方法文章

慢性EAE小鼠模型中神经干细胞/祖细胞的全身注射

DOI：

10.3791/51154

⸱

2014年4月15日

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1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

本文内容

摘要

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神经干细胞/祖细胞（NPCs）的移植在神经再生医学领域具有广阔前景。系统性递送NPCs已成为一种高效、低侵入性的治疗方案，可将干细胞成功输送至患有实验性慢性中枢神经系统炎症损伤的啮齿类动物和非人灵长类动物的脑和脊髓中。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经干细胞/前体细胞（NPCs）是用于移植治疗策略的一种前景广阔的干细胞来源，旨在实现再生神经学中的脑修复或功能重建。这一方向源于大量实验证据，表明在多种神经系统疾病的临床前模型中，通过局部或系统性移植NPCs可实现脑组织的修复。

这些实验数据表明，细胞递送途径是脑部疾病修复性干细胞治疗面临的主要障碍之一，亟需进行评估。对于表现为孤立且可触及的脑部病灶的疾病，如脊髓损伤和帕金森病，脑实质内干细胞移植是一种合理的策略。然而，这一原则在具有多灶性、炎性以及在时间和空间上广泛播散特征的疾病中应用效果较差，包括多发性硬化症（MS）。因此，通过系统性递送神经前体细胞（NPC）靶向脑组织，已成为一种微创且具有治疗效力的方法，可用于将细胞递送至患有实验性慢性中枢神经系统（CNS）炎症损伤的啮齿类动物和非人灵长类动物的脑和脊髓中。

这种替代性的细胞递送方法依赖于NPC的趋向性，特别是其固有的能力：（i）感知微环境 通过 功能性细胞黏附分子以及炎症性细胞因子和趋化因子受体；(ii) 在静脉内注射后穿过渗漏的解剖屏障i.v）或脑室内（脑室内) 注射；(iii) 在脑和脊髓炎性损伤的多个血管周围部位积聚；以及i.v.对不同的宿主靶细胞产生显著的组织营养和免疫调节作用 体内.

本文介绍了我们在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中建立的同基因型神经前体细胞（NPCs）经静脉（i.v.）和颅内脑室（i.c.v..）递送方法，该模型用于模拟慢性中枢神经系统炎症性脱髓鞘。我们预期，系统性干细胞递送将成为再生神经病学中靶向炎症脑组织的一种有效技术。

引言

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来自体内研究的强有力证据表明，在中枢神经系统疾病动物模型中移植体神经干细胞/前体细胞（NPCs）具有显著的治疗效果1-8。然而，在将这些实验结果转化为临床应用之前，必须仔细考虑与干细胞向宿主体内递送相关的若干问题。对于多灶性、慢性的炎症性脑病的（非造血性）修复性干细胞治疗而言，一个尤为重大的挑战是确定NPC注射的最佳途径。要确定干细胞递送的最佳方案，必须充分理解目标疾病的病理生理学特征（局灶性或弥散性；原发性炎症性或原发性变性），并对递送技术的可行性及相关风险进行审慎分析。

尽管局灶性（例如 进入神经系统实质）干细胞移植是治疗以局部损伤为特征的中枢神经系统（CNS）疾病（例如 帕金森病和亨廷顿病、脑与脊髓创伤性损伤以及脑卒中）的一种合理策略，但在多发性硬化症（MS）等疾病中，由于中枢神经系统损伤具有多灶性、慢性且空间上广泛播散的特点，并随时间逐渐累积，这种相同的方法可能在实际操作中并不可行。在此类情况下，将细胞移植靶向各个病灶还受到移植的神经前体细胞（NPCs）在中枢神经系统实质内长距离迁移能力有限的限制，因此迫切需要探索其他更合适的、侵入性更小的NPC移植途径以实现对中枢神经系统的有效靶向治疗。

NPCs靶向颅内肿瘤的观察结果展现出巨大前景例如. 胶质瘤）在小鼠体内经血管外周注射后可在中枢神经系统外形成肿瘤9。继这一开创性研究....

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方案

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所有涉及动物的操作均依照英国政府内政部根据《1986年动物（科学程序）法案》批准的实验动物护理原则进行（项目许可编号 PPL No. 80/2457，授予 SP）。

1. 从小鼠成年脑室下区（SVZ）分离体细胞神经干细胞/前体细胞（NPCs）

  1. 解剖器械和培养基的准备
    注意：这两种溶液必须在解剖器械准备前1-2小时配制，并在使用前至少20-30分钟于37 ºC预热（有助于稀释木瓜蛋白酶并优化酶活性）。
    1. 高压灭菌一把直头尖头剪刀、一把小型手术剪刀和两把小型带齿弯镊。
    2. “消化”溶液：准备两个独立的50 ml离心管，分别加入：
      溶液1：25 ml Earle's 平衡盐溶液（EBSS）＋10 mg 乙二胺四乙酸（EDTA）＋10 mg L-半胱氨酸；以及
      溶液#2：25 ml EBSS + 50 mg 木瓜蛋白酶。
    3. 配制“完全生长培养基”（CGM）：在完全小鼠基础培养基中加入小鼠增殖添加剂、肝素（0.002%）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；10 ng/ml）、表皮生长因子（EGF；20 ng/ml）以及抗生素（青霉素/链霉素）。
  2. 脑解剖
    注意：由于颞骨边缘锋利，去除时容易损伤组织。为避免此问题，需用镊子牢固夹住骨骼，用力拔出，直至整块骨骼完全移....

