红细胞上抗体诱导补体活化的定量检测方法

摘要

本文介绍了两种用于检测抗红细胞抗体诱导补体活化的检测方法。与现有检测方法相比，其主要优势在于具有定量性且结果易于解读。

摘要

针对红细胞（RBCs）的抗体可导致补体激活，从而通过肝脏中的补体受体加速清除红细胞（血管外溶血），或导致红细胞发生血管内溶解。同种抗体（例如 ABO 血型不合或红细胞抗原的自身抗体（如在自身免疫性溶血性贫血，AIHA 中所见）可导致补体激活，具有潜在危害性，尤其当引起血管内溶血时，可能致命¹目前，红细胞上（自身）抗体引起的补体活化情况的评估 体外 通过使用反映补体在红细胞上沉积的Coombs试验，或反映红细胞裂解的非定量溶血试验^1-4然而，为了评估补体抑制剂的疗效，必须具备定量检测技术。本文介绍了两种此类技术。首先，介绍一种检测患者血清中抗体诱导的红细胞表面C3和C4沉积的实验方法。该方法采用流式细胞术（FACS），使用荧光标记的抗C3或抗C4抗体进行检测。其次，描述一种定量溶血试验。该实验通过分光光度法测定患者血清诱导的补体介导溶血程度 检测释放的血红蛋白。这两种检测方法均具有高度可重复性和定量性，有助于开展抗体诱导补体激活的相关研究。

引言

针对红细胞（RBCs）的抗体可因输注表达受者红细胞所缺乏抗原的红细胞而被诱导产生。这些同种异体抗体在后续输血过程中可通过激活补体，引发严重的急性溶血性输血反应。⁵在自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中，患者体内存在针对自身红细胞的自身抗体。这会导致红细胞通过脾脏中吞噬细胞上的 Fcγ 受体与结合在红细胞上的 IgG 相互作用而加速清除；或者，当自身抗体能够激活补体时，还可通过肝脏中的补体受体介导清除。^6,7补体系统暴发性激活导致的血管内溶血虽罕见但常致命。由同种或自身抗体诱导的补体介导的红细胞加速破坏，可引起急性贫血，进而导致潜在致命的组织缺氧。自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的自身抗体根据其与红细胞结合的最适温度分为温抗体型和冷抗体型（分别为37 °C或更低温度）。温抗体通常为IgG亚型，而冷抗体则通常为IgM亚型。^8,9. AIHA 可继发于 例如 淋巴增殖性疾病、结缔组织病、实体瘤、感染或药物均可引起自身免疫性溶血性贫血，但在50%的病例中，该病为特发性⁹.

通过半定量直接抗球蛋白（Coombs）试验（DAT）检测患者红细胞（RBC）表面结合的γ球蛋白（例如 IgG 或 IgM）及补体成分。在 DAT 中，将患者的红细胞与抗 IgG 或抗 C3d 抗体孵育，若出现红细胞凝集，则表明红细胞表面已结合补体成分或 IgG。通过间接抗球蛋白试验（IAT）检测患者血清中的同种或自身抗体。在 IAT 中，先将经菠萝蛋白酶处理的试剂红细胞与患者血清孵育，洗涤后加入抗人 IgG 抗体。若患者血清中存在针对红细胞的 IgG 抗体并已致敏试剂红细胞，则会发生凝集反应。针对红细胞的 IgM 抗体在将经菠萝蛋白酶处理的试剂红细胞与患者血清孵育时可直接引起凝集。直接 Coombs 试验或 IAT 中的红细胞凝集现象可通过肉眼在试管中观察，也可将样本加样至小型 Sephadex 柱上，利用凝集红细胞与单个红细胞的体积差异进行分离后判读¹。

另一种常用于检测红细胞补体激活的技术是溶血试验¹，该方法通过评估患者血清诱导木瓜蛋白酶处理的红细胞发生（补体介导的）溶血的能力来实现¹⁰。离心后若上清液因释放的血红蛋白而呈红色，则判定为试验阳性；若上清液仍无色，则判定为阴性。抗球蛋白试验和溶血试验均为半定量试验，因为其结果以试验仍呈阳性的最高血清稀释度表示。

抗球蛋白试验和溶血试验是诊断中常规使用的可靠检测方法。由于这些试验为半定量性质，且依赖于操作人员的技术经验，因此不适合用于研究红细胞补体激活的细微差异——而在评估补体抑制剂疗效时恰恰需要这种高灵敏度的检测方法。因此，我们开发了两种定量检测方法，用于测定（自身）抗体介导的红细胞补体激活，本文将对此进行详细描述。

