定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞

Summary

在这里，我们描述了两个测定法用于测定补体活化诱导的抗红细胞。过电流测定法的主要优点是它们的数量和易于理解的性质。

Abstract

对红血细胞（红细胞）的抗体可导致补体激活导致通过补体受体在肝脏中（血管外溶血）或导致红细胞的血管内溶解的加速间隙。同种抗体（ 如 ABO）或自身抗体红细胞抗原（如自身免疫性溶血性贫血，AIHA看出），导致补体激活有潜在危害，可-导致血管内溶解，尤其是当-致命^1。目前，补体激活，由于对红细胞（自动）抗体是通过使用Coombs试验反映了补体沉积于红细胞或由非定量溶血测定反映红细胞裂解^1-4评估体外 。但是，为了评估补体抑制剂的疗效，它是强制性的，具有定量技术。在这里，我们描述了两个这样的技术。首先，检测以检测C3和C4上的沉积是由抗体诱导在患者血清中红细胞是预sented。为此，FACS分析是使用荧光标记的抗-C3或抗-C 4的抗体。接着，定量溶血测定进行说明。在此测定法，补体介导的溶血引起的病人血清的测量是利用分光光度法检测所释放的血红蛋白的。这两个实验都非常重复性和定量，促进抗体诱导补体活化的研究。

Introduction

对红血细胞（红细胞）的抗体可通过红细胞表达抗原其不存在于接收者的红细胞输血诱发。这些异体抗体可能会由于须待下列输血^5，补充活化严重的急性溶血性输血反应。在自身免疫性溶血性贫血（AIHA），患者有自身抗体对自身红细胞。这导致了细胞通过的IgG结合到红细胞上的脾和/或壳体的自身抗体能够通过补体受体在肝脏^6,7，激活补体的吞噬细胞的Fcγ-受体的相互作用加速间隙。暴发性补体激活导致血管内溶血是罕见的，但往往是致命的。加速，补体介导的红细胞破坏引起的任何异体或自身抗体导致急性贫血，因此潜在的致命性组织缺氧。自动抗体AIHA归类在温暖和寒冷的抗体，dependin在他们结合到红细胞（37°C或更低，分别）的最佳温度克。温暖的抗体是IgG同种型通常和IgM抗体的冷抗体同型^8,9。 AIHA可继发如 lymphoprolyferative疾病，结缔组织疾病，实体肿瘤，感染或药物，但在50％的案件AIHA是特发性^9。

检测丙种球蛋白（ 例如 ，IgG或IgM）和补体结合到病人的红细胞是通过半定量直接抗球蛋白（Coombs）试验（DAT）装置进行的。在DAT患者红细胞温育与抗IgG或抗体C3d。红细胞凝集的现象证明了附加的补体组分或IgG结合的存在。检测异体或在患者的血清中的自身抗体是由间接抗球蛋白试验（IAT）的装置执行。 IAT中，菠萝蛋白酶处理过的试验红细胞温育与病....

Protocol

1。菠萝蛋白酶处理过的红血细胞的制备

1. 洗0类型的红细胞3倍用1×PBS（离心664×g离心2-5分钟）。
2. 孵育1卷袋装RBC与两卷的10分钟0.5％的菠萝蛋白酶溶液在37°C
3. 洗细胞3倍用1×PBS。
4. 该细胞可以被存储为在4℃下在1×PBS中3％的溶液，至少一个星期。

2。 C3和C4沉积分析红细胞用流式细胞仪

1. 通过在56℃下将样品加热30分钟热失活所需的病人血清的量（或其它抗红细胞抗体来源）
2. 在VBG洗菠萝蛋白酶处理的红细胞三次^- （5 mM的佛罗那，150 mM氯化钠，0.05％明胶pH7.4）中重悬在他们VBG ^{+ +（VBG -} + 2毫摩尔MgCl ₂ +的10mM的CaCl _2），得到0.5％的溶液。
3. 吸取以下组件成圆底板中，用玻璃珠（六或适当的混合）:25微升0.5％的红细胞，37.5微升新鲜的AB血清（补源）和37.5μL200μg/ ml的抗C5。抗C5是昂贵的并且可能是很难获得的。人们可以考虑使用C5-/C6-/C7-或C8缺乏血清代替AB血清和抗-C5。
4. 添加每孔患者血清的0.1-33％的终浓度。正确的差异在血清浓度每孔由于使用热灭活的AB血清。加VBG ^{+ +}得到150微升/终体积良好。....

Results

图2A显示了一个代表性的散点图红细胞。对于单个红细胞合适的门可以看出，在去FSC-W - FSC-A地块（P1）。通常约95％的红细胞落入本P1栅极（单细胞）内，但是，当患者血清的高百分比被使用时，这可降低到70-80％，特别是当抗红细胞IgM是存在于病人血清。

对C4沉积AIHA患者血清的效果代表性的结果示于图2B和图2C C3沉积。如在这些图中可以看出，更多的患者血清导致更多的补体沉积，正如所预期的。奇怪的是，补体沉积发生在两个不同的正峰。这可能是不通过异质RBC群体造成的，由于红细胞​​是从单个供体绘制。我们仍在调查这一现象的原因。 图2D和2E demonstra电子温度Te的C4（ 图2D）和C3（ 图2E）的沉积测定法的重现性。他们还表现出不同的AIHA患者样本的补体沉积能力的巨大差异。

Discussion

上述测定是可再现的和鲁棒性。它们很容易进行，并有可能与许多样品在同一时间（在96孔板中）执行它们。因此，这种方法也将适合于一个完全自动化的系统中， 例如在ELISA机器人系统。相反，目前使用的技术，这些测定是定量的，这将有助于例如在补体抑制剂的作用的研究。此外，该解释是客观的，这是一个改进目前使用的检测。

这两种检测方法有一个关键的步骤。重要的FACS分析是门上的单个红细胞，由于凝集的红细胞会给出虚高的信号，因为它们算作一个事件。它甚至更好地防止凝集通过采用低患者血清浓度，因为低浓度仍然提供良好的信号。在溶血测定中，关键的是要小心转移上清一个折后孵化成一个新的板块，因为红细胞的结转将导致一个不可靠的信号（如意志气泡）。它建议使用0类型的红细胞在两种测定中，以防止与AB0失配补体激活的混乱。

由于它们的可靠性和健壮性这些测定法是合适的，研究补体抑制剂的疗效AIHA这表现在参考图¹¹中，为了检测补体激活定量细微的差别。由于其灵敏度这些测定可检测补体激活的患者，其中对红细胞的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	费森尤斯卡比
BSA	Sigma	B-4287
巴比妥	Fagron	0261	该化学品受药物监管。
巴比妥钠	Fagron	0263	该化学品受药物监管。
明胶默	克	1.0470.0500
氯化钠	Merck	1.06404.1000
氯化镁	Merck	1.05833.0250
氯化钙	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 胺活性染料	Pierce	46402
Dylight 650 胺活性染料	Pierce	62265
&C5 （依库珠单抗）	Alexion Pharmaceuticals
FACS （Canto）	BD		任何具有适当激光器的FACS都可以使用。
分光光度计（例如 Multiskan 光谱）	Thermo Labsystems	1500-193	任何具有正确波长范围的分光光度计都可以使用
BD FACSDiva 软件 v 6.1.2	BD	643629	任何兼容的 FACS 分析软件都可以使用
菠萝蛋白酶	Sanquin	K1121