降低伊曲康唑浓度和处理时间在治疗两栖动物蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）感染中具有显著疗效

摘要

Batrachochytrium dendrobatidis 感染两栖动物后，可通过降低伊曲康唑的浓度（0.0025%）并缩短处理时间（每天浸泡5 分钟，持续6天）来清除，该方案所用剂量低于常规方法。采用此改良治疗方案后，观察到更低的死亡率以及更少的不良副作用。

摘要

两栖动物是所有脊椎动物类群中种群下降最严重的类群，而造成这一下降的主要原因之一是一种真菌病原体——Batrachochytrium dendrobatidis（Bd），其引发壶菌病。全球范围内，人工保育种群对于受威胁的两栖动物物种至关重要，可能是那些濒临灭绝物种的唯一生存希望。维持无病种群是人工饲养管理者的首要任务，然而目前尚未确定对所有物种及各发育阶段均安全有效的治疗方法。最常用的化学治疗药物是伊曲康唑，但其常用剂量可能对某些个体和物种产生危害。我们开展了一项临床治疗试验，以评估是否可以找到一种更低、更安全但仍然有效的伊曲康唑剂量来治愈Bd感染。研究发现，将治疗浓度从0.01%-0.0025%降低，并将治疗时间从每次5分钟、连续11天缩短至6天，即可在减少副作用和降低治疗相关死亡率的情况下治愈青蛙的Bd感染。

引言

两栖动物目前正经历着所有脊椎动物类群中最大的生物多样性下降¹。壶菌病是一种由壶菌真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）引起的皮肤疾病，是导致这些显著种群衰退的主要原因之一²。Bd是有记录以来对生物多样性丧失影响最严重的病原体：它可感染超过600种两栖动物，已导致300多个物种数量下降，其中多达200个物种已沦为极危或灭绝^2,3。两栖动物壶菌对宿主无特异性，目前尚不清楚宿主的哪些特性允许Bd感染进展并引发严重疾病。壶菌病通过破坏皮肤中的离子通道导致死亡，引发电解质流失和心力衰竭⁴。此外，Bd的上清液（不含Bd游动孢子）可引起蝌蚪的免疫反应⁵，使研究人员推测Bd会产生一种有毒副产物⁶。

由于许多物种数量正在迅速下降，圈养保育种群和繁育计划已成为重要的保护措施，对某些物种而言可能是唯一的生存保障。建立并维持无病种群对于两栖动物管理机构而言是一项挑战。目前治疗Bd感染的化学疗法虽然有效，但可能对受治疗动物造成伤害，且尚无任何单一治疗方法能在不同种类和不同年龄阶段的两栖动物中均取得成功⁷。

针对Bd感染的治疗方案，目前开展的临床试验较少⁷。最常用的三种治疗方法为热疗、氯霉素和伊曲康唑。热疗是一种非化学治疗手段，似乎副作用较少，可用于多个生活史阶段，且通常有效。在一项治疗试验中，Chatfield 和 Richards-Zawacki⁸发现，将动物置于30 °C环境下饲养10天后，96%的受试动物已清除感染。尽管该试验未达到100%的成功率，但为其他研究人员评估其自身物种的热疗效果提供了基准。尽管热疗对许多物种有效，但对于无法长时间耐受高温的高山物种而言，该方法并不实用。氯霉素是一种抗菌剂，已成功用于多种物种的Bd治疗，并可在体外抑制真菌生长。作为抗菌剂，氯霉素并非特异性地攻击真菌，但已知可导致真核细胞发生凋亡⁹。有推测认为，氯霉素治疗可引发皮肤细胞凋亡，从而杀死细胞内的孢子囊，但其确切作用机制尚不明确。尽管尚未开展临床试验，因此剂量和治疗时长尚未得到评估，目前的治疗方案通常需要浸泡两到四周^10,11，这使得该疗法 不适用于陆生两栖动物。此外，由于人类接触氯霉素与一种罕见的再生障碍性贫血相关，一些国家已限制其在兽医领域的使用¹²。

伊曲康唑是一种唑类抗真菌药物，是目前在圈养两栖动物中治疗Bd感染应用最广泛的方法。最常用的治疗方案是将动物置于0.01%的伊曲康唑溶液中浸泡，每天一次，每次5分钟，连续11天。该方案源自哺乳动物用药标准，虽然对两栖动物有效，但并未基于针对两栖动物的临床试验^11,13。该方案可能在某些物种中引起不良副作用，尤其在Rana属以及蝌蚪和近期完成变态的个体中更为明显¹¹。使用更低浓度（0.0005%）的伊曲康唑治疗蝌蚪已取得成功，但伴随出现脱色现象¹⁴。相同浓度在近期完成变态的个体中进行试验时，发现无法有效清除感染¹⁵。由于伊曲康唑治疗存在产生不良副作用的风险，一些实践者采用常规浓度的一半（0.005%）进行治疗，连续11天，结果证实该方案可成功治愈Bd感染¹⁶。