首先，我们建立了一种检测补体C3和C4活化片段在红细胞（RBC）表面沉积的实验方法（图1A）。在该实验中，将经菠萝蛋白酶处理的人O型红细胞与经热灭活的患者血清（抗红细胞抗体来源）、新鲜AB型血清（补体来源）以及抗C5单克隆抗体（依库珠单抗）共同孵育。若患者血清中含有可激活补体的抗红细胞抗体，则在此过程中会发生C3和C4在红细胞上的沉积。为了防止补体级联反应下游活化导致的红细胞裂解，实验中加入了阻断性的抗C5单克隆抗体。随后，通过流式细胞术（FACS）使用荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体或Fab片段分别检测红细胞表面C3和C4的沉积情况。设门圈选单个红细胞对于确保结果的可靠性至关重要。该技术的优点包括仅需少量患者样本、可评估补体级联反应早期阶段的活化情况，且方法具有良好的重复性和定量性。同时检测C3和C4的另一个优势在于，可根据沉积模式区分经典途径和凝集素途径活化（C3与C4均有沉积）与替代途径活化（仅C3沉积）。使用菠萝蛋白酶处理的红细胞而非未处理的红细胞可提高该实验的灵敏度。

第二种检测基于目前使用的溶血试验（图1B）。将人经菠萝蛋白酶处理的O型红细胞与热灭活的患者血清（抗红细胞抗体来源）以及新鲜的AB型血清（补体来源）共同孵育。如果患者抗红细胞抗体激活了补体，则会发生剂量依赖性的红细胞裂解，导致血红蛋白释放。通过在离心去除完整及碎片化的红细胞后，测定上清液在414 nm处的吸光度，来定量所释放的血红蛋白量。吸光度值与发生的溶血程度呈正相关。与目前使用的检测方法相比，本实验方案可提供客观、可量化的溶血数值，具有高度可重复性，且不依赖于操作人员对结果的主观判读。

已有研究¹¹描述了这些方法的应用，其中探讨了C1抑制剂作为补体抑制剂在自身免疫性溶血性贫血（AIHA）中的潜在用途。

方案

1. 溴化酶处理红细胞的制备

1. 用1×PBS洗涤O型红细胞3次（664 × g离心2-5分钟）。
2. 将1体积压积红细胞与两体积0.5%溴酸蛋白酶溶液在37 °C孵育10分钟。
3. 用1×PBS洗涤细胞3次。
4. 细胞可在1×PBS中配制成3%的溶液，于4 °C保存至少一周。

2. 通过流式细胞术分析红细胞上的C3和C4沉积

1. 将所需量的患者血清（或其他抗红细胞抗体来源）在56 °C下加热30分钟，以进行热灭活。
2. 用VBG^- （5 mM 巴比妥、150 mM NaCl、0.05% 明胶，pH 7.4）将经菠萝蛋白酶处理的红细胞洗涤三次，然后重悬于VBG⁺⁺（VBG^-- + 2 mM MgCl₂ + 10 mM CaCl₂）中，配制成0.5%的悬液。
3. 将以下组分加入含玻璃珠（用于充分混匀）的圆底板孔中：25 µl 0.5% 红细胞悬液、37.5 µl 新鲜AB型血清（补体来源）和37.5 µl 200 µg/ml 抗C5抗体。抗C5抗体价格昂贵且可能难以获得，可考虑使用C5-/C6-/C7-或C8-缺陷型血清替代AB型血清与抗C5抗体。
4. 向每孔加入患者血清，使其终浓度为0.1–33%。根据每孔血清浓度差异，使用热灭活的AB型血清进行校正。加入VBG⁺⁺使每孔终体积为150 µl。用ELISA封板膜封闭板孔。
5. 在37 °C下振荡孵育1.5–2小时。
6. 用含0.5% BSA的PBS洗涤红细胞三次（664 × g离心2分钟）。
7. 在含0.5% BSA的PBS中加入荧光标记的抗C3和抗C4单克隆抗体或其Fab片段（以减少凝集），终浓度为1 µg/ml。此处使用定制的抗C3-Alexa Fluor 488和抗C4-Alexa Fluor 647单克隆抗体；选择这两种荧光标记可实现通过FACS同时检测C3和C4。
8. 室温下轻柔振荡孵育30–45分钟。
9. 用含0.5% BSA的PBS洗涤红细胞三次。
10. 将红细胞重悬于150 µl含0.5% BSA的PBS中，并转移至新板（FACS分析前去除玻璃珠）。
11. 进行FACS分析。在FSC-A散点图中区分单细胞与双联体，对单个红细胞设门；选择适当的荧光检测通道（例如 FITC和APC）。
12. 采用中位荧光强度对结果进行定量分析。

