本论文描述了一种使用改良沉淀法从人尿液中分离外泌体的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
多年来，鉴定可在尿液和血浆中实现肾脏疾病早期检测的生物标志物一直是一个备受关注的研究领域。尿液外泌体囊泡在正常情况下由肾单位各节段的细胞释放进入尿液，大小为40-100 nm，可能含有代表其来源细胞类型的蛋白质、mRNA和microRNA。在肾功能障碍或损伤条件下，外泌体可能含有这些成分比例的改变，这些改变可作为疾病的生物标志物。目前已有多种可用于分离尿液外泌体的方法，我们此前已对这些方法进行了实验性比较，包括三种基于超速离心的方法、一种使用纳米膜超滤浓缩装置的方法、一种使用商用沉淀试剂的方法，以及一种在本实验室开发的基于ExoQuick试剂的改良沉淀技术。我们发现，改良后的沉淀法能获得最高的外泌体颗粒、miRNA和mRNA产量，因此适用于后续RNA谱分析所需的外泌体分离。我们得出结论：这种改良的外泌体沉淀方法为从尿液中分离外泌体提供了一种快速、可扩展且高效的方法。在本报告中，我们描述了使用ExoQuick试剂从人尿液中分离外泌体的改良沉淀技术。
引言
尿液外泌体是多泡体（MVB）来源的直径约100 nm的小型内体囊泡，在正常和病理条件下，尿液空间中所有细胞类型（包括肾小球足细胞、肾小管上皮细胞以及尿路引流系统内衬细胞）均可释放此类外泌体，且其富含miRNA1-2。许多研究人员已在健康个体以及患有肾脏和/或系统性疾病个体的尿液外泌体中检测到不同的蛋白质3-5。外泌体可通过多种方法分离，例如两步差速超速离心法（使用或不使用蔗糖）6-7、纳米膜过滤联合超速离心法8-9，或沉淀法10-11。我们近期开发了一种简单、快速、可扩展且高效的尿液外泌体分离方法，并可用于检测miRNA和蛋白质生物标志物11。尽管生物标志物可在多种不同的生物液体中检测到，但对于肾脏及泌尿道疾病患者而言，尿液是最为便捷的样本来源，因其可相对无创地大量获取。
尽管已有多种方法可用于分离尿液外泌体6-11，但最常用的方法依赖于在30%蔗糖垫上的差速超速离心法。虽然该方法效率较高，且所获得的外泌体质量良好，但该技术本身需要熟练的操作人员，且耗时较长，需进行多次超速离心步骤。其他方法，如过滤法和沉淀法，也已被开发用于外泌体的分离，其中包括一种使用专有沉淀试剂的方法（即，ExoQuick-TC：System Biosciences；Mountain View, CA）。尽管使用该试剂进行沉淀操作快速且相对简便，但与超速离心法相比，所分离外泌体的纯度较低。我们近期比较了六种尿液外泌体分离方法，其中包括我们实验室开发的一种对ExoQuick-TC沉淀法的改良方法11。我们发现，这种改良的沉淀法所获得的蛋白质、miRNA和mRNA含量更高，且操作过程比超速离心法更快、更易于实施。本文以逐步方式详细描述了我们改良后的沉淀法实验方案，并讨论了该技术与其他外泌体分离方法相比的优缺点。该改良沉淀法包括首先对外泌体颗粒进行初步沉淀，随后去除Tamm-Horsfall蛋白——该蛋白与外泌体蛋白相关，已知会降低尿液中外泌体的得率。我们发现，这些改良措施显著提高了尿液外泌体提取物的得率和纯度。
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方案
注意：使用改良沉淀法分离尿液外泌体的步骤如图1所示。初始步骤通过离心去除较大的死亡细胞和细胞碎片。从后续每一步收集的上清液中最终获得的沉淀物即为外泌体，将其溶解于分离溶液中，用于进一步提取蛋白质、RNA和DNA。
1. 尿液采集
- 在收集尿液之前，根据制造商的说明配制蛋白酶抑制剂混合液，并将3.125 ml该混合液加入一个空的无菌容器中。然后可将含有蛋白酶抑制剂混合液的试管分发给志愿者用于尿液收集。
注意：添加蛋白酶抑制剂的目的是尽量减少尿液样本中蛋白质的降解。尽管我们特别使用了Sigma公司的蛋白酶抑制剂混合液，但也可替换为其他市售的蛋白酶抑制剂。 - 收集约10 ml的首次排尿尿液。收集后应立即处理尿液，不得储存或冷藏。采用改良的沉淀法平行分离尿液外泌体；其中一份用于DNA、总RNA和蛋白质的提取，另一份用于尿液外泌体颗粒的定量。
