例），以达到所需的细胞浓度，该浓度取决于所用细胞系及期望的生长动力学（8–15 × 106/ml）。肿瘤细胞悬液的注射体积为 40 µl。
- 使用移液器（P1000）反复吹打充分混匀，避免在悬液中产生气泡。
3. 动物准备
注意：由于步骤 4.7 中可能需要进行经尿道插管，因此在该动物模型中优先选用雌性小鼠。
- 根据机构和国家动物护理指南饲养家鼠。涉及小鼠的所有实验均须获得伦理委员会批准。
- 使用 3% 异氟烷/氧气混合气体对小鼠进行麻醉。确认动物已充分麻醉（e.g. 对脚趾夹捏无反应）。
4. 实验设置
- 使用任何类型的扁平硬质塑料材料制作膀胱固定带 [图 2 I]。在将固定带应用于小鼠前，仔细检查并去除所有锋利边缘。
- 将动物固定于小动物成像平台的加热成像台上 [图 1 I]，并持续监测生命体征。使用橡胶带固定动物的下肢 [图 1 III]。
- 用2%葡萄糖酸氯己定对腹部进行消毒，并用无菌棉签擦拭皮肤。
- 使用膀胱固定带固定膀胱 [图 2 II]，以避免在第5.6步进行膀胱壁内注射时膀胱移位。
- 在下腹部涂抹无菌超声耦合剂。
- 将超声探头（频率40 MHz） [图 1 IV] 缓慢贴近皮肤（纵向，头侧角度为45–70°），并在超声屏幕上观察膀胱 [图 3 I]。
- 若膀胱为空，通过经尿道插入的24 G 套管针注入50 µl 无菌温热的磷酸盐缓冲液（PBS）以充盈膀胱。
5. 膀胱壁层的分离
- 将一个装有 PBS 的 1.0 ml 注射器连接至 30 G、¾ 英寸长的针头（针尖斜面朝前），并固定到注射器夹上。
- 将针头以 30–45° 角度（相对于超声探头长轴为 80–90°）置于耻骨联合上方的皮肤处 [图 1]。
- 在超声屏幕上观察针头位置。
- 缓慢穿刺皮肤及腹壁肌肉 [图 3 II]。
- 将针头斜面旋转 180°（此时斜面朝后）。
- 将针尖插入膀胱壁，但不穿透黏膜 [图 3 III]。
- 缓慢注入 50 µl PBS 至肌层与黏膜之间，以形成人工腔隙 [图 3 IV]。
注意：若在步骤 5.6 中意外穿破黏膜，应缓慢回撤针头，待黏膜层重新覆盖针尖后，再注入 50 µl PBS。 - 撤出针头。
6. 膀胱癌细胞的膀胱壁内接种
- 将装有悬浮于Matrigel中的癌细胞的第二个1.0 ml 注射器（配有30 G、¾ in针头）连接至注射器夹具。
- 引导针头尖端进入步骤5.7中已创建的同一PBS填充空间。
- 向该空间注入40 µl 细胞悬液[图 3 V和 VI]。
- 撤出针头。
7. 干预后的支持性护理
- 将小鼠从成像平台上取下。
- 在动物从麻醉中恢复期间，将其置于温暖舒适的环境中，并持续监护。
- 待动物恢复意识并能正常行走后，将其放回原饲养笼中。
结果
在连续三天内，对50只动物在超声引导下进行了三种不同肿瘤细胞系（UM-UC1 luc、UM-UC3 luc 和 UM-UC13 luc）的肌层注射。接种操作高效完成（平均耗时5.7分钟/只动物），且未出现任何术中或术后并发症。
通过超声成像和生物发光对肿瘤生长进行监测。在第3天，所有50只动物的膀胱前壁均可通过超声检测到肿瘤 [图 4 I]。98%的小鼠在随访期间显示出持续的肿瘤生长 [图 4 和 图 5]。接种 UM-UC3 luc 后，一只小鼠出现腹腔内肿瘤播散，另一只小鼠在第7天后肿瘤发生退缩 [表 1]。这是采用该新 technique 接种的第一组小鼠。
分别在接种UM-UC3 luc、UM-UC1 luc和UM-UC13 luc后的第24天、第28天和第37天处死小鼠。取出异种移植肿瘤，并通过苏木精-伊红（H&E）切片进行检查。所有肿瘤均表现为肌层浸润性，部分浸润至膀胱周围脂肪组织，但未观察到对邻近器官的浸润[图6 I]。携带UM-UC13 luc肿瘤的小鼠中有60%以及携带UM-UC3 luc肿瘤的小鼠中有20%出现了腹膜后淋巴结转移，经H&E染色证实[图6 II]。