本研究是一项使用伊曲康唑治疗Bd感染的临床治疗试验的总结¹⁵。该方案旨在探索对感染Bd的动物使用伊曲康唑治疗时，既安全又有效的最低剂量和最短治疗时间。本研究使用的动物为墨西哥湾沿岸蟾蜍（Incilius nebulifer）的近期变态个体。

方案

伦理审批：本研究及其方法已获得杜兰大学动物使用与护理委员会的批准（方案编号：0407）。

1. 棘蛙壶菌（Bd）感染检测

1. 对Bd进行拭子采样
   1. 使用无菌棉签在动物腹面擦拭5次，每侧大腿、每侧身体和每个肢体各擦拭5次，总共45次擦拭。拭子采样是一种对两栖动物皮肤上Bd进行非侵入性取样的方法。
   2. 在擦拭过程中及每次擦拭之间轻轻旋转棉签，以确保棉签上收集到尽可能多的DNA。
   3. 将棉签储存于1.5 ml微量离心管中，置于-20 °C保存。
2. DNA提取与qPCR检测
   1. 使用市售的DNA提取试剂盒，按照动物组织操作说明从棉签样本中提取基因组DNA。
   2. 采用定量实时PCR（qPCR）分析提取的DNA，具体步骤参照Boyle et al.¹⁷的方法，并作如下修改：
   3. 用双蒸水将DNA提取物按1:10比例稀释。
   4. 向反应体系中加入0.7 µl牛血清白蛋白（BSA），以防止PCR抑制。
   5. 每个样本中均加入内参阳性对照，以确保PCR抑制未影响检测结果。
   6. 检测时需设置阳性对照、阴性对照以及一系列稀释标准品，用于估算游动孢子（感染负荷）的数量。

2. 接种

1. 培养Bd
   1. 通过将10 g胰蛋白胨加入1 L反渗透或去离子水中，高压灭菌（121 °C，40分钟），冷却后制备胰蛋白胨肉汤。待冷却至23 °C后，加入1 ml青霉素-链霉素溶液。
   2. 将Bd菌株（JEL411，由J. Longcore提供，分离自巴拿马瓜巴尔地区的Phyllomedusa lemur）在胰蛋白胨肉汤中于23 °C培养七天。
2. 将肉汤培养物转移至含胰蛋白胨的琼脂平板。
   1. 制备平板时，将10 g胰蛋白胨和10 g琼脂加入1 L反渗透或去离子水中，高压灭菌（121 °C，40分钟）。
   2. 待高压灭菌后的混合物冷却至可触碰但尚未凝固时，在超净工作台中倒入培养皿，每皿填充1/4至1/3体积。
   3. 待琼脂完全凝固并冷却后，向每块平板加入0.5 ml Bd肉汤，并均匀涂布，静置使其干燥。
   4. 平板接种Bd游动孢子后，用Parafilm密封。
   5. 将平板置于23 °C培养5至7天。接种前检查游动孢子的运动情况以确保其活性。
3. 制备用于游动孢子接种的悬浮液
   1. 经过5至7天的Bd培养和生长后，向每块平板加入5 ml陈化自来水，使游动孢子释放至液体中，静置10分钟。
   2. 将游动孢子悬浮液倒入便携容器中。
   3. 使用血细胞计数板估算游动孢子浓度。
   4. 用陈化自来水将悬浮液稀释至每3 ml含1 × 10⁶ 个 游动孢子的浓度。
4. 接种动物
   1. 在单独的50 ml容器中，将3 ml接种液倾倒于每只动物的腹侧进行接种。让多余的接种液滴入接种容器底部。
   2. 每只动物在接种容器中保留24小时，以确保感染成功。
   3. 接种24小时后，将动物转移回各自已消毒的饲养箱中。
   4. 让感染发展两周时间。通过拭子采样和qPCR结果确认感染后，开始治疗。
   5. 对于Bd­阴性对照组，用5 ml陈化自来水冲洗无Bd的琼脂平板，并采用与上述相同的方法对动物进行模拟接种。