注意：可通过在4 °C下储存来收集24小时尿液样本用于外泌体分离。
2. 去除细胞碎片和Tamm-Horsfall蛋白（THP）
- 将尿液样本转移至15 ml离心管中。取10 ml尿液在37 °C下以17,000 × g离心10分钟，以去除细胞及细胞碎片（图1）。
- 使用移液器将上清液转移至新管中用于后续处理。将沉淀重悬于500 µl裂解液（250 mM蔗糖，10 mM三乙醇胺，pH 7.6）中，随后加入DL-二硫苏糖醇（DTT：终浓度200 mg/ml），在37 °C孵育10分钟。
注意：添加DTT可降解 trapping exosomes 的Tamm-Horsfall蛋白（THP），从而提高外泌体得率。转移上清液时应小心避免扰动沉淀，并确认上清液中无沉淀残留。 - 每2分钟涡旋震荡沉淀样品一次，直至沉淀完全溶解。然后向溶解的沉淀中加入500 µl裂解液。
- 在向沉淀中加入裂解液后，立即在37 °C下以17,000 × g离心10分钟。用移液器吸取上清液，并与先前收集的上清液合并。
- 将沉淀用50 µl裂解液重悬，用于SDS-PAGE分析。
注意：重悬沉淀时可使用PBS或TBS替代裂解液。
3. 外泌体沉淀的分离
- 向收集的11 ml上清液中加入3.3 ml ExoQuick-TC试剂，在4 °C孵育至少12小时。
注意：上清液体积与ExoQuick-TC试剂的体积比例可调整，以增加或减少外泌体产量。我们观察到，加入的试剂体积越小，外泌体的产量越低。 - 孵育完成后，在25 °C下以10,000 × g离心30分钟，处理样品与ExoQuick-TC的混合物。
- 将上清液转移至新管中，用于SDS-PAGE分析。
- 外泌体沉淀物可储存于-80 °C，用于DNA、RNA和蛋白质的提取，以及通过CD9 ELISA对外泌体颗粒进行定量11。
注意：外泌体沉淀物在-80 °C可保存1年，应尽量减少冻融次数。
4. 外泌体沉淀物的生物标志物检测与分析
- 对于后续分析，根据制造商说明书，使用DNA/RNA/蛋白质分离试剂盒和RNA分离试剂盒从外泌体沉淀中提取DNA、RNA和蛋白质。取2 µl样品，利用Nanodrop分光光度计在260 nm和280 nm处测定吸光度，以确定浓度。
- 使用TaqMan microRNA检测试剂盒（在本研究中，我们使用了针对人miR-192和miR-1207-5p的特异性检测试剂盒）或miRNA特异性引物进行定量实时RT-PCR（qPCR）。
- 进行SDS-PAGE分析时，使用4-12% Bis-Tris凝胶，通过一维电泳分离蛋白质样品。根据制造商说明书，使用银染试剂盒对凝胶进行显色观察。
- 根据制造商提供的说明，使用PVDF膜进行Western印迹分析。在Western印迹检测中，使用兔多克隆抗体针对凋亡相关基因-2相互作用蛋白X（ALIX）以及小鼠单克隆抗体针对肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）。使用开放获取的NIH ImageJ软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或类似程序对条带密度进行定量分析。
- 根据制造商说明书，使用CD9 ELISA试剂盒对获得的尿液外泌体颗粒数量进行定量。
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结果
尿液外泌体携带由肾小管上皮细胞分泌的蛋白质、miRNA 和 mRNA 生物标志物。分离和检测这些外泌体可能为糖尿病肾病等肾脏疾病的早期诊断提供有用的工具。目前已有多种方法可用于从人类受试者收集的尿液样本中分离外泌体。我们此前比较了六种尿液外泌体分离方法，并分析了所得的蛋白质、mRNA 和 miRNA 水平11。本文旨在详细描述我们开发的一种经改进的沉淀法，用于高效分离尿液外泌体。
图 1 描述了采用改良沉淀法分离尿液外泌体过程中各步骤的示意图流程图。 所得两份外泌体沉淀中的一份用于CD9检测，使用CD9 ELISA试剂盒进行测定，从而获得外泌体颗粒的相对...
