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方法文章

in situ 骨-牙周膜-牙齿纤维关节的压缩加载与相关无创成像

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DOI：

10.3791/51147

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2014年3月7日

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1Division of Biomaterials and Bioengineering, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California San Francisco, 2Department of Radiology and Biomedical Imaging, University of California San Francisco, 3Xradia Inc.

本文内容

摘要

在本研究中，使用了 原位 将讨论用于纤维关节生物力学的加载装置与微米级X射线计算机断层扫描技术的结合应用。可通过整体关节生物力学变化识别的实验读数包括：1）反作用力与位移的关系， 即 牙槽窝内牙齿的移位及其对载荷的反应性响应，2）三维（3D）空间构型与形态测量学 即 牙齿与牙槽窝之间的几何关系，以及加载轴线改变导致的读数1和读数2的变化 即 向心或离心载荷。

摘要

本研究展示了一种新颖的生物力学测试方案。该方案的优点包括使用一种 原位 加载装置与高分辨率X射线显微镜耦合，从而能够在模拟生理载荷和湿润条件下可视化观察内部结构元件。实验样本将包括完整的骨-牙周膜（PDL）-牙纤维关节。结果将展示该方案在器官水平生物力学研究中的三个重要特征：1）反作用力与位移关系：牙齿在牙槽窝内的位移及其对加载的反作用响应；2）三维（3D）空间构型与形态测量：牙齿与牙槽窝之间的几何关系；3）加载轴改变时特征1和2的读数变化。 即 从向心载荷到离心载荷。所提出方案的有效性将通过结合机械测试数据、三维形态测量学以及关节整体生物力学进行评估。此外，该技术将强调在获取纤维性关节的断层图像前，平衡实验条件（特别是反作用力载荷）的重要性。需要注意的是，所提出的方案仅限于对样本进行以下条件的测试 离体 条件，且使用对比剂来观察软组织力学响应可能导致对组织和器官层面生物力学的错误结论。

引言

目前仍采用多种实验方法来研究可动关节和纤维性关节的生物力学特性。针对牙器官生物力学的特有方法包括应变片的使用1-3，光弹性方法4,5，莫尔干涉测量法6,7，电子散斑干涉测量法8，以及数字图像相关技术（DIC）9-14本研究中的创新方法包括采用X射线进行无创成像，以揭示纤维关节内部结构（矿化组织及其包含较软区域的界面，以及韧带等相邻组织）在相当于 体内 条件。一个 原位 将使用与微X射线显微镜耦合的加载装置，在对新鲜获取的大鼠半下颌骨中目标磨牙施加载荷时，采集载荷-时间曲线和载荷-位移曲线。本研究所提出方法的主要目标是通过比较以下条件下的情况，突出牙齿-骨组织三维形态的影响：1）无载荷与加载状态；2）同心加载与偏心加载状态。该方法无需切割样本，可在湿润条件下对完整器官进行实验，从而最大程度地保留三维应力状态，为研究该复杂结构在不同加载条件下的动态过程开辟新的研究领域。

本研究将详细介绍在完整纤维关节内测试 Sprague Dawley 大鼠牙周膜生物力学的方法，该关节被视为理想的生物工程模型系统。实验将在水合条件下模拟咀嚼载荷，以突出体现该关节在器官水平生物力学方面的三个重要特征：1）反作用力与位移关系：牙齿在牙槽窝内的位移及其对加载的反作用响应；2）三维（3D）空间构型与形态测量学：牙齿与牙槽窝之间的几何关系；3）加载轴改变时上述第1和第2项检测指标的变化。 即 从向心载荷到离心载荷。所提出技术的三个基本读数可用于研究脊椎动物关节的适应性特征，无论这种适应性是源于功能需求的变化和/或疾病所致。上述读数的变化，特别是反作用载荷与位移之间的相关性，以及在不同加载速率下获得的反作用载荷-时间曲线和载荷-位移曲线，可用于揭示关节生物力学的整体变化。所提出方案的有效性将通过将力学测试读数与关节的三维形态测量学及整体生物力学特性相结合进行评估。

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方案

动物饲养与安乐死：本演示中使用的所有动物均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）及美国国立卫生研究院（NIH）的指南，在无病原体条件下饲养。