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结果

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NPC的分离与鉴定
SVZ 解剖取自 6-8 周龄 C57Bl/6 小鼠的混合样本（每组 n=5-7 只小鼠），通过机械和酶解方法进行组织解离（图1A）。在CGM中培养数天后，开始形成游离的神经球（图1A 和 1B）。原代细胞球每4-5天收集一次，并进行机械传代。传代时，测定活细胞与死细胞数量，绘制累积细胞数量以生成生长曲线（图1C）。这可以指示其增殖速率，从而提供一个用于评估神经前体细胞（NPC）制备整体稳定性的间接参数。当以神经球形式增殖时，NPCs 表达有丝分裂活性标志物（磷酸化组蛋白 H3，PHH3；5 μg/ml）以及未分化神经细胞的标志物（例如 Nestin) (图2A）未分化的NPCs在移植后若要对EAE具有治疗功效，必须表达包括CD44（5 μg/ml）和VLA-4的α4亚基（10 μg/ml）在内的细胞表面黏附分子图2F）。在适当的分化条件下培养时，NPCs 会表达出三种神经谱系典型的标志物，.......

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讨论

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基于体细胞干细胞的疗法正成为治疗多发性硬化症（MS）等慢性炎症性中枢神经系统疾病最有前景的策略之一11。尽管维持其治疗效果的机制仍需进一步阐明，但神经前体细胞（NPC）移植在多种神经退行性疾病实验模型中已展现出显著作用，这引发了一种颇具争议的观点：干细胞疗法可能很快将应用于人体研究。然而，在设想这些创新疗法的潜在临床应用之前，我们必须面对一些关键问题并解答若干尚未明确的疑问，例如确定最适合移植的干细胞来源（自体移植 vs 异体移植，多能性 vs 多潜能性）以及最佳给药途径。

神经退行性疾病的病理生理学各不相同，有些疾病具有空间局限性（例如 脊髓损伤、脑卒中），而另一些则表现为时空上的播散（例如 多发性硬化症）。因此，对局灶性病变而言，局部注射（干细胞）可能是一种合适的治疗方法；但对于存在多灶性脑损伤的弥漫性病变，这种方法可能效果不足，甚至完全不可行，这构成了需要克服的额外挑战。

大量一致的证据表明，静脉输注可能是一种有效且侵入性较低的.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢 Jayden Smith 对手稿的批判性审阅和校对。本工作获得了美国国家多发性硬化症协会（NMSS，部分资助项目编号 RG-4001-A1）、意大利多发性硬化症协会（AISM，资助项目编号 2010/R/31）、意大利卫生部（GR08-7）、Wings for Life、拉古萨农业人民银行（BAPR）、欧洲研究理事会（ERC）在 ERC-2010-StG 资助协议编号 260511-SEM_SEM 下的支持，以及欧洲共同体（EC）第七框架计划（FP7/2007-2013）在资助协议编号 n° 280772-iONE 下的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养
EBSSSigmaE2888
L-半胱氨酸Sigma AldrichC7352
木瓜蛋白酶Worthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
小鼠 NeuroCult 基础培养基Stem Cell Technologies05700
NeuroCult 增殖添加剂Stem Cell Technologies05701
肝素SigmaH3393
碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B-1000
表皮生长因子PeprotechAF-100-15-1000
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Invitrogen1514012
Matrigel（包被溶液）BD Biosciences354230
NeuroCult® 分化试剂盒（小鼠）Stem Cell Technologies05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（10倍浓缩）PAA LaboratoriesH15-011
Myco tracePAA LaboratoriesQ052-020
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650
免疫荧光
正常山羊血清PAA LaboratoriesB11-035
聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚Sigma AldrichT8787
小鼠抗 Nestin 抗体Abcamab11306
兔抗 GFAP 抗体DAKO203344
小鼠抗组蛋白 H3（磷酸化 S10） Abcamab14955
兔抗 MAP-2 抗体Abcamab32454
大鼠抗 MBP 抗体AbD SEROTECMCA409S
抗 O4 抗体，克隆 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
封片液DAKOS3023
EAE
不完全弗氏佐剂Sigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35–55) Espikem
百日咳毒素List Biological Laboratories181
组织处理
直头虹膜剪Fine Sciences Tools14060-09
钝头/弯头镊子Fine Sciences Tools11080-02
脑组织切片器Zivic InstrumentsBSMAS005-1
手术刀片Swann-Morton324
P200、P1000 移液器
氯胺酮（Vetalar）Boehringer Ingelheim01LC0030
赛拉嗪（Rompun）Bayer32371
立体定位仪KOPFModel 900
Hamilton 注射器Hamilton7762-04
多聚甲醛（PFA）Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒Vector LaboratoriesPK-6100

参考文献

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  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al.

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重印与许可

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