图1. 实验装置的图像与示意图。 小鼠被固定在加热的手术台上（I），并在3%异氟烷/氧气混合气体麻醉下进行操作（II）。下肢用橡胶带固定（III）。将超声探头（IV）贴近皮肤（沿头侧方向呈45–70°纵向对齐）后，可在超声屏幕上观察到膀胱（V）。使用带30 G针头的注射器（VI）以30–45°角刺入皮肤（相对于超声探头长轴为80–90°）。
图2. 膀胱的固定。 用于构建膀胱稳定带的尺寸与示意图（I）该带固定于下腹部并固定膀胱（II），从而避免在膀胱壁内注射过程中膀胱发生移位。
图3. 肿瘤细胞的肌层内接种。 超声屏幕上膀胱的可视化图像（I）。穿透皮肤及腹壁肌肉（II）。将针头插入膀胱壁但未穿透黏膜层（III）。缓慢注射后，磷酸盐缓冲液（PBS，50 µl）位于肌层与黏膜层之间（IV）。悬浮于Matrigel中的肿瘤细胞位于人工形成的肌层内空间中（V、VI）。
图4. 超声随访。 通过超声进行持续随访，显示肿瘤体积显著增加（I：第3天，II：第7天，III：第13天）。
图5. 生物发光成像的随访结果。 通过生物发光进行的持续随访显示，在研究期间发光信号持续增加。
图6. 异种移植肿瘤及淋巴结转移的组织学分析。 整体上 H&代表性异种移植肿瘤的E区切片，显示肿瘤侵入肌肉组织，但未侵犯邻近器官I）。携带 UM-UC13 luc 肿瘤的小鼠中有 60% 以及携带 UM-UC3 luc 肿瘤的小鼠中有 20% 出现腹膜后淋巴结转移（II).
| 接种的细胞系 | UM-UC1 luc | UM-UC3 luc | UM-UC13 luc | |
| 小鼠数量 | 20 | 15 | 15 | |
| 注射体积，µL | 40 | 50 | 50 | |
| 细胞数量，绝对值 | 3.6 x 105 | 6 x 105 | 5.5 x 105 | |
| 每只动物操作时间，min | 3.4 (±1.6) | 7.7 (±3.7) | 6.8 (±2.9) | |
| 肿瘤发生率 | 49 (98%) | |||
| 20 (100%) | 14 (93%) | 15 (100%) | ||
| 淋巴结转移 | 0 | 3 (20%) | 9 (60%) | |
| 随访时间（天） | 28 | 22 [治疗前] | 28 [治疗前] | |
| 肿瘤体积 (μL) | 第4天 | 11.6 (±1.3) | 12.5 (±1.7) | 14.4 (±1.3) |
| 随访结束时 | 394.6 (±72.4) | 288.7 (±66.1) | 78.3 (±13.4) | |
| 随访 | ||||
| 肿瘤发光强度（光子/秒） | 第4天 | 4.6 x 108 | 2.0 x 108 | 5.8 x 108 |
| (±9.4 x 107) | (±3.7 x 107) | (±1.3 x 108) | ||
| 随访结束时 | 1.9 x 1010 | 1.4 x 1010 | 1.5 x 1010 | |
| 随访结束时 | (±4.0 x 109) | (±2.3 x 109) | (±1.9 x 109) |
表1. 超声引导下肿瘤细胞注射——操作步骤与结果。
讨论
几乎所有癌症治疗的重大进展在启动临床试验之前都需要在动物模型中进行测试。癌症的动物模型是重要的研究工具，使研究人员能够在活体（in vivo）条件下研究肿瘤生物学。原位异种移植模型仍是金标准1,2，并持续提供最大的灵活性（在细胞系选择方面），且具有最高的实际应用价值。
所示操作步骤是对 Dinney 等12 之前描述的原位模型进行的微创改良。我们通过超声引导下经皮注射三种不同细胞系建立异种移植肿瘤，技术成功率达到100%。在持续随访过程中，98%的小鼠表现出肿瘤体积持续增加。