为动物提供标准硬质颗粒大鼠饲料，并可自由饮水。ad lib。采用二氧化碳窒息结合双侧开胸法对动物实施安乐死，操作步骤遵循经IACUC批准的加州大学旧金山分校（UCSF）标准方案。在动物处死后24小时内进行生物力学测试，以避免组织降解。

1. 大鼠下颌骨或上颌骨的制备与解剖

  1. 用镊子轻轻切断膜性组织和肌肉组织附着物，完整摘除大鼠下颌骨，保留冠突和髁突图1)15.
  2. 用手术刀片小心地切割下颌联合处的纤维组织，将两侧半下颌骨分离。
    注意：下颌骨的冠突、髁突及下颌支（图1）若在物理上妨碍对2的生物力学测试，则应将其移除nd 摩尔
  3. 切割切牙时避免暴露牙髓腔，以免影响磨牙的加载。

2. 样品制备用于 原位 压缩载荷（图2）

  1. 使用刚度显著高于实验样品的材料，将样品固定在钢制样品台上，然后再将其装入仪器中 原位 加样装置（图2A).
    注意：本研究中使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）固定样本，如有过量，使用牙科探针去除。
  2. 将目标磨牙的咬合面在两个平面上均与原子力显微镜（AFM）金属样品盘的表面平行对齐，使用直边工具进行校准（即 近远中和颊舌向
  3. 用钝器在磨牙周围制作一条沟槽。
    注意：此区域应作为“护城河”以容纳多余液体，并在组织水合过程中保持湿润 原位 加载中。
  4. 为同心性预备牙体表面图2B）或偏心（图 2C) 使用牙科复合树脂进行充填。用35%磷酸凝胶酸蚀目标牙齿的咬合面表面15秒。
  5. 用去离子水彻底冲洗酸蚀剂，并使用气/水枪或压缩空气罐干燥表面。用探针将一滴粘接剂均匀涂布于开放的牙尖窝洞内，形成一层薄层。使用牙科光固化灯固化复合树脂。
    注意：所有涉及复合树脂的操作步骤均应在无灯光直射的条件下进行。灯光直射会非预期地加速聚合过程，可能导致复合树脂无法正确就位。室内照明条件可以接受。
  6. 用精细的解剖刀或刀片去除邻牙上多余的粘接剂。
  7. 在完成表面处理后，将可流动牙科复合树脂置于表面，并使用牙科探针将其涂布至目标磨牙的窝沟内。
  8. 将复合材料暴露于牙科固化灯下照射30秒。
  9. 使用牙科树脂复合材料，从目标磨牙的咬合面开始，塑形一个约3-4 mm的咬合面加高结构，并光照固化30秒。
  10. 使用直边工具和高速手机将复合材料堆塑体的顶部磨平，使其表面平整且相互平行，以确保所有样本的加载条件一致。
    注意：在进行生物力学测试期间，其他样本应保存在含有50 mg/ml青霉素和链霉素的三羟甲基氨基甲烷磷酸盐缓冲液（TBS）中。15.

3. 加载装置的漂移与刚度、材料特性分辨能力 原位 纤维关节的加载

  1. 将带有复合材料堆塑的标本固定在加载台的砧座上，并按照图2B所示测试加载是否均匀。
  2. 在复合材料表面放置咬合纸，随后将标本加载至特定载荷，以检查是否存在同心或偏心加载（图2B和 2C）。
  3. 用TBS浸湿的Kimwipe纸巾包裹标本，以确保标本保持水合状态。在标本周围制作一个凹槽并注入TBS，以在成像过程中维持组织的水合环境。
  4. 在Deben软件中输入峰值载荷和位移速率，以便在下颌半侧骨固定后，以设定的位移速率将磨牙压缩至目标峰值载荷。
    注意：典型的输出结果应包括材料随时间压缩过程中产生的反作用力（载荷传感器灵敏度 = 0.1 N）。根据载荷-时间曲线和位移-时间曲线，应获得压缩材料的载荷-位移曲线16-18。利用加载循环中采集的数据，还可确定关节的多种力学特性。关节刚度应通过载荷-位移曲线加载阶段线性部分（约最后30%的数据）的斜率计算得出19。

