原位压极限和骨牙周韧带齿纤维联合的相关性无创成像

摘要

在这项研究中， 在加上微X射线计算机断层摄影术为纤维状关节生物力学原位装载装置使用一个将被讨论。识别与关节生物力学的整体改变的实验读数将包括:1）反动力与位移，在牙槽窝内，即牙齿位移及其装载反动响应，2）三维（3D）空间构型和形态测量， 即几何齿与齿槽插座，和3）中读出1和2的变化是由于在加载轴， 即同心或偏心载荷的变化关系。

摘要

这项研究表明，一种新型的生物力学测试协议。此协议的优点包括在耦合到高分辨率X-射线显微镜原位装载装置使用的，从而使模拟生理负荷和潮湿条件下的内部结构元件的可视化。实验样品将包括完整的骨牙周膜（PDL）齿纤维连接。结果将说明该协议的三个重要特点，因为它们可以应用到器官水平的生物力学:1）反动力与位移:位移牙牙槽窝内，其装载，2），三维（3D）空间配置反动响应和形态测量:用肺泡插座牙齿的几何关系，以及3）在读出器1和2中，由于在加载轴的变化， 即从同心偏心载荷的变化。提出的协议的有效性可以通过机械耦合TE进行评估蜇读数为3D形态测量和关节的生物力学整体。此外，这种技术将强调需要平衡的实验条件下，前获取纤维连接的断层图像特别反动负载。应当注意，该协议被限制为检测离体条件下的试样，并且使用造影剂进行可视化的软组织机械响应可能导致对组织和器官水平的生物力学错误的结论。

引言

几个实验方法继续被用来研究diarthrodial和纤维状关节生物力学。具体到牙齿器官生物力学的方法包括使用应变计^1-3，光弹性方法^4，5，云纹干涉^6，7，电子散斑干涉^8，和数字图像相关^{（DIC）9-14。}在这项研究中，创新的方法包括非侵入性的成像使用的X射线暴露的纤维接头的内部结构（矿化组织和它们的接口由较软的区域，和接口组织如韧带）在负载相当于在体内条件。耦合到微透视显微镜原位装载装置将被使用。负载时间和负载 - 位移曲线将被收集感兴趣的新鲜收获的大鼠半侧下颌骨内装载的摩尔。该米在本研究中提出的方法的AIN的目标是通过在比较条件下，以强调牙骨的三维形貌的影响:1）无负载时加载，并且当2）同心和偏心加载。省去了切标本，并在潮湿条件下的整体完好的器官进行实验将允许三维应力状态的最大保护。这将打开调查，在各种载荷情况下理解复杂的动态过程的一个新领域。

在这项研究中，方法为只SD大鼠一个完整的纤维关节内测试PDL生物力学，被视为最佳的生物工程模型系统联合进行详细说明。实验将包括以突出关节的三个重要特点，因为它们涉及到器官水平的生物力学仿真水合条件下咀嚼负荷。这三点将包括:1）反动力与位移:肺泡插座内齿的位移和其装载反动响应，2）的三维（3D）空间构型和形态测量:用肺泡插座牙齿的几何关系，以及3）在读出器1和2中，由于在一个变化的变化加载轴， 即从同心偏心负荷。所提出的技术的三个基本读数可以应用于调查接头的脊椎动物中任一所述自适应性质变化引起的功能性要求，和/或疾病。可用于改变上述读数，特别是在不同的加载速率反动负载之间的相关性与位移，并导致反动的加载时间和载荷 - 位移曲线，突出联合生物力学整体变化。提出的协议的有效性可以通过耦合力学测试读数为3D形态测量和关节的生物力学整体评估。

方案

动物住房和安乐死:在本演示中使用的所有动物均按照该机构动物护理和使用委员会（IACUC）和美国国立卫生研究院（NIH）的指引，安置无病原体条件下。

提供动物与标准硬颗粒大鼠饲料和水的随机应变 。通过二氧化碳窒息，双侧开胸的两步法按照UCSF的标准协议安乐死动物经IACUC。 24小时动物献祭的范围内进行生物力学测试，以避免组织退化。

1。制备及大鼠下颌骨或上颌骨的解剖

1. 通过轻轻地切割膜组织和肌肉组织的附件，同时保持整个下颌骨，包括冠突和髁过程（ 图^1）15除去大鼠下颌骨。
2. 独立hemimandibles车efully切割下颌联合纤维组织带有手术刀。
   注:冠状动脉及髁流程，以及下颌骨升支（ 图1）应该被删除，如果他们身体挡住^第二磨牙的生物力学测试。
3. 切门牙不暴露牙髓腔不妨碍加载磨牙。

2。 原位压极限试样制备的（图2）

1. 通过使用比实验标本显著较硬之前加载它在原位装载装置（ 图2A）的材料固定在一个钢存根试样。
   注:聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是用于固定在这项研究中与过量的试样，如果有的话，用牙科探针除去。
2. 配合使用在两个直边的原子力显微镜的金属试样圆盘息平行的摩尔数的咬合面平面（ 即近远中和颊舌）。
3. 建立与周边磨牙钝刀一个低谷。
   注意:这个空间应该作为一个"护城河"包含多余的液体，并在原位负载维持组织水化。
4. 制备在牙齿表面使用牙科用复合建立为同心（ 图2B）或偏心轮（ 图2C）加载。蚀刻所关心的牙齿表面以15秒的牙合面的35％磷酸凝胶。
5. 用去离子水彻底冲洗，蚀刻剂和使用空气/水注射器或压缩空气罐干燥的表面上。随着探险家，分布一滴粘接剂成公开尖在薄薄的一层。固化复合材料牙科光固化机。
   注:应该没有直接的光从灯泡进行所有涉及复合材料的步骤。这样的条件下会不希望地促进聚合过程中，并且不需经过ð防止复合材料的妥善安置。房间里的灯是可以接受的。
6. 从邻牙去除多余的粘接剂用细手术刀或刀片。
7. 把可流动的牙科用复合材料的表面上的表面的制备方法以下，并用牙科探针铺到感兴趣的摩尔数的凹槽。
8. 暴露复合牙科光固化机，持续30秒。
9. 用牙科用复合树脂成形为约3-4毫米的咬合堆积，从感兴趣的摩尔数和光固化30秒的咬合平面。
10. 降低复合堆积的顶部表面平行的平面通过使用直边和一个高速手持件，以使一致的装载方案在所有标本。
    注意:在生物力学测试，其他标本应存放在三-磷酸盐缓冲溶液（TBS）与50毫克/毫升的青霉素，链霉素和^15。

