介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。
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摘要
摘要
组织中的细胞外基质（ECM）由细胞合成并组装形成三维纤维状蛋白质网络，其纤维直径、成分和结构受到严格调控。除了提供结构支持外，ECM 的物理和化学特性在多种细胞过程中也发挥重要作用，包括细胞黏附、分化和凋亡。体内的 ECM 组装是通过暴露蛋白质内部隐藏的自组装（成纤）位点实现的。该过程因不同蛋白质而异，但纤连蛋白（FN）的成纤过程已被充分表征，是细胞介导 ECM 组装的典型模型系统。具体而言，细胞利用细胞膜上的整合素受体结合 FN 二聚体，并通过肌动球蛋白产生的收缩力使 FN 展开，暴露出结合位点，进而组装成不溶性纤维。这种受体介导的过程使细胞能够在从细胞到组织的不同尺度上组装并组织 ECM。本文介绍一种称为表面引发组装（SIA）的方法，该方法通过蛋白质与表面的相互作用模拟细胞介导的基质组装过程，使 ECM 蛋白展开并组装为不溶性纤维。首先，将 ECM 蛋白吸附到疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面，在此过程中蛋白质发生部分变性（展开），暴露出隐藏的结合结构域。随后，通过微接触印刷技术将展开的蛋白质以明确定义的微米和纳米图案转移至热响应性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）表面。通过温度触发 PIPAAm 溶解，最终形成并释放具有明确几何结构的不溶性 ECM 蛋白纳米纤维和纳米结构。通过设计用于微接触印刷的 PDMS 印模上的特定图案，可构建复杂的结构。除 FN 外，SIA 方法还可用于层粘连蛋白、纤维蛋白原以及 I 型和 IV 型胶原蛋白，以构建多组分 ECM 纳米结构。因此，SIA 可用于精确调控蛋白质组成、纤维几何形状和支架架构，从而模拟 体内 ECM 的结构与组成，构建基于 ECM 蛋白的工程化材料。
引言
组织中的细胞外基质（ECM）由多种多功能蛋白组成，参与对细胞黏附、增殖、分化和凋亡等多种细胞过程的物理和化学调控1-3。ECM由细胞合成、组装并有序排列，其蛋白纤维成分具有独特的组成、纤维尺寸、几何形态以及相互连接的结构，且随组织类型和发育阶段而变化。近期研究表明，ECM可提供指导性信号，引导细胞形成工程化组织4，这提示若能在组成和结构上模拟ECM，或将有助于开发用于组织工程和生物技术应用的仿生材料。
已开发出多种制造方法，用于构建可模拟组织中细胞外基质（ECM）特性的聚合物支架。例如，静电纺丝和相分离技术均已被证明能够形成孔隙结构的纤维基质，其纤维直径范围可从数十微米至数十纳米5-7。这两种技术还表明，高孔隙率的纳米纤维基质能够支持细胞黏附并促进细胞向支架内部浸润8。然而，这些方法在可实现的纤维几何形态、取向以及三维结构方面存在局限性。静电纺丝通常生成纤维随机取向或高度定向排列的支架，而相分离则产生纤维随机取向的支架。此外，材料选择也受到限制，研究人员通常使用聚（ε-己内酯）8和聚（乳酸-共-乙醇酸）9等合成聚合物，并在其表面包覆细胞外基质蛋白以促进细胞黏附。天然生物聚合物也被用于此类支架，包括I型胶原10、明胶11、纤维蛋白原12、壳聚糖13和丝素蛋白14，但这些仅占天然组织中所含蛋白质的一小部分。大多数组织中含有更为复杂的细胞外基质蛋白和多糖环境，包括纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原和透明质酸，而利用现有方法难以甚至无法将这些成分制备成纳米纤维结构。
