方法文章

快速，高效的斑马鱼基因分型采用PCR与高分辨率熔体分析

DOI：

10.3791/51138

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2014年2月5日

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1Division of Pediatric Neurology, Department of Pediatrics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Neurobiology and Anatomy, University of Utah School of Medicine, 3Interdepartmental Program in Neurosciences, University of Utah School of Medicine, 4Mutation Generation and Detection Core, HSC Core Research Facility, University of Utah School of Medicine, 5Department of Neurology, University of Utah School of Medicine

本文内容

摘要

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PCR结合高分辨率的熔融分析（HRMA）被证明是一种快速，有效的方法，以斑马鱼的基因型。

摘要

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斑马鱼是研究开发，造型疾病，并进行药物筛选功能强大的脊椎动物模型系统。最近的各种遗传工具的相继出台，其中包括诱导突变并产生转基因株系多种策略。然而，大规模的筛选是通过传统的基因分型方法，这是耗时耗力的限制。在这里，我们描述的技术来分析斑马鱼的基因型PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）。这种方法快速，灵敏，而且价格便宜，具有污染器物风险较低。基因分型的PCR与HRMA可以用于胚胎或成年鱼，包括高通量筛选的协议。

引言

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斑马鱼（ 斑马鱼 ）是脊椎动物模型系统广泛用于开发和疾病模型的研究。最近，众多的转基因和基因突变技术已经开发了斑马鱼。快速的转基因技术，通常根据一个TOL2座子系统1中，已合并为多个DNA片段组件2改进的克隆选择。锌指核酸酶（ZFN）和转录活化因子样效应物核酸酶（TALENS）已被用于靶向基因座在两个体细胞和生殖系细胞，斑马鱼3,4。这些技术可以有效地产生转基因动物，具有高频突变的创建和种系传递3,4。

尽管取得了这些进展，在传统的斑马鱼基因分型技术限制的诱变和转基因工具的全部功能。 PCR然后进行凝胶电泳，有时结合不受限制。Ñ​​酶消化，被广泛用于检测基因组的修饰，但很费时，并确定小插入或缺失不敏感。 TaqMan探针检测具有较高的初始成本，需要仔细优化。 PCR产物的测序可能需要几天时间，并且是不实用的大规模筛选。限制性片段长度多态性（RFLP）分析，只能判别影响的限制性内切酶识别位点的一个有限的范围内的SNP。

高分辨率熔解分析（HRMA），封闭管后的PCR分析方法，是一种最近开发的方法，该方法快速，灵敏，价格低廉，适合于筛选大量样品。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性，突变，和转基因5-7。 HRMA是基于双链DNA热变性，并且每个....

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方案

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1。 DNA的制备

  1. 制备的DNA的裂解缓冲液:50mM的KCl，10mM的Tris-盐酸的pH 8.3，0.3％吐温20，0.3％NP40。加入新鲜的蛋白酶K至对使用12的天1毫克/毫升的最终浓度。
  2. 组织收集:
    1. 对于成年鱼翅夹:
      1. 麻醉鱼:将鱼在0.004％的MS-222（三卡因）解决方案。等到鳃运动减慢。
      2. 把鱼放在一摞5-10的Kimwipes切一小片尾翼，约2-3毫米，用无菌刀片的。
      3. 迅速将鱼与淡水回收标记罐;仔细标注两个油箱和相应的管道将包含翅夹。换水及隔日喂鱼。
      4. 拿起翅片夹，用无菌移液管尖端，并将其转移到充满100μl的DNA的裂解缓冲液的管中。
      5. 丢弃枪头，并丢弃刀片成锐器容器。
    2. 胚胎长尾夹:
      1. 把胚胎成0.004％的MS-222（三卡因）溶液。等待2分钟。
      2. 切下一块尾部用解剖显微镜下用镊子。
      3. 把尾巴放入盛有30微升的DNA裂解液标记管。
      4. 赶紧把胚胎成含100微升4％多聚甲醛管。
      5. 标签管与胚胎和相应的尾管中。
      6. 存储与胚胎试管在4℃过夜固定。
      7. 使用，以减少污染的每个胚胎之间的Milli-Q水和清洁的Kimwipes的钳子。
    3. 对于整个胚胎:
      1. 把胚胎成0.00....