3. 治疗方案

1. 准备处理液
   1. 将 2.50 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中（终浓度为 0.0025% 伊曲康唑——最低有效治疗浓度）。
      1. 两栖动物林格氏液配方：1 L 反渗透水或去离子水，6.6 g 氯化钠，0.15 g 氯化钾，0.15 g 氯化钙，以及 0.2 g 碳酸氢钠。121 °C 高压灭菌 40 分钟，冷却至室温。
      2. 如需配制 0.01% 伊曲康唑处理液，将 10.00 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中。
      3. 如需配制 0.005% 伊曲康唑处理液，将 5.00 ml 水溶性伊曲康唑（1% 斯皮仁诺口服溶液）加入 1 L 两栖动物林格氏液中。
   2. 对于 Bd 阳性及 Bd 阴性对照组，将动物置于不含伊曲康唑的两栖动物林格氏液中浸泡。
2. 处理过程
   1. 将单个两栖动物放入盛有 35 ml 处理液的已消毒 50 ml 容器中。
   2. 轻轻旋转容器，确保动物完全浸没于液体中，持续 5 分钟。
   3. 将动物放回已消毒的饲养箱中。连续重复处理 6 天。
3. 确认治疗效果
   1. 在开始治疗当天检测动物是否感染 Bd。
   2. 治疗结束后一周进行 Bd 感染检测，并在此后每周检测一次，连续四周，以确认感染已清除。

4. Bd 作为一种生物危害

1. 每周对单个饲养箱进行消毒。
   1. 将饲养箱和处理容器浸泡在10%的次氯酸钠溶液中。
   2. 用流动水将经过次氯酸钠处理的每个容器冲洗两次。
   3. 容器在重新使用前需静置干燥24小时。
2. 操作动物时应佩戴洁净的丁腈手套，以防止Bd病原体交叉污染。每次处理不同动物之间均需更换手套。
3. 所有液体废弃物在丢弃前须用10%次氯酸钠溶液进行消毒处理。
4. 所有可能接触过Bd的固体废弃物在丢弃前须经高压灭菌处理。

结果

如果治疗结束四周后所有动物的Bd检测结果均为阴性，则认为伊曲康唑治疗成功。在治疗开始前、接种后两周，所有接种Bd的动物均被感染，平均游动孢子负荷量为1,121.7（±17.34）；而在治疗结束四周后，Bd阳性对照组动物的平均游动孢子负荷量为16,765.12（±14643.08）。

使用浓度为0.0025%的伊曲康唑溶液对Incilius nebulifer（n = 15）进行治疗，每天浸泡5分钟，持续6天，取得了成功。该低浓度伊曲康唑治疗组与Bd阳性对照组在死亡率上无显著差异（Cox回归分析：χ_2,1 = 2.17，exp(b) = 20,500，p = 0.339）（图1B），许多阳性对照个体在试验结束时仍存活，但伴有Bd感染。

使用0.0025%伊曲康唑药浴治疗11天，以及使用0.005%和0.0025%伊曲康唑治疗6天，均被证实为有效且安全的治疗方案（

讨论

采用本方案，我们能够安全有效地降低两栖动物Bd感染伊曲康唑治疗的用药剂量和治疗时间。最低剂量和最短疗程（0.0025%浓度，持续6天）对亚临床感染的I. nebulifer实现了有效的治疗效果。较低剂量与较短疗程的有效性表明，有必要开展针对Bd感染的临床治疗试验，因为目前尚无适用于所有种类和年龄阶段两栖动物的安全有效治疗方法。

目前尚不清楚伊曲康唑治疗导致死亡的具体原因¹¹。  在 Brannelly et al.¹⁵ 的研究中，对治疗期间或治疗结束后不久死亡的一小部分个体进行了尸检和组织病理学分析。这些分析结果未能明确死亡原因，但可以确定的是，没有动物死于壶菌病。个体死亡至样本保存之间发生了中度自溶，这可能影响了我们检测不同治疗组之间细微差异的能力。

尽管本方案支持存在一种安全有效的治疗方案，但仍需开展更多类似的试验。另一种唑类药物伏立康唑（voriconazole）已在至少一个物种中证明有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 水性伊曲康唑，Sporonox	杨森制药公司
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO₃3	Fisher Scientific	BP328-500
无菌棉签	医疗与导丝设备	MW113
1.5 ml 微量离心管	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69581
7500 实时荧光定量 PCR	应用生物系统公司	4351104
VIC IPC	应用生物系统公司	4308323
BSA	应用生物系统公司	AM2618
琼脂	Invitrogen	30391023
胰蛋白胨	Invitrogen	Q10029
青霉素-链霉素	Invitrogen	15070-063
培养皿	Sigma Aldrich	CLS430589