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方法文章

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

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DOI：

10.3791/51138

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2014年2月5日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah School of Medicine, 3Interdepartmental Program in Neurosciences, University of Utah School of Medicine, 4Mutation Generation and Detection Core, HSC Core Research Facility, University of Utah School of Medicine, 5Department of Neurology, University of Utah School of Medicine

本文内容

摘要

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。

摘要

斑马鱼是研究发育、疾病建模和药物筛选的强有力脊椎动物模型系统。近年来已引入多种遗传工具，包括多种诱导突变和建立转基因品系的策略。然而，大规模筛选受到传统基因分型方法的限制，这些方法耗时且劳动密集。本文介绍一种通过PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）来分析斑马鱼基因型的技术。 该方法快速、灵敏、成本低廉，且污染风险较低。 通过PCR结合HRMA进行基因分型可用于胚胎或成年鱼，适用于高通量筛选方案。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种广泛用于发育研究和疾病建模的脊椎动物模型系统。近年来，已开发出多种针对斑马鱼的转基因和突变技术。 快速转基因技术通常基于Tol2转座子系统1，并结合了多种DNA片段组装的改进型克隆方法2。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已被用于靶向斑马鱼体细胞和生殖细胞中的特定基因位点3,4。这些技术能够高效地产生基因修饰动物，实现高频突变生成和生殖系传递3,4。

尽管取得了这些进展，传统的斑马鱼基因分型技术仍限制了诱变和转基因工具的充分发挥。 聚合酶链式反应（PCR）结合凝胶电泳是检测基因组修饰的常用方法，有时还需联合限制性内切酶消化，但该方法耗时较长，且对小片段插入或缺失的检测灵敏度较低。TaqMan探针检测法初始成本较高，且需要精细的优化。PCR产物测序可能需要数天时间，不适合大规模筛选。 限制性片段长度多态性（RFLP）分析仅能区分影响有限数量限制性内切酶识别位点的单核苷酸多态性（SNP）。

高分辨率熔解分析（HRMA）是一种封闭管式PCR后分析方法，是近年来发展起来的一种快速、灵敏、成本低廉且适用于大规模样本筛查的技术。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性（SNPs）、突变和转基因序列5-7。该技术基于双链DNA的热变性原理，每个PCR扩增产物都具有独特的解链（熔解）特征5。由于不同样本的核苷酸组成、GC含量或长度存在差异，通常结合使用仅与双链DNA结合的荧光染料，即可实现样本间的区分8。因此，HRMA可根据不同的熔解曲线特征来区分不同基因型。由于HRMA使用低成本试剂，并且为一步式PCR后处理流程，因此适用于高通量分析策略。 HRMA具有非破坏性特点，分析完成后PCR扩增产物仍可用于其他后续应用。 HRMA已广泛应用于多种生物体和系统中，包括细胞系、小鼠和人类9-11。近年来，该技术也被用于斑马鱼中，以检测由锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）诱导的突变6,12,13。

本文介绍了如何在胚胎期和成年斑马鱼中进行基于 PCR 的高分辨率熔解曲线分析（HRMA）（图1）。该实验方案适用于检测单核苷酸多态性（SNPs）、转基因序列以及突变，包括单碱基对的替换、插入或缺失。

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方案

1. DNA 制备

  1. 制备DNA裂解缓冲液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、0.3% Tween 20、0.3% NP40。在使用当天，加入新鲜的蛋白酶K，使其终浓度为1 mg/ml12。
  2. 组织采集：
    1. 成年鱼尾鳍取样：
      1. 麻醉鱼类：将鱼放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，等待鳃部运动减缓。
      2. 将鱼置于5–10层Kimwipe纸巾上，用无菌剃须刀片切割尾鳍一小段，约2–3 mm。
      3. 迅速将鱼转移至标记好的盛有新鲜水的水族箱中恢复；同时仔细标记水族箱及对应含有尾鳍组织的离心管。每隔一天更换水并喂食。
      4. 用无菌移液器吸头拾取尾鳍组织，转移至含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。
      5. 丢弃移液器吸头，并将剃须刀片弃入锐器容器中。
    2. 胚胎尾部取样：
      1. 将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。
      2. 在解剖显微镜下用镊子剪取尾部组织片段。
      3. 将尾部组织放入含有30 μl DNA裂解缓冲液的标记离心管中。
      4. 迅速将胚胎放入含有100 μl 4%多聚甲醛的离心管中。
      5. 标记含有胚胎的离心管及其对应的尾部组织管。
      6. 将含有胚胎的离心管在4 °C下过夜保存以完成固定。
      7. 每处理一个胚胎后，使用Milli-Q水和Kimwipe纸巾清洁镊子，以最大限度减少交叉污染。
    3. 整胚取样：
      1. 将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。
      2. 将1–5个胚胎放入含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。无需去壳。
  3. DNA消化
    将含有组织（尾鳍、尾部片段或胚胎）的离心管在55 °C孵育4小时至过夜12。
  4. 灭活蛋白酶K
    将离心管在95 °C加热15分钟12。所得DNA应立即用于PCR，或在-20 °C保存不超过3个月。