为应对这一挑战，我们的研究工作聚焦于模拟细胞在其周围环境中合成、组装和组织细胞外基质（ECM）蛋白原纤维的方式。尽管不同ECM蛋白的原纤维形成过程各不相同，但通常由酶促反应或受体介导的相互作用触发ECM蛋白分子发生构象变化，从而暴露出隐蔽的自组装位点。本文以纤连蛋白（FN）作为模型系统，以深入理解原纤维形成过程。简而言之，FN同源二聚体通过其第10个III型重复单元中的RGD氨基酸序列与细胞表面的整合素受体结合。一旦结合，整合素通过肌动球蛋白收缩而彼此分离，使FN二聚体展开，暴露出隐蔽的自组装位点。这些FN-FN结合位点的暴露使得FN二聚体能够在细胞表面直接组装成不溶性原纤维15。无细胞系统中的研究表明，可通过使用变性剂16或在气-液-固界面处的表面张力使FN展开，从而揭示其隐蔽的FN-FN结合位点17-19。然而，这些技术所生成的FN纤维受限于特定的纤维尺寸和几何形状，且通常固定于某一表面。
此处我们介绍一种称为表面引发组装（SIA）的方法 20 通过利用蛋白质-表面相互作用，克服这些局限性，从而制备出由单一或多种细胞外基质（ECM）蛋白组成的自支撑不溶性纳米纤维、纳米织物（二维片层）及其他纳米结构图1在此过程中，细胞外基质（ECM）蛋白从溶液中的致密球状构象吸附并部分变性（展开）到图案化的疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章表面。随后，这些处于该状态的ECM蛋白通过微接触印刷技术转移至热响应性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）表面。22当使用40 °C的水进行水合时，PIPAAm保持固态；而当温度冷却至32 °C时，其经历一个低临界溶解温度（LCST），在此温度下变为亲水性，吸水溶胀并最终溶解，从而将组装的ECM纳米结构从表面释放。SIA方法可实现对尺寸的纳米级精确控制。通过调控组成、纤维几何形状和结构等关键参数，可重现多种天然ECM的特性 体内 并开发用于组织工程和生物技术应用的先进支架。
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方案
1. 使用光刻技术制备主模具
- 首先使用计算机辅助设计（CAD）软件设计待制备的细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维、纳米织物和纳米结构。然后将该CAD文件转移至光掩膜。光掩膜的类型取决于特征尺寸的分辨率；对于特征尺寸小至约10 μm的情况，基于透明胶片的光掩膜即可满足要求。若特征尺寸小于<10 μm，则需要使用玻璃铬版光掩膜。本文中所有展示的纳米纤维和纳米结构均采用基于透明胶片的光掩膜制备，因此其厚度为纳米级，但横向尺寸不受此限制。
注意：必须明确区分光掩膜中哪些区域为暗区（阻止紫外光透过），哪些区域为透明区（允许紫外光透过），因为这将与光刻胶类型（正性或负性）共同决定最终母模的表面形貌。 - 开始制备母模时，将一片4"硅片置于设定为150 °C的加热板上，加热15分钟以进行脱水处理。
- 将硅片居中放置于旋涂仪的真空卡盘上。将SU8-2015负性光刻胶倒入硅片中央，并以同心圆方式持续倾倒，直至覆盖约三分之二的硅片表面。
注意：倾倒SU8时应使试剂瓶尽量靠近硅片，以减少气泡的产生。 - 按以下参数设置旋涂仪：
- 铺展阶段：500 rpm，加速度100 rpm/sec，持续10秒。
- 旋涂阶段：4,000 rpm，加速度100 rpm/sec，持续30秒。
- 将硅片置于设定为95 °C的加热板上进行前烘，持续3分钟。
- 通过光掩膜对硅片进行紫外光曝光，总剂量为140 mJ/cm2。
注意：SU8为负性光刻胶，因此紫外光能够透过的区域在显影后将保留下来，并在母模上形成凸起结构。 - 曝光后烘烤：将硅片置于设定为95 °C的加热板上，持续4分钟。
- 将硅片浸入SU8显影液中显影3分钟。3分钟后，用异丙醇冲洗硅片。若冲洗过程中出现白色薄膜，则表明显影不完全，需将硅片重新放入显影液中继续显影30秒，再用异丙醇再次冲洗。重复此过程，直至异丙醇冲洗时不再形成白色薄膜。
- 用氮气流吹干硅片，并将其放入150 mm培养皿中，以防灰尘污染。
