本文介绍了两种用于检测抗红细胞抗体诱导补体活化的检测方法。与现有检测方法相比，其主要优势在于具有定量性且结果易于解读。
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本文内容
摘要
摘要
针对红细胞（RBCs）的抗体可导致补体激活，从而通过肝脏中的补体受体加速清除红细胞（血管外溶血），或导致红细胞发生血管内溶解。同种抗体（例如 ABO 血型不合或红细胞抗原的自身抗体（如在自身免疫性溶血性贫血，AIHA 中所见）可导致补体激活，具有潜在危害性，尤其当引起血管内溶血时，可能致命1目前，红细胞上（自身）抗体引起的补体活化情况的评估 体外 通过使用反映补体在红细胞上沉积的Coombs试验，或反映红细胞裂解的非定量溶血试验1-4然而，为了评估补体抑制剂的疗效，必须具备定量检测技术。本文介绍了两种此类技术。首先，介绍一种检测患者血清中抗体诱导的红细胞表面C3和C4沉积的实验方法。该方法采用流式细胞术（FACS），使用荧光标记的抗C3或抗C4抗体进行检测。其次，描述一种定量溶血试验。该实验通过分光光度法测定患者血清诱导的补体介导溶血程度 检测释放的血红蛋白。这两种检测方法均具有高度可重复性和定量性，有助于开展抗体诱导补体激活的相关研究。
引言
针对红细胞（RBCs）的抗体可因输注表达受者红细胞所缺乏抗原的红细胞而被诱导产生。这些同种异体抗体在后续输血过程中可通过激活补体，引发严重的急性溶血性输血反应。5在自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中，患者体内存在针对自身红细胞的自身抗体。这会导致红细胞通过脾脏中吞噬细胞上的 Fcγ 受体与结合在红细胞上的 IgG 相互作用而加速清除；或者，当自身抗体能够激活补体时，还可通过肝脏中的补体受体介导清除。6,7补体系统暴发性激活导致的血管内溶血虽罕见但常致命。由同种或自身抗体诱导的补体介导的红细胞加速破坏，可引起急性贫血，进而导致潜在致命的组织缺氧。自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的自身抗体根据其与红细胞结合的最适温度分为温抗体型和冷抗体型（分别为37 °C或更低温度）。温抗体通常为IgG亚型，而冷抗体则通常为IgM亚型。8,9. AIHA 可继发于 例如 淋巴增殖性疾病、结缔组织病、实体瘤、感染或药物均可引起自身免疫性溶血性贫血，但在50%的病例中，该病为特发性9.
通过半定量直接抗球蛋白（Coombs）试验（DAT）检测患者红细胞（RBC）表面结合的γ球蛋白（例如 IgG 或 IgM）及补体成分。在 DAT 中，将患者的红细胞与抗 IgG 或抗 C3d 抗体孵育，若出现红细胞凝集，则表明红细胞表面已结合补体成分或 IgG。通过间接抗球蛋白试验（IAT）检....
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方案
1. 溴化酶处理红细胞的制备
- 用1×PBS洗涤O型红细胞3次（664 × g离心2-5分钟）。
- 将1体积压积红细胞与两体积0.5%溴酸蛋白酶溶液在37 °C孵育10分钟。
- 用1×PBS洗涤细胞3次。
- 细胞可在1×PBS中配制成3%的溶液，于4 °C保存至少一周。
2. 通过流式细胞术分析红细胞上的C3和C4沉积
- 将所需量的患者血清（或其他抗红细胞抗体来源）在56 °C下加热30分钟，以进行热灭活。
- 用VBG- （5 mM 巴比妥、150 mM NaCl、0.05% 明胶，pH 7.4）将经菠萝蛋白酶处理的红细胞洗涤三次，然后重悬于VBG++（VBG-- + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2）中，配制成0.5%的悬液。
- 将以下组分加入含玻璃珠（用于充分混匀）的圆底板孔中：25 µl 0.5% 红细胞悬液、37.5 µl 新鲜AB型血清（补体来源）和37.5 µl 200 µg/ml 抗C5抗体。抗C5抗体价格昂贵且可能难以获得，可考虑使用C5-/C6-/C7-或C8-缺陷型血清替代AB型血清与抗C5抗体。
- 向每孔加入患者血清，使其终浓度为0.1–33%。根据每孔血清浓度差异，....
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结果
图2A 显示了红细胞的代表性散点图。在FSC-W与FSC-A图中可见针对单个红细胞的合适设门（P1）。通常约95%的红细胞位于该P1门内（单细胞），但当使用较高比例的患者血清时，这一比例可能下降至70-80%，尤其是当患者血清中存在抗红细胞IgM时。
AIHA患者血清对C4沉积影响的代表性结果见图2B，对C3沉积的影响见图2C。从这些图中可以看出，患者血清量越多，补体沉积越多，这符合预期。值得注意的是，补体沉积呈现出两个明显分离的阳性峰。这种现象可能并非由红细胞群体的异质性引起，因为红细胞来自单一供体。我们仍在探究这一现象的原因。图2D和图2E展示了C4（图2D）和C3（图2E）沉积实验的可重复性，同时也显示了不同AIHA患者样本在补体沉积能力方面存在广泛差异。
在图3A
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讨论
上述检测方法具有良好的可重复性和稳健性。操作简便，可同时对多个样本进行检测（如在96孔板中进行）。因此，该方法也适用于全自动系统，例如 ELISA机器人系统。与目前使用的技术相比，这些检测方法是定量的，这将有助于例如补体抑制剂作用效果的研究。此外，结果判读具有客观性，优于目前使用的检测方法。
两种检测均有一个关键步骤。在FACS分析中，重要的是要圈选单个红细胞，因为聚集的红细胞会被计为一个事件，从而导致信号人为升高。通过使用较低的患者血清浓度来预防红细胞聚集效果更佳，因为低浓度仍可产生良好的信号。在溶血检测中，孵育后需小心地将上清液转移至新板中，因为红细胞的残留（以及气泡）会导致信号不可靠。建议在两种检测中均使用O型红细胞，以避免因ABO血型不匹配引发的补体激活而造成混淆。
由于其可靠性和稳健性，这些检测方法适用于研究补体抑制剂对自身免疫性溶血性贫血（AIHA）的疗效，如参考文献所示11，以定量检测补体活化的细微差异。由于其高敏感性，这些检测方法可能在某些患者中检测到常.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
SZ 和 DW 收到了 Viropharma 提供的无限制资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| 巴比妥 | Fagron | 0261 | 该化学品受药品监管限制。 |
| 苯巴比妥钠 | Fagron | 0263 | 该化学品受药品监管限制。 |
| 明胶 | Merck | 1.0470.0500 | |
| 氯化钠 | Merck | 1.06404.1000 | |
| 氯化镁 | Merck | 1.05833.0250 | |
| 氯化钙 | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 胺反应性染料 | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 胺反应性染料 | Pierce | 62265 | |
| αC5（依库珠单抗） | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS（Canto） | BD | 任何具备合适激光器的流式细胞仪均可使用。 | |
| 分光光度计（例如 Multiskan spectrum） | Thermo Labsystems | 1500-193 | 任何具备合适波长范围的分光光度计均可使用 |
| BD FACSDiva 软件 v 6.1.2 | BD | 643629 | 任何兼容的流式细胞分析软件均可使用 |
| 菠萝蛋白酶 | Sanquin | K1121 |
参考文献
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....
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