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结果

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可以在一天内进行，或在步骤分离出的协议数天（工作的流程图示于图1）。 DNA提取之后，通过PCR扩增子的熔化和分析。的温度为扩增子的熔化取决于大小和GC含量，但一般就50˚C和95˚C端的温度是适当的（ 图2A和2B）。一旦熔体被执行时，荧光熔融曲线的分析通常需要不同的样本曲线的变化的归一化，使用前和后的熔融区域作为标准（ 图2C）。这提高了来自不同样品的结果，其中荧光的变化与次要试验变化的比较。每对温线正常化应放置约1˚C分开（ 图2C，箭头）。;分组的数据的结果被表示在两种不同的方式:上部曲线图，表示熔融曲线的档案和下部曲线图，表示在比较的参比样品（ 图2D）减色差曲线图。

HRMA分析可以用来检测突变（ 图3A和3B）或转基因（ 图3C）。在图3A

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讨论

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PCR结合HRMA是一种功​​能强大的技术，斑马鱼基因分型。这种方法的优点是它的速度，鲁棒性，以及灵敏度来检测偶数的点突变。整个协议，从翅片夹熔化曲线分析，可在少于八小时由个人执行的。此外，该技术是适合于高通量筛选;不需要使用溴化乙锭;和密封所有PCR和分析步骤，这有助于减少污染的问题。

这种技术的一个关键步骤是PCR扩增子和引物设计。典型的长度为PCR产物在HRMA是50-200 bp之间。短扩增子提高灵敏度，非常适合检测单核苷酸的变化。如果紧密相关的PCR产物物种熔融曲线不能容易地区别，一个小的寡核苷酸互补的SNP和阻止在3'端可以包括在该PCR反应（Lunaprobes;探针S）。通过不对称PCR，使用不同浓度的正向的生成和反向引物，用3'C3阻断剂以防止在随后的HRMA PCR探针延伸的探针。然后将探针包括在HRMA PCR反应。 HRMA然后发生与探针，其中，所述非对称探针结合的PCR产物，并生成探针 - 靶双链体具有不同的熔融曲线可以用于区分等位基因。

有几家公司提供熔点曲线分析系统。这些措施包括.......

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

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我们感谢布拉施克，格伦​​沃尔德和WITTWER实验室的咨询和技术援助的成员。这项工作是由PCMC基金会，美国国立卫生研究院R01 MH092256和DP2 MH100008和优生优育基金会的研究经费＃1-FY13-425的3月，为广东健力宝的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 次反应 LightScanner 预混液BioFireHRLS-ASY-0002www.biofiredx.com
硬壳 PCR 96 孔 BLK/WHT 板Bio-Rad LaboratoriesHSP9665www.bio-rad.com
Microseal 'B' 粘性密封件Bio-Rad LaboratoriesMSB1001www.bio-rad.com
96 孔 LightScanner 仪器BioFireLSCN-ASY-0040www.biofiredx.com
带有 Call-IT 2.0的 LightScanner 软件 BioFirewww.biofiredx.com
高分辨率熔解分析 2.0BioFirewww.biofiredx.com
LightScanner 引物设计软件BioFirewww.biofiredx.com
载体 NTI 软件Invitrogenwww.invitrogen.com
三卡因
多聚甲醛

参考文献

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  1. Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  2. Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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Zebrafish GenotypingPCR AnalysisHigh resolution MeltDNA ExtractionMelt Curve AnalysisGenotyping ProtocolFluorescent ProbePCR CyclingTemperature NormalizationGenotype Detection

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