3。加载装置和漂移刚度，材料属性辨能力， 原位纤维联合的装载

1. 使试样与在加载阶段的砧座的复合材料形成，并且测试为均匀的载荷， 如图2B所示 。
2. 放置在复合材料的表面上形成的咬合纸随后装入试样，以一个有限的负载，以检查同心或偏心载荷（ 图2B和2C）。
3. 周围放置试样TBS浸泡过的Kimwipe，以确保样品水化。使周围的样品槽和用TBS填充它来保持成像过程中的水分的器官。
4. 输入峰值负载和位移速率到德夯软件来压缩的摩尔到下面的单侧的下颚骨的固定化所需的峰值负荷位移速度。
   注意:典型的读数应该包括反动载荷作为材料被压缩，随着时间的推移（负荷传感器灵敏度= 0.1N）。从负荷-时间和位移-时间，用于压缩材料的负荷-位移曲线应获得^16-18。使用从加载周期所收集的数据，关节的各种性能，也可测定。关节的刚度应采取的直线部分的载荷与位移曲线¹⁹的加载阶段（约最后30个数据的％）的斜率来计算。

4。染色软组织中，PDL，用磷钨酸（PTA）

注意:为了提高X射线衰减的对比中，PDL应染色，用5％的PTA溶液^20。

1. 回填PTA染色溶液倒入一个干净的1.8毫升玻璃安瓿，并把装安瓿到注射器中。
2. 注入溶液缓慢（5分钟/卡普耳）到相邻牙齿的PDL-空间，以防止周围的兴趣磨牙牙周组织结构损伤。
   注:以上步骤B应该要ë重复，直到溶液约5全carpules（9毫升）中被注入并允许流入周围的组织。该prepped标本也可以在剩余的PTA溶液（8小时）浸泡过夜。

5。推荐μ-XCT扫描设置

进行M-XCT具有下列扫描设置:

物镜放大倍数	4X，10X
	1,800的图像
X射线管电压	75 kVp的（50 kVp的对PTA染色样品）
	8 W
曝光时间	〜8-25秒*
	〜4微米（4X物镜），〜2微米（10X物镜）**

*曝光时间可以根据几何形状和试样和X射线管的画外音的光密度变化ltage。
*基于源，样品和检测器的结构的实际像素分辨率将略有不同。

结果

的装载装置"齿隙"恒定负荷下，"推回"，刚度，和系统漂移估计

差:循环加载和卸载部分之间，存在3秒的暂停期间，反向齿轮电机内卸真正开始前， 即作为试样拉离顶下颚（ 图3）。这一时期被称为系统，它代表一个时间段，当系统试图从闭到开的夹爪切换的反弹。但应注意的是，所有的负载周期都将包含一个类似的齿隙响应无论样品或负载条件的（ 图4）。一个正常的负载与使用刚性体获得的时间曲线示于图3A和3B突出的装载，卸载和侧隙区在两个不同的升6 N和16 N。口服降糖药正常负荷与位移曲线突出了相应的三个部分如图3C。

推回:而同样3秒的时间框架，反动的响应中，因此间隙区域的形状可以根据试样改变发生的所有反弹周期。通过使用一个刚性体（ 图3）...

讨论

在建立这个协议的第一个步骤涉及评估的装载架的使用刚性体的刚性。根据结果​​，刚度是显著更高使得能够使用的装载装置的标本与显著较低的硬度值进一步测试。第二步强调了仪器的使用两个阶段的装载 - 卸载曲线通过使用刚性体，不同的交联密度的PDMS材料和纤维连接生成区分不同硬度值的能力。从在间隙相的加载阶段和回送的刚度被用来确定该材料的装载和材料的回收的阻力以下卸载（ 图3和4）。在第三步和第四步的协议是相互关联的变化，从装载装置获得的原位成像与T进行荷载-位移曲线他使用的X射线（ 图5）。这包括加载和关节分别获得X线断层在空载和负载，同心和偏心条件下。该协议表明，通过改变在PDL-压缩级别加载轴的差异可以被突出显示（ 图6和图7）。在这个讨论中，我们将首先突出仪器的功能和应充分了解和前骨PDL齿复杂的生物力学测试遇到的挑战。

实验装置的挑战

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bard Parker Blade	BD	MEDC-001054
AFM 金属盘	Ted Pella	16218
聚甲基丙烯酸甲酯	GC America	N/A
Uni-Etch	Bisco	E5502EBM
Optibond Solo Plus	Kerr Corp	N/A
Filtek Flow	3M	N/A
Hurculite Ultra	Kerr	34346
Tris 缓冲液	Mediatech Inc.	N/A
铰接纸	Parkell Inc.
磷钨酸	Sigma Aldrich	HT152