本论文描述了一种使用改良沉淀法从人尿液中分离外泌体的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
多年来，鉴定可在尿液和血浆中实现肾脏疾病早期检测的生物标志物一直是一个备受关注的研究领域。尿液外泌体囊泡在正常情况下由肾单位各节段的细胞释放进入尿液，大小为40-100 nm，可能含有代表其来源细胞类型的蛋白质、mRNA和microRNA。在肾功能障碍或损伤条件下，外泌体可能含有这些成分比例的改变，这些改变可作为疾病的生物标志物。目前已有多种可用于分离尿液外泌体的方法，我们此前已对这些方法进行了实验性比较，包括三种基于超速离心的方法、一种使用纳米膜超滤浓缩装置的方法、一种使用商用沉淀试剂的方法，以及一种在本实验室开发的基于ExoQuick试剂的改良沉淀技术。我们发现，改良后的沉淀法能获得最高的外泌体颗粒、miRNA和mRNA产量，因此适用于后续RNA谱分析所需的外泌体分离。我们得出结论：这种改良的外泌体沉淀方法为从尿液中分离外泌体提供了一种快速、可扩展且高效的方法。在本报告中，我们描述了使用ExoQuick试剂从人尿液中分离外泌体的改良沉淀技术。
引言
尿液外泌体是多泡体（MVB）来源的直径约100 nm的小型内体囊泡，在正常和病理条件下，尿液空间中所有细胞类型（包括肾小球足细胞、肾小管上皮细胞以及尿路引流系统内衬细胞）均可释放此类外泌体，且其富含miRNA1-2。许多研究人员已在健康个体以及患有肾脏和/或系统性疾病个体的尿液外泌体中检测到不同的蛋白质3-5。外泌体可通过多种方法分离，例如两步差速超速离心法（使用或不使用蔗糖）6-7、纳米膜过滤联合超速离心法8-9，或沉淀法10-11。我们近期开发了一种简单、快速、可扩展且高效的尿液外泌体分离方法，并可用于检测miRNA和蛋白质生物标志物11。尽管生物标志物可在多种不同的生物液体中检测到，但对于肾脏及泌尿道疾病患者而言，尿液是最为便捷的样本来源，因其可相对无创地大量获取。
尽管已有多种方法可用于分离尿液外泌体6-11，但最常用的方法依赖于在30%蔗糖垫上的差速超速离心法。虽然该方法效率较高，且所获得的外泌体质量良好，但该技术本身需要熟练的操作人员，且耗时较长，需进行多次超速离心步骤。其他方法，如过滤法和沉淀法，也已被开发用于外泌体的分离，其中包括一种使用专有沉淀试剂的方法（即，ExoQuick-TC：System Biosciences；Mountain View, CA）。尽管使用该试剂进行沉淀操作快速且....
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方案
注意：使用改良沉淀法分离尿液外泌体的步骤如图1所示。初始步骤通过离心去除较大的死亡细胞和细胞碎片。从后续每一步收集的上清液中最终获得的沉淀物即为外泌体，将其溶解于分离溶液中，用于进一步提取蛋白质、RNA和DNA。
1. 尿液采集
- 在收集尿液之前，根据制造商的说明配制蛋白酶抑制剂混合液，并将3.125 ml该混合液加入一个空的无菌容器中。然后可将含有蛋白酶抑制剂混合液的试管分发给志愿者用于尿液收集。
注意：添加蛋白酶抑制剂的目的是尽量减少尿液样本中蛋白质的降解。尽管我们特别使用了Sigma公司的蛋白酶抑制剂混合液，但也可替换为其他市售的蛋白酶抑制剂。 - 收集约10 ml的首次排尿尿液。收集后应立即处理尿液，不得储存或冷藏。采用改良的沉淀法平行分离尿液外泌体；其中一份用于DNA、总RNA和蛋白质的提取，另一份用于尿液外泌体颗粒的定量。
注意：可通过在4 °C下储存来收集24小时尿液样本用于外泌体分离。
2. 去除细胞碎片和Tamm-Horsfall蛋白（THP）
- 将尿液样本转移至15 ml离心管中。取10 ml尿液在37 °C下以17,000 × g离心10分钟，以去除细胞及细胞碎片（图1）。
- 使用移液器将上清液转移至新管中用于后续....
