使用BoTest Matrix检测试剂盒从复杂基质中分离和定量肉毒神经毒素

摘要

BoTest Matrix 肉毒神经毒素（BoNT）检测试剂可快速从多种样本基质中纯化并定量 BoNT。 本文介绍了一种从固体和液体基质中检测和定量 BoNT 的实验方案，并以 BOTOX、番茄和牛奶为例演示了该检测方法。

摘要

在复杂基质中准确检测和定量肉毒神经毒素（BoNT）对于药品、环境和食品样品的检测至关重要。在疫情溯源、患者诊断以及食品安全检测过程中，需要对食品中的BoNT进行快速检测；同时，在基于BoNT的药品生产及保障患者安全方面，也必须进行准确的效价测定。目前广泛使用的BoNT检测小鼠生物测定法虽具有高灵敏度，但缺乏快速和常规BoNT检测所需的精确性和通量。此外，由于该生物测定法涉及动物使用，美国及国际上的药品监管机构和动物权益倡导者已呼吁以替代方法取代小鼠生物测定法用于BoNT检测。已有多种 体外 替代性检测方法已在简单缓冲液中对纯化的肉毒神经毒素（BoNT）展现出良好效果，但大多数方法尚未证明可用于高度复杂基质中的检测。本文介绍了一种利用BoTest Matrix检测试剂盒在复杂基质中检测BoNT的实验方案。该检测包括三个部分：第一部分为样品的检测前处理；第二部分为免疫沉淀步骤，使用包被抗BoNT抗体的顺磁性微珠从基质中纯化BoNT；第三部分通过荧光报告分子定量所分离BoNT的蛋白水解活性。本方案适用于96孔板的高通量检测，可处理液体和固体基质样品，需约2小时的手动操作时间，总检测时间根据样品类型、毒素载量及所需灵敏度的不同，约为4至26小时。文中提供了BoNT/A在磷酸盐缓冲液、药品制剂、培养上清液、2%牛奶和新鲜番茄中的检测数据，并讨论了影响检测成功的关键参数。 肉毒神经毒素，免疫沉淀，荧光报告分子，复杂基质，蛋白水解活性，高通量检测，BoTest Matrix

引言

肉毒神经毒素（BoNTs）是已知最致命的物质，其静脉注射的人类致死剂量估计为1-3 ng/kg^1,2存在七种结构相似的肉毒神经毒素血清型，分别标记为A至G型，每种均由一个负责细胞结合、摄取及转位至胞质的重链结构域和一个编码锌依赖性内肽酶的轻链组成^3-5肉毒神经毒素（BoNT）的强烈毒性部分源于其在神经肌肉接头处特异性结合并进入运动神经元的能力。⁶进入神经元后，轻链内肽酶特异性切割可溶性的 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白，该蛋白参与囊泡融合过程，抑制神经递质释放，导致弛缓性麻痹^7-14通常称为该疾病 "肉毒中毒" 膈肌和肋间肌因肉毒毒素（BoNT）作用而发生麻痹，最终会导致呼吸衰竭和死亡，除非得到早期诊断和治疗。

人类食源性肉毒中毒最常与肉毒毒素血清型 A、B、E 和 F（BoNT/A、BoNT/B，等）相关，通常由摄入受污染的食物引起^15,16；尽管也有数例报道发生于静脉吸毒者中的伤口型肉毒中毒^17,18。在美国，婴儿肉毒中毒是肉毒中毒最常见的形式，由一岁以下婴幼儿摄入Clostridium（梭菌）孢子所致^19-21。然而，在美国及国外均曾报道因家庭罐头加工或食品处理不当引发的食源性肉毒毒素暴发事件。2000 至 2009 年间，....