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讨论
大多数从尿液中沉淀外泌体的方法均未解决Tamm-Horsfall蛋白（THP）形成的聚合物网络的去除问题。该蛋白在尿液中含量较高，可能在初始低速离心过程中捕获外泌体。在我们改进的方法中，于外泌体沉淀前使用DTT降低THP含量。如图所示 图2在未处理的尿液和沉淀物中观察到较高含量的THP，而最终上清液和外泌体沉淀物中均未检测到THP，表明该蛋白已被去除。对沉淀物中的蛋白进行定量显示，产量高出六倍；通过CD9 ELISA对沉淀物进行定量分析，结果显示每毫升尿液中外泌体的产量比未经改良的沉淀法高出五倍（结果未显示）。11）。生物标志物Alix6 和 TSG1018 在外泌体沉淀中检测到了这些蛋白质；使用未修饰的沉淀方法时，我们仅能通过浓缩样品检测到这些蛋白质。我们还观察到miRNA的最高水平（即，miR-192 和 miR-1207-5p）以及 mRNA 表达（即TSG101、PDCD6IP 和 AQP212采用改良沉淀法11该改良沉淀方法的优缺点如图所示。
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披露
本文的出版费用由 SBI Biosciences 支付。
致谢
我们感谢罗尼家族基金会对本研究的支持。我们谨此感谢 M. Lucrecia Alvarez 博士在本工作所述实验的规划与实施过程中所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Corning 15 ml 离心管 | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | P8340 | |
| 离心机 | Sorvall | ||
| DL-二硫苏糖醇 | Sigma Aldrich | D9779 | 使用终浓度为 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE 系统（4-12% Bis-Tris 凝胶，1.0 mm，10 孔） | Invitrogen | NP0321BOX | 用于 SDS-PAGE 分析 |
| ECL Advance 蛋白印迹检测试剂盒 | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 |
| Exoquick-TC 试剂 | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | 用于外泌体分离 |
| 外泌体 CD9 ELISA 完整试剂盒 | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | 用于外泌体定量 |
| AllPrep DNA/RNA/蛋白小型试剂盒 | Qiagen | 80004 | 用于 DNA、RNA、蛋白的分离 |
| Rneasy MinElute 清洁试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度计 | Thermo Scientific | 用于蛋白定量 | |
| ProteoSilver 银染试剂盒 | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | 用于 SDS-PAGE 凝胶染色 |
| Xcell SureLock Mini-Cell 电泳系统 | Life Technologies | 用于运行 SDS-PAGE 凝胶 | |
| TaqMan microRNA 检测试剂 | Life Technologies | 用于 RT-PCR 检测 | |
| qBasePlus v1.5 软件 | Biogazelle NV | 用于 RT-PCR 检测数据分析 | |
| 兔多克隆抗体 ALIX | Millipore | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 | |
| 鼠单克隆抗体 TSG101 | Abcam | 用于生物标志物的蛋白印迹检测 |
参考文献
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重印与许可