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结果
尿液外泌体携带由肾小管上皮细胞分泌的蛋白质、miRNA 和 mRNA 生物标志物。分离和检测这些外泌体可能为糖尿病肾病等肾脏疾病的早期诊断提供有用的工具。目前已有多种方法可用于从人类受试者收集的尿液样本中分离外泌体。我们此前比较了六种尿液外泌体分离方法，并分析了所得的蛋白质、mRNA 和 miRNA 水平11。本文旨在详细描述我们开发的一种经改进的沉淀法，用于高效分离尿液外泌体。
图 1 描述了采用改良沉淀法分离尿液外泌体过程中各步骤的示意图流程图。 所得两份外泌体沉淀中的一份用于CD9检测，使用CD9 ELISA试剂盒进行测定，从而获得外泌体颗粒的相对.......
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讨论
大多数从尿液中沉淀外泌体的方法均未解决Tamm-Horsfall蛋白（THP）形成的聚合物网络的去除问题。该蛋白在尿液中含量较高，可能在初始低速离心过程中捕获外泌体。在我们改进的方法中，于外泌体沉淀前使用DTT降低THP含量。如图所示 图2在未处理的尿液和沉淀物中观察到较高含量的THP，而最终上清液和外泌体沉淀物中均未检测到THP，表明该蛋白已被去除。对沉淀物中的蛋白进行定量显示，产量高出六倍；通过CD9 ELISA对沉淀物进行定量分析，结果显示每毫升尿液中外泌体的产量比未经改良的沉淀法高出五倍（结果未显示）。11）。生物标志物Alix6 和 TSG1018 在外泌体沉淀中检测到了这些蛋白质；使用未修饰的沉淀方法时，我们仅能通过浓缩样品检测到这些蛋白质。我们还观察到miRNA的最高水平（即，miR-192 和 miR-1207-5p）以及 mRNA 表达（即TSG101、PDCD6IP 和 AQP212采用改良沉淀法11该改良沉淀方法的优缺点如图所示。
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披露
本文的出版费用由 SBI Biosciences 支付。
致谢
我们感谢罗尼家族基金会对本研究的支持。我们谨此感谢 M. Lucrecia Alvarez 博士在本工作所述实验的规划与实施过程中所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Corning 15 ml 离心管 | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | P8340 | |
| 离心机 | Sorvall | ||
| DL-二硫苏糖醇 | Sigma Aldrich | D9779 | 使用终浓度为 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE 系统（4-12% Bis-Tris 凝胶，1.0 mm，10 孔） | Invitrogen | NP0321BOX | 用于 SDS-PAGE 分析 |
| ECL Advance 蛋白印迹检测试剂盒 | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 |
| Exoquick-TC 试剂 | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | 用于外泌体分离 |
| 外泌体 CD9 ELISA 完整试剂盒 | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | 用于外泌体定量 |
| AllPrep DNA/RNA/蛋白小型试剂盒 | Qiagen | 80004 | 用于 DNA、RNA、蛋白的分离 |
| Rneasy MinElute 清洁试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度计 | Thermo Scientific | 用于蛋白定量 | |
| ProteoSilver 银染试剂盒 | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | 用于 SDS-PAGE 凝胶染色 |
| Xcell SureLock Mini-Cell 电泳系统 | Life Technologies | 用于运行 SDS-PAGE 凝胶 | |
| TaqMan microRNA 检测试剂 | Life Technologies | 用于 RT-PCR 检测 | |
| qBasePlus v1.5 软件 | Biogazelle NV | 用于 RT-PCR 检测数据分析 | |
| 兔多克隆抗体 ALIX | Millipore | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 | |
| 鼠单克隆抗体 TSG101 | Abcam | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 |
参考文献
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling ....
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重印与许可