方案

1. 检测试剂的制备

1. 在室温（RT）下解冻 200× 二硫苏糖醇（DTT）、10× 基质结合缓冲液（以下简称 10× 结合缓冲液）、10× 中和缓冲液（仅适用于食品或 pH 不平衡样品）和 10× BoTest 反应缓冲液（以下简称 10× 反应缓冲液），时间约为 15 分钟，或直至完全解冻。有关本实验方案所用缓冲液和试剂的列表，请参见表 1。有关本实验方案所需材料和设备的列表，请参见表 2。
2. 将已解冻的缓冲液涡旋振荡 5 秒以混匀。10× 中和缓冲液、200× DTT 和 10× 反应缓冲液应呈澄清状态，而 10× 结合缓冲液则呈浑浊外观。若 10× 反应缓冲液解冻后仍呈浑浊状，可在 37 °C 下温育 5 分钟后再次涡旋振荡。
3. 配制 3.8 ml 的 1× 反应缓冲液。
   1. 标记一个 15 ml 锥形管为"1× 反应缓冲液"，加入 3.42 ml 分子生物学级水、380 μl 10× 反应缓冲液和 19 μl 200× DTT。通过反复倒置充分混匀缓冲液。
   2. 使用洁净的刀片将一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂切成四等份，并将其中一份加入 1× 反应缓冲液中（剩余部分可于 4 °C 保存以供后续使用）。 注意：若使用纯化的毒素和简单缓冲液（例如 药物样品），可能无需添加蛋白酶抑制剂。
   ....

结果

图 2 展示了所述实验方案步骤的示意图。图 2。该检测所需时间根据样本类型和所需的检测灵敏度而定，介于 4 至 26 小时之间，但实际操作时间仅需约 2 小时。检测在 96 孔板中进行，根据检测类型的不同，每块板可对最多 20 个样本（包括标准品）进行三复孔检测。

图3展示了使用在PBS中添加的BoNT/A全毒素，并按照所述方案与A/E报告分子分别孵育2、4和24小时后的代表性检测结果。本实验选用纯化的BoNT/A全毒素，因其分子量明确（约150 kDa），相较于毒素复合物较宽泛的700–900 kDa范围，且纯度较高，可实现精确浓度的准确添加。每个时间点的发射比值（在434 nm激发后，526 nm与470 nm处发射光强度的比值）随BoNT/A浓度作图（mLD₅₀值基于BoNT/A生产商的效价测定结果）。BoNT对报告分子的切割作用表现为发射比值的降低，在本实验所用酶标仪上，完整报告分子的发射比值约为2.7，完全切割后的比值约为0.7。需要注意的是，由于不同酶标仪检测荧光信号的单位为相对荧.......

讨论

本方案描述了在复杂基质中定量测定肉毒杆菌神经毒素/A（BoNT/A）复合物、全毒素或Clostridium培养上清液的操作步骤。当使用相应的基质检测试剂盒检测其他BoNT血清型（例如 BoNT/B、E和F）时，操作流程相同^56,60，但不同血清型和检测试剂盒之间的检测灵敏度可能存在差异。本方案未涵盖所有可能的样本类型，具体样本组成和预期用途可能需要对方案进行某些调整。基质可包括食品样本（例如 食品挑战试验）或药物辅料缓冲液（例如 基于BoNT的药品检测）。复杂的非食品类（例如 动物组织或环境）液体和固体样本应参照食品样本处理。本方案采用每孔200 μl的样本体积，但每孔低至50 μl的样本也可检测，只需相应调整10倍结合缓冲液的体积。小于50 μl的样本应在检测前用GPB或PBS稀释至≥50 μl。

食品成分的高度变异性为食品中肉毒神经毒素（BoNT）的检测与定量带来了特殊挑战。样品的pH值、黏度、离子强度以及颗粒物的存在均可能影响毒素在食品基质中的活性，因此必须将毒素从.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BoTest Matrix A 肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒	BioSentinel	A1015	适用于 BoNT/B 和 F 的检测试剂盒也可提供。
Varioskan Flash 荧光酶标仪	Thermo Fisher Scientific	5250040	大多数基于单色器或滤光片、具备 434 nm 激发光以及 470 nm 和 526 nm 发射光检测能力的仪器均可使用。
96 孔磁珠分离板	V&P Scientific	VP771H	可使用其他磁性板，但该板应设计为能将磁珠分离至孔的一侧。
兼容磁珠的酶标板洗板机	BioTek	ELx405 VSRM	可选，仅在需要自动化洗板时使用。  其他兼容磁珠的洗板机也可使用，但使用前应进行测试。
微量离心机			可选，仅在样品需要离心时使用。
MixMate 酶标板混匀仪	Eppendorf	22674200
轨道摇床			在室温或 25 °C 下使用，若具备温度控制功能
无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂	Roche	4693132001	仅在食品或环境样本检测时需要。蛋白酶抑制剂必须不含 EDTA。
BoNT/A	Metabiologics		可选，仅用于标准化和定量目的
黑色平底 96 孔板	NUNC	237105	板不应经过表面处理
96 孔板封板膜	Thermo Fisher Scientific	15036