4. 使用磷钨酸（PTA）对软组织及牙周膜进行染色

注意：为了增强X射线衰减对比度，应使用5% PTA溶液对PDL进行染色20。

  1. 将PTA染色液回填至一支洁净的1.8 ml玻璃卡式瓶中，并将装有染色液的卡式瓶放入注射器内。
  2. 缓慢注射溶液（每卡式瓶约5分钟）至邻牙的牙周膜间隙，以防止对目标磨牙周围牙周组织造成结构损伤。
    注意：应重复上述步骤，直至注射约5整支卡式瓶（9 ml）溶液，并使其流入周围组织。制备好的标本也可在剩余的PTA溶液中浸泡过夜（8小时）。

5. 推荐的 μ-XCT 扫描设置

使用以下扫描参数进行显微X射线计算机断层扫描（m-XCT）：

物镜放大倍数4X, 10X
1,800 张图像
X 射线管电压75 kVp（PTA 染色样品为 50 kVp）
8 W
曝光时间~8–25 秒*
~4 μm（4X 物镜），~2 μm（10X 物镜）**

* 曝光时间可能因样本的几何形状、光学密度以及X射线管电压而有所不同。
** 实际像素分辨率将根据光源、样本和探测器的配置略有差异。

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结果

在恒定负载下估算加载装置的“回程间隙”、“推移回弹”、刚度及系统漂移

回程间隙：在加载和卸载周期之间，存在一个3秒的暂停，此时电机内部的齿轮发生反转，之后才开始真正的卸载过程，即试样开始从上夹具脱离（图3）。这一阶段被称为系统中的回程间隙，代表了系统试图将夹具从闭合状态切换为开启状态的一段时间。需要注意的是，无论试样类型或加载条件如何，所有载荷循环都会表现出类似的回程间隙响应（图4）。使用刚性体获得的典型载荷-时间曲线如图3A和3B所示，分别在6 N和16 N两种不同载荷下突出了加载、卸载及回程间隙区域。载荷-位移曲线中对应这三个阶段的典型表现如图3C所示。

反冲： 尽管所有反冲阶段均发生在相同的 3 秒时间范围内，但反作用力的响应以及反冲区...

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讨论

建立本方案的第一步是通过使用刚性体评估加载框架的刚度。根据实验结果，该框架的刚度显著较高，因此可将其用于进一步测试刚度值显著较低的样品。第二步通过使用刚性体、不同交联密度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料以及纤维性关节所产生的加载-卸载曲线的两个阶段，突出展示了仪器区分不同刚度值的能力。加载阶段的刚度和回程阶段的反推力被用于识别材料对加载的抵抗能力以及卸载后材料的恢复性能。图示 3 和 4）。该方案的第三步和第四步是将加载装置获得的载荷-位移曲线的变化与 原位 使用X射线进行的成像图 5）。这包括对关节施加负荷，并分别在同心和偏心条件下，于无负荷和有负荷状态下获取断层图像。该方案表明，通过改变加载轴，可以凸显牙周膜（PDL）受压程度的差异。图示 6 和 7）。在本讨论中，我们将首先强调在对骨-牙周膜-牙复合体进行生物力学测试之前，应充分理解并满足的仪器特性与挑战。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。 

致谢

作者感谢以下资助支持：NIH/NIDCR R00DE018212（SPH）、NIH/NIDCR-R01DE022032（SPH）、NIH/NIDCR T32 DE07306（AJ, JDL）、NIH/NCRR S10RR026645（SPH）以及加州大学旧金山分校预防与修复牙科科学系和口腔颅面科学系。  此外，作者感谢Xradia研究生奖学金（AJ）以及位于加利福尼亚州普莱森顿的Xradia公司。 

作者感谢加州大学旧金山分校（UCSF）的 Kathryn Grandfield 博士在数据后期处理方面的协助；感谢以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所的 Stephen Weiner 博士和 Gili Naveh 博士；感谢以色列耶路撒冷希伯来大学的 Ron Shahar 博士，他们就本研究相关问题提供了富有见地的讨论 原位 加样装置  作者还要感谢加州大学旧金山分校（UCSF）生物材料与生物工程MicroCT成像设施中心提供Micro XCT设备使用支持，以及 原位 加样装置

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bard Parker 刀片BDMEDC-001054
AFM 金属圆盘Ted Pella16218
聚甲基丙烯酸甲酯 GC AmericaN/A
Uni-EtchBiscoE5502EBM
Optibond Solo PlusKerr CorpN/A
Filtek Flow3MN/A
Hurculite UltraKerr34346
Tris 缓冲液Mediatech Inc.N/A
咬合纸Parkell Inc.
磷钨酸Sigma AldrichHT152

参考文献

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