通过采用微创技术，我们克服了壁内模型现有的局限性。除符合动物福利要求外，该手术方式的侵入性降低也有助于提高实验结果的可重复性 体内 通过减少手术并发症，该实验方法具有显著优势。避免开腹剖腹手术及其相关的伤口缝合需求，极大地提高了时间效率。我们成功将每只动物的手术操作时间显著缩短至3.4分钟（±1.6分钟）。然而，本创新方法的主要优势在于其精确性。高分辨率超声成像使我们能够清晰观察到生理盐水注射后在膀胱壁黏膜下形成的腔隙。这一初步注射步骤有助于在第二步中准确注入肿瘤细胞，并最大限度降低肿瘤细胞外溢的风险。相比之下，在开腹手术后进行的膀胱壁内注射技术无法实时观察针头位置，注射深度始终存在不确定性。此外，由于我们严格将肿瘤细胞接种于膀胱前壁，因此避免了肿瘤在膀胱后壁生长。继而，因肿瘤生长靠近输尿管开口所导致的梗阻性并发症发生率极低。这一伴随效应使得肿瘤生长和治疗观察周期得以延长。
超声引导肿瘤接种的主要局限性在于需要具备适当的技術設備。因此，該操作很可能僅限於專門從事人類癌症動物模型研究的中心開展。這應鼓勵非此類機構的研究團隊與具備新型動物建模專業知識的團隊之間加強合作。
尽管该模型的操作依赖于对超声成像的熟悉程度以及一定的手法技巧，但在熟练的指导下易于掌握。操作中的关键步骤是使用生理盐水在膀胱壁的黏膜下层创建一个人工空间。一旦在未穿透黏膜层的情况下成功建立该空间，其可维持数分钟的稳定性。随后将第二根针引导至该空间以接种肿瘤细胞，此步骤相对简单。在创建黏膜下空间过程中，主要的并发症是针头穿入膀胱腔内。然而，黏膜下空间的建立仍然可行：此时需将针头缓慢退入膀胱壁，并在黏膜层翻转覆盖针尖时立即注入生理盐水。完成此操作后，黏膜下空间的稳定性降低（生理盐水将在30至60秒内渗漏至膀胱腔），因此必须迅速完成肿瘤细胞的注射。在发生黏膜穿孔的情况下，肿瘤细胞可能溢入膀胱腔内。尽管肿瘤细胞从膀胱壁内空间丢失可能导致随访期间肿瘤体积减小，但我们从未观察到膀胱腔内出现肿瘤着床现象。
另一个潜在的并发症是肿瘤细胞通过注射通道溢出到腹腔内。我们在50只动物中仅观察到1例腹腔内肿瘤细胞播散，且发生在我们最初的尝试之一。我们认为这是由于注射了过大量的肿瘤细胞悬液所致。这一推断得到了以下事实的支持：将注射体积从50–40 µl 减少后，未再发生腹腔内溢出。
这种微创接种小鼠原位膀胱癌异种移植模型是对现有“壁内注射模型”的创新性改进，对研究人员和实验动物均有益处。该模型的优势鼓励将其推广应用于其他器官，如肾脏、前列腺和肝脏，以微创方式建立原位异种移植肿瘤。
披露
本视频文章的开放获取由 FUJIFILM VisualSonics, Inc. 赞助。
致谢
作者谨此感谢 Eliana Beraldi 在肿瘤细胞系病毒转导实验中的贡献，以及 Ben Deeley 在小动物超声成像平台使用方面的指导。
本项目由德国研究基金会（DFG；JA 2117/1–1:1）、加拿大癌症协会研究所，以及温哥华沿海健康研究所资助的导师制医师科学家奖支持。超声成像平台由加拿大创新基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯己定葡萄糖酸盐（2%） | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s 修饰 Eagle’s 培养基（DMEM） | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| 异氟烷 | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| 胰蛋白酶（0.25%） | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| 注射器（1 ml） | BD Bioscience | 309659 | |
| 皮下注射针头（30 G；¾ 英寸） | Kendall | 830340 | |
| 血管导管（24 G） | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 小动物成像平台 | VisualSonics | ||
| RMV 706 超声探头 | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
参考文献
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
重印与许可
标签