2. 制备PDMS印章
- 按10:1的质量比将PDMS弹性体基料与固化剂混合，配制PDMS预聚物。通常使用80 g基料和8 g固化剂，以确保有足够的PDMS形成1 cm厚的层来覆盖母模。
- 使用离心混合器对PDMS进行混合和脱气，设置如下：
- 混合：2,000 rpm，持续2分钟
- 脱气：2,000 rpm，持续2分钟。
- 若无混合器，可使用10 ml移液管手动混合PDMS 10分钟。通过将混合物置于真空干燥器中30分钟以去除气泡，完成脱气。
- 将足量PDMS预聚物倾倒于母模（图案化硅片）上，形成1 cm厚的层。在65 °C下烘烤4小时 或在室温下固化48小时，使PDMS固化。
- 固化完成后，可将含有图案的区域切割下来，制成PDMS印章。为区分PDMS印章的图案面与背面，可在印章背面的一个角上切出一个缺口。
3. 细胞外基质图案的微接触印刷
- 将直径为 25 mm 的玻璃盖玻片在 95% 乙醇中进行超声清洗 1 小时，然后在 65 °C 烘箱中干燥。
- 通过将 PIPAAm 溶解于 1-丁醇中制备 PIPAAm 溶液，浓度为 10%（w/v，通常为 1 g 溶于 10 ml）。
- 将玻璃盖玻片置于旋涂仪的真空吸盘中央，并用移液器加入 200 μl PIPAAm 溶液，确保覆盖整个玻璃表面。
- 以 6,000 rpm 的转速旋涂盖玻片 1 分钟。
- 将 PDMS 印模在 50% 乙醇中进行超声清洗 30 分钟，然后在氮气流下干燥。
注意：干燥及后续操作应在生物安全柜中进行，以确保当 ECM 纳米结构用于细胞实验时保持无菌状态。 - 在每块 PDMS 印模的图案化表面涂覆 200 μl 蛋白质溶液（对于 FN，通常为无菌蒸馏水中 50 μg/ml），室温孵育 1 小时。
注意：该涂覆体积适用于 1.5 cm2 的 PDMS 印模，需根据 PDMS 印模的尺寸、所用 ECM 蛋白种类及其溶液浓度进行相应调整。 - 用蒸馏水清洗 PDMS 印模以去除多余蛋白，并在氮气流下彻底干燥。
注意：印模上残留的任何水分都会引发盖玻片上 PIPAAm 涂层的过早溶解，从而阻碍蛋白质的正常转移。 - 对于无菌制备，将涂有 PIPAAm 的盖玻片放入密闭的培养皿中，并通过紫外照射进行灭菌处理；在生物安全柜中接受 45 分钟紫外照射即可达到灭菌效果。若无需无菌条件，可省略此步骤。
- 进行微接触印刷时，将 PDMS 印模的图案面与涂有 PIPAAm 的盖玻片接触。如有需要，可用镊子轻轻敲击印模背面，以排除气泡并确保接触均匀。
- 5 分钟后，将 PDMS 印模从盖玻片上剥离。
- 在此阶段，可进一步图案化其他 ECM 蛋白，以构建更复杂且多组分的结构。已有验证表明，该工艺可支持最多 3 次印刷，更多次数也可能可行。
4. 细胞外基质纳米纤维和纳米结构的释放
- 将带有图案的 PIPAAm 涂层盖玻片放入 35 mm 培养皿中，并使用相差显微镜检查图案的保真度。根据图案特征，可能需要使用 CCD 相机来分辨图案的细节。如果细胞外基质（ECM）蛋白带有荧光标记，也可使用荧光显微镜观察图案。
- 向培养皿中加入 3 ml 40 °C 的蒸馏水，并让其逐渐冷却。
- 可通过相差显微镜监测 PIPAAm 层的溶解及 ECM 蛋白图案的释放过程。若实验条件不允许使用光学技术，也可通过测量溶液温度来监测释放过程。通常将水冷却至室温，远低于 PIPAAm 的低临界溶解温度（LCST，32 °C），以确保 ECM 蛋白纳米结构已完全释放。
- 释放后，纳米纤维、纳米织物及其他纳米结构将悬浮于水中。若需将其用于后续实验，必须进行操控。具体操作方法取决于实验目的，可能包括固定到另一表面、使用显微操作仪移动，或包埋于水凝胶中等步骤。
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结果