注意：可以使用同型对照（isotype control）例如 荧光标记的抗IL6小鼠IgG1）。但是，建议包含一个真正的阴性对照 例如 通过将红细胞与不含患者血清（仅含AB型血清）或不含补体来源（经热灭活的AB型血清和经热灭活的患者血清）的体系共同孵育，随后使用相同的抗C3-Alexa Fluor 488和抗C4-Alexa Fluor 647抗体进行染色。该对照方式相较于同型对照，在红细胞实验中更具有效性¹²，尽管这些不同的对照通常会得到相同且为阴性的结果。

3. 定量溶血试验

1. 将所需量的患者血清（或其他抗红细胞抗体来源）在56 °C下加热30分钟以进行热灭活。
2. 用VBG^--洗涤红细胞3次，再用VBG⁺⁺洗涤1次。
3. 在含玻璃珠（用于充分混匀）的圆底板中加入以下组分：35 µl 3%红细胞悬液、25 µl新鲜AB型血清（补体来源）以及1–50%患者血清。使用热灭活的AB型血清校正血清浓度差异。加入VBG⁺⁺使每孔终体积为150 µl。用ELISA封板膜密封板孔。
4. 在37 °C下振荡孵育1.5–2小时。
5. 以664 × g离心5分钟，减速设置为较低水平（例如，在2–3分钟内缓慢减速至停止）。
6. 小心吸取90 µl上清液至新的微孔板中。此步骤中应避免产生气泡，并防止吸取到完整的细胞。
7. 使用合适的分光光度计测定A414/690吸光度。
8. 以纯水处理的对照红细胞溶血程度为100%，计算各组溶血的百分比。

结果

图2A 显示了红细胞的代表性散点图。在FSC-W与FSC-A散点图中可见针对单个红细胞的合适设门（P1）。通常约95%的红细胞位于此P1门内（单细胞），但当使用较高比例的患者血清时，该比例可能下降至70-80%，尤其是当患者血清中存在抗红细胞IgM时更为明显。

AIHA患者血清对C4沉积影响的代表性结果见图2B，对C3沉积的影响见图2C。从这些图中可以看出，患者血清量越多，补体沉积越多，这符合预期。值得注意的是，补体沉积呈现出两个明显分离的阳性峰。这种现象可能并非由红细胞群体的异质性引起，因为红细胞来自单一供体。我们仍在探究该现象的原因。图2D和图2E展示了C4（图2D）和C3（图2E）沉积实验的可重复性，同时也显示了不同AIHA患者样本在补体沉积能力方面存在广泛差异。

在图3...

讨论

上述检测方法具有良好的可重复性和稳健性。操作简便，可同时对多个样本进行检测（如在96孔板中进行）。因此，该方法也适用于全自动系统，例如 ELISA机器人系统。与目前使用的技术相比，这些检测方法是定量的，这将有助于例如补体抑制剂作用效果的研究。此外，结果判读具有客观性，优于目前使用的检测方法。

两种检测均有一个关键步骤。在FACS分析中，重要的是要圈选单个红细胞，因为聚集的红细胞会被计为一个事件，从而导致信号人为升高。通过使用较低的患者血清浓度来预防红细胞聚集效果更佳，因为低浓度仍可产生良好的信号。在溶血检测中，孵育后需小心地将上清液转移至新板中，因为红细胞的残留（以及气泡）会导致信号不可靠。建议在两种检测中均使用O型红细胞，以避免因ABO血型不匹配引发的补体激活而造成混淆。

由于其可靠性和稳健性，这些检测方法适用于研究补体抑制剂对自身免疫性溶血性贫血（AIHA）的疗效，如参考文献所示¹¹，以定量检测补体活化的细微差异。由于其高敏感性，这些检测方法可能在某些患者中检测到常...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
巴比妥	Fagron	0261	该化学品受药品监管限制。
苯巴比妥钠	Fagron	0263	该化学品受药品监管限制。
明胶	Merck	1.0470.0500
氯化钠	Merck	1.06404.1000
氯化镁	Merck	1.05833.0250
氯化钙	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 胺反应性染料	Pierce	46402
Dylight 650 胺反应性染料	Pierce	62265
αC5（依库珠单抗）	Alexion Pharmaceuticals
FACS（Canto）	BD		任何具备合适激光器的流式细胞仪均可使用。
分光光度计（例如 Multiskan spectrum）	Thermo Labsystems	1500-193	任何具备合适波长范围的分光光度计均可使用
BD FACSDiva 软件 v 6.1.2	BD	643629	任何兼容的流式细胞分析软件均可使用
菠萝蛋白酶	Sanquin	K1121