聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。
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摘要
摘要
斑马鱼是研究发育、疾病建模和药物筛选的强有力脊椎动物模型系统。近年来已引入多种遗传工具，包括多种诱导突变和建立转基因品系的策略。然而，大规模筛选受到传统基因分型方法的限制，这些方法耗时且劳动密集。本文介绍一种通过PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）来分析斑马鱼基因型的技术。 该方法快速、灵敏、成本低廉，且污染风险较低。 通过PCR结合HRMA进行基因分型可用于胚胎或成年鱼，适用于高通量筛选方案。
引言
斑马鱼（Danio rerio）是一种广泛用于发育研究和疾病建模的脊椎动物模型系统。近年来，已开发出多种针对斑马鱼的转基因和突变技术。 快速转基因技术通常基于Tol2转座子系统1，并结合了多种DNA片段组装的改进型克隆方法2。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已被用于靶向斑马鱼体细胞和生殖细胞中的特定基因位点3,4。这些技术能够高效地产生基因修饰动物，实现高频突变生成和生殖系传递3,4。
尽管取得了这些进展，传统的斑马鱼基因分型技术仍限制了诱变和转基因工具的充分发挥。 聚合酶链式反应（PCR）结合凝胶电泳是检测基因组修饰的常用方法，有时还需联合限制性内切酶消化，但该方法耗时较长，且对小片段插入或缺失的检测灵敏度较低。TaqMan探针检测法初始成本较高，且需要精细的优化。PCR产物测序可能需要数天时间，不适合大规模筛选。 限制性片段长度多态性（RFLP）分析仅能区分影响有限数量限制性内切酶识别位点的单核苷酸多态性（SNP）。
高分辨率熔解分析（HRMA）是一种封闭管式PCR后分析方法，是近年来发展起来的一种快速、灵敏、成本低廉且适用于大规模样本筛查的技术。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性（....
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方案
1. DNA 制备
- 制备DNA裂解缓冲液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、0.3% Tween 20、0.3% NP40。在使用当天，加入新鲜的蛋白酶K，使其终浓度为1 mg/ml12。
- 组织采集：
- 成年鱼尾鳍取样：
- 麻醉鱼类：将鱼放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，等待鳃部运动减缓。
- 将鱼置于5–10层Kimwipe纸巾上，用无菌剃须刀片切割尾鳍一小段，约2–3 mm。
- 迅速将鱼转移至标记好的盛有新鲜水的水族箱中恢复；同时仔细标记水族箱及对应含有尾鳍组织的离心管。每隔一天更换水并喂食。
- 用无菌移液器吸头拾取尾鳍组织，转移至含有100 μl DNA裂解缓冲液的离心管中。
- 丢弃移液器吸头，并将剃须刀片弃入锐器容器中。
- 胚胎尾部取样：
- 将胚胎放入0.004% MS-222（三卡因）溶液中，静置2分钟。
- 在解剖显微镜下用镊子剪取尾部组织片段。
- 将尾部组织放入含有30 μl DNA裂解缓冲液的标记离心管中。
- 迅速将胚胎放入含有100 μl 4%多聚甲醛的离心管中。
- 标记含有胚胎的离心管及其对应的尾部组织管。<....
- 成年鱼尾鳍取样：
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结果
该实验方案可在一天内完成，也可分步在数天内进行（工作流程图见图1）。DNA提取后，进行PCR扩增产物的熔解与分析。扩增产物的熔解温度取决于其大小和GC含量，但起始和终止温度通常设置为50 °C和95 °C较为合适（图2A和图2B）。完成熔解后，对荧光熔解曲线的分析通常需要使用熔解前和熔解后区域作为标准，对不同样本曲线间的荧光差异进行归一化处理（图2C），以提高来自不同样本结果之间的可比性，这些样本的荧光差异可能源于微小的实验波动。用于归一化的每对温度线应相距约1 °C（图2C，箭头所示）。数据结果的分组以两种方式呈现：上方的图表显示熔解曲线轮廓，下方的图表则显示相对于参考样本的减法差值图（图2D）。
高分辨率熔解曲线分析（HRMA）可用于检测突变（图3A和3B）或转基因（图3C）。.......
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讨论
PCR 结合高分辨率熔解曲线分析（HRMA）是一种高效的斑马鱼基因分型技术。该方法具有快速、稳健以及高灵敏度等优点，甚至可检测到单个碱基突变。整个实验流程，从剪取鳍组织到完成熔解曲线分析，可由单人操作并在八小时内完成。此外，该技术适用于高通量筛选，无需使用溴化乙锭，且在所有 PCR 及分析步骤中均采用封闭体系，有助于最大限度减少污染问题。
该技术的关键步骤是PCR扩增子和引物的设计。在高分辨率熔解曲线分析（HRMA）中，PCR产物的典型长度为50-200 bp。较短的扩增子可提高检测灵敏度，非常适合检测单核苷酸变化。如果难以区分密切相关PCR产物的熔解曲线，可在PCR反应中加入一段与SNP互补且在3’端阻断的小寡核苷酸（Lunaprobes；探针）。这些探针通过不对称PCR生成，使用不同浓度的正向和反向引物，并在3’端添加C3阻断剂，以防止探针在后续HRMA PCR中延伸。然后将该探针加入HRMA PCR反应中。 随后在探针存在下进行HRMA，此时不对称探针与PCR产物结合，形成具有不同熔解曲线的探针-靶标双链体，从而可用于区分等位基因。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Blaschke、Grunwald 和 Wittwer 实验室的成员提供的建议和技术支持。本工作由 PCMC 基金会、美国国立卫生研究院（NIH）R01 MH092256 和 DP2 MH100008 项目以及美国出生缺陷基金会研究基金 #1-FY13-425 资助，资助对象为 JLB。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100次反应 LightScanner 预混液 | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| 硬壳PCR 96孔黑白板 | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' 压敏封膜 | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96孔 LightScanner 仪器 | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| 含 Call-IT 2.0 的 LightScanner 软件 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| 高分辨率熔解曲线分析 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner 引物设计软件 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI 软件 | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| 三卡因 | |||
| 多聚甲醛 |
参考文献
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al.
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