SIA 能够精确控制纤维尺寸，从而构建细胞外基质蛋白纳米纤维。为证明这一点，将平面尺寸为 50 × 20 μm 的纤连蛋白（FN）纳米纤维阵列图案化于 PIPAAm 涂层的盖玻片上（图 2A）。释放后，纤维发生收缩，这是由于其在 PIPAAm 表面图案化时处于固有的预应力状态（图 2B）。对 FN 纳米纤维的分析显示，释放前纤维呈单一分散性，平均长度为 50.19 ± 0.49 μm，宽度为 19.98 ± 0.17 μm（图 2C）。尽管释放后纤维明显收缩，但仍保持单一分散性，平均长度为 14.15 ± 0.92 μm，宽度为 2.65 ± 0.32 μm（图 2D）。原子力显微镜提供了更高分辨率的图像，揭示了 SIA 释放过程中纤维尺寸变化的细节。值得注意的是，释放前的纤维厚度均匀，约为 5 nm（图 2E），而释放后的纤维厚度则不均一，数量级达数百纳米（图 2F）。
利用SI...
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讨论
本文介绍的SIA方法模拟了细胞介导的基质组装过程，能够对细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维和纳米结构的尺寸、排列方式及组成进行可调控的工程化构建。尽管SIA生成的ECM与细胞自然产生的ECM并不完全相同，但它所形成的ECM由纳米级蛋白原纤维组成20，这些原纤维在机械应变下可发生可逆的折叠/去折叠过程21，并具备结合细胞的能力20。这使得SIA具备独特的能力，可构建出在许多特性上重现体内（in vivo）ECM特征的ECM蛋白材料。例如，ECM纳米纤维可被制备成特定长度，其控制精度是其他技术难以实现的。我们展示了构建单分散纳米纤维阵列的能力（图2），在释放前（图2C）和释放后（图2D）均可精确控制其长度和宽度。这些ECM纳米纤维的长度可任意设计，例如我们已成功制备出长度约为1 cm的纤连蛋白（FN）纳米纤维（图3A）。相比之下，其他制备技术如静电纺丝和相分离法虽可生成纳米纤维，却无法精确控制其长度，通常只能产生连续的纤维。这...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
J.M.S. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）再生医学生物力学T32培训项目（2T32EB003392）的资助，Q.J. 获得了Dowd-ICES奖学金的资助，A.W.F. 获得了NIH主任新创新者奖（1DP2HL117750）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚(N-异丙基丙烯酰胺) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 硅胶试剂盒 (PDMS) | Dow Corning | 将10份基础剂与1份固化剂混合。 | |
| 丁醇 | |||
| 纤连蛋白 | BD biosciences | 354008 | 人源，1mg |
| 层粘连蛋白 | BD biosciences | 354239 | 超纯，小鼠源，1mg |
| 负性光刻胶 | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 显影液 | Microchem | ||
| 超声波破碎仪 Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 混合器 | Thinky Corporation | ||
| 旋涂仪 | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| 玻璃盖片，直径25mm，No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
参考文献
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