2. PCR

  1. 使用引物设计软件或手动设计引物（例如 Lightscanner引物设计软件 - Biofire。用于高分辨率熔解曲线分析（HRMA）的PCR产物通常为50-200 bp；用于SNP检测的PCR产物应更小，通常为50-80 bp。
  2. PCR
    1. 在96孔或384孔板中进行PCR反应。
    2. 使用10 μl总体积：4 μl LightScanner预混液（含0.1 U热启动Taq-AB聚合酶、缓冲液、0.2 mM dNTPs、2 mM氯化镁和1×荧光双链DNA结合染料）；各5 pmol引物，以及来自成体尾鳍的1 μl基因组DNA模板或来自胚胎尾部的3 μl基因组DNA13.
    3. 用 30 μl 矿物油覆盖样品。
    4. 用光学透明的粘性封膜覆盖平板。
    5. 优化PCR扩增循环条件——典型条件为：95 °C预变性5 min，随后进行30个循环（95 °C变性10 sec，60 °C退火25 sec，72 °C延伸30 sec），最后在95 °C维持30 sec，然后冷却至15 °C。
    6. 将PCR板保存在4 °C，或直接进行高分辨率熔解曲线分析（HRMA）。
    7. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物大小，以确认PCR扩增结果，此步骤应在PCR初始优化过程中进行；必要时，还需对PCR产物进行测序验证。

3. 高分辨率熔解曲线分析（HRMA）

  1. 加热板
    1. 将板放入熔解分析系统中。
    2. 打开软件（LightScanner Software Call-IT 2.0）。
    3. 将板从 60–95 °C 加热。
    4. 创建新的数据存储文件。
  2. 分析 HRMA 数据（图 2）。
    可进行多个分析步骤。我们展示最常用的一组数据处理方法。
    1. 子集设置
      单击“子集”选项卡。选择含有样品的孔。
    2. 归一化
      1. 在左侧面板中选择归一化选项卡。为消除荧光差异，手动将平行双线分别置于熔解前（初始）和熔解后（最终）区域，如图所示（图 2C，箭头），并将所有样品的熔解前和熔解后荧光信号分别归一化为 1 和 014。
      2. 调整双线位置，使熔解区域位于熔解前与熔解后双线之间但不被选中。通常，Lower Min 与 Lower Max（以及 Upper Min 与 Upper Max）温度线应相距约 1 °C。
      3. 选择用于归一化的温度点，使所有样品在熔解前区域达到最大或完全（100%）荧光 ，在熔解后区域达到最小或无（0%）荧光（尽可能接近理想状态）。 归一化后应呈现一条接近水平的线，在达到熔解点前保持在最大荧光值 1，之后从熔解点起保持在最小荧光值 0 的接近水平线；不应出现高于 1 或低于 0 的荧光水平。 例如，在图 2C中，使用 79–80 °C 的温度范围对熔解前曲线进行归一化。
    3. 分组/聚类
      根据熔解温度区分基因型（图 2C，绿色框）。选择分组。
      1. 在分组部分的标准下拉列表中选择自动分组。
      2. 在分组部分的灵敏度下拉列表中，针对具有单一转变或多个转变的熔解曲线分别选择正常或高。
      3. 在分组部分点击计算分组。
      4. 转至文件菜单并点击保存以保存结果。

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结果

该实验方案可在一天内完成，也可分步在数天内进行（工作流程图见图1）。DNA提取后，进行PCR扩增产物的熔解与分析。扩增产物的熔解温度取决于其大小和GC含量，但起始和终止温度通常设置为50 °C和95 °C较为合适（图2A和图2B）。完成熔解后，对荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样本曲线间的荧光差异进行归一化处理（图2C），以提高来自不同样本结果之间的可比性，这些样本的荧光差异可能源于微小的实验波动。用于归一化的每对温度线应相距约1 °C（图2C，箭头所示）。数据结果的分组以两种方式呈现：上方的图表显示熔解曲线轮廓，下方的图表则显示相对于参考样本的减法差值图（图2D）。

高分辨率熔解曲线分析（HRMA）可用于检测突变（图3A和3B）或转基因（图3C）。...

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讨论

PCR 结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）是一种高效的斑马鱼基因分型技术。该方法具有快速、稳健以及高灵敏度等优点，甚至可检测到单个碱基突变。整个实验流程，从剪取鳍组织到完成熔解曲线分析，可由单人操作并在八小时内完成。此外，该技术适用于高通量筛选，无需使用溴化乙锭，且在所有 PCR 及分析步骤中均采用封闭体系，有助于最大限度减少污染问题。

该技术的关键步骤是PCR扩增子和引物的设计。在高分辨率熔解曲线分析（HRMA）中，PCR产物的典型长度为50-200 bp。较短的扩增子可提高检测灵敏度，非常适合检测单核苷酸变化。如果难以区分密切相关PCR产物的熔解曲线，可在PCR反应中加入一段与SNP互补且在3’端阻断的小寡核苷酸（Lunaprobes；探针）。这些探针通过不对称PCR生成，使用不同浓度的正向和反向引物，并在3’端添加C3阻断剂，以防止探针在后续HRMA PCR中延伸。然后将该探针加入HRMA PCR反应中。 随后在探针存在下进行HRMA，此时不对称探针与PCR产物结合，形成具有不同熔解曲线的探针-靶标双链体，从而可用于区分等位基因。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Blaschke、Grunwald 和 Wittwer 实验室的成员提供的建议和技术支持。本工作由 PCMC 基金会、美国国立卫生研究院（NIH）R01 MH092256 和 DP2 MH100008 项目以及美国出生缺陷基金会研究基金 #1-FY13-425 资助，资助对象为 JLB。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100次反应 LightScanner 预混液BioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
硬壳PCR 96孔黑白板Bio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Microseal 'B' 压敏封膜Bio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96孔 LightScanner 仪器BioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
含 Call-IT 2.0 的 LightScanner 软件BioFirewww.biofiredx.com
高分辨率熔解曲线分析 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner 引物设计软件BioFirewww.biofiredx.com
Vector NTI 软件Invitrogenwww.invitrogen.com
三卡因
多聚甲醛

参考文献

  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  3. Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  4. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  5. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
  6. Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
  7. Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
  8. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
  9. Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
  10. Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
  11. Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
  12. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  13. Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
  14. Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
  15. Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
  16. Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
  17. Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
  18. Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).

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