神经传导特性测量 体内 为表征多种神经肌肉疾病动物模型提供了一种强有力的工具。本文介绍了一种简便且可靠的方案，可用于对麻醉小鼠的坐骨神经进行电生理分析。
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摘要
摘要
电生理学研究可对各种神经肌肉疾病进行合理分类，并与神经病理学技术相结合，有助于理解其潜在的病理生理机制。1. 本文介绍了一种对小鼠坐骨神经进行电生理学研究的方法 体内.
使用异氟烷对动物进行麻醉，以确保被测小鼠在持续约30分钟/只的测量过程中无痛感，并维持不受干扰的操作环境。通过加热板维持恒定的37 °C体温，并使用直肠温度探针持续监测2。此外，在测量期间常规记录心电图（ECG），以持续监测被研究动物的生理状态。
电生理记录在坐骨神经上进行，坐骨神经是周围神经系统（PNS）中最大的神经，向小鼠后肢提供运动和感觉纤维束。在本方案中，坐骨神经保持 原位 因此无需提取或暴露神经，可在不引起任何不良神经刺激的情况下进行测量，同时获得真实的记录。使用适当的针电极3 我们同时进行近端和远端神经刺激，并通过腓肠肌处的记录电极采集传导电位。经过数据处理后，可获得可靠且高度一致的神经传导速度（NCV）和复合肌肉动作电位（CMAP）数值，这两项是量化评估外周神经整体功能的关键参数。
引言
电生理学测量是临床和实验室环境中研究周围神经功能完整性的不可或缺的工具。在人类医学中，大量神经肌肉疾病和神经病变的诊断依赖于电生理学测量。通过测量神经传导速度或信号电位幅度等神经特性，可以大致确定周围神经疾病的起源。
神经传导速度高度依赖于髓鞘化所实现的快速信号传导。因此，脱髓鞘过程通常表现为传导速度降低4。复合肌肉动作电位（CMAP）与功能性轴突的数量相关，当其显著降低时，可作为轴突损伤的指标5。
因此，通过电生理学方法可以鉴别周围神经损伤的病因，例如遗传性神经病6,7、糖尿病性神经病8,9、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病（CIDP）10或代谢性神经病11。
通常，在人体应用中，优先选择在腓肠神经或尺神经上进行无创记录。在小鼠中，坐骨神经是周围神经系统（PNS）中最粗大的神经，包含运动系统和感觉系统的大直径和小直径轴突，其神经特性易于分析。
本文所展示的方法是一种快速、简便且可靠的检测手段，可用于在完整小鼠的周围神经上测量所有与电生理学相关的标准参数。通过在保持完整的生命体上进行记录，可确保神经所处环境的生理条件得到维持。
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方案
本研究根据德意志联邦共和国动物保护法（Tierschutzgesetz der Bundesrepublik Deutschland）进行，并已获得图林根州食品安全与消费者保护局（Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz）的批准。
1. 设置测量
- 通过异氟烷/O2吸入麻醉小鼠——诱导麻醉使用3%异氟烷，维持麻醉使用2%异氟烷，均以100%氧气为载体（图1）。通过测试简单的反射（如运动反射）以及对轻度疼痛的敏感性来确认麻醉是否充分。建议在麻醉期间使用眼膏以防止角膜干燥，但由于该操作通常每只动物仅需30分钟，因此并非必需。若为存活实验，应适时给予长效镇痛剂以管理术后疼痛。
- 在动物已处于麻醉状态时，使用电动剃刀剃除后肢覆盖的毛发，并使用市售脱毛膏进行脱毛处理。为在整个操作过程中维持无菌状态，请佩戴无菌手套，并始终使用经70%乙醇仔细清洁的器械。
- 使用反馈控制加热板和直肠温度探头维持体温稳定（图2）。如有必要，请在动物之间使用无菌铺巾覆盖加热板，以保持无菌实验环境。此外，建议使用通过内置传感器电子控制的加热板，将加热温度限制在≤40 °C，以避免组织损伤。
图1. 实验装置示意图，显示一只后肢已剃毛的麻醉小鼠。 - 记录心电图（ECG）以监测心率这一生命体征参数。ECG记录使用三个电极，安装方式如下：每个前肢皮下各放置一个电极，颈部区域皮下放置另一个电极。
- 使用导电凝胶安放环形电极，以获得最佳导电性/传输电阻。感应电极（黑色标记）置于腓肠肌直径最大的位置，参考电极（红色标记）置于感应电极正下方。
注：设备详细信息请参见“材料表”。 - 根据预先设定但保持一致的距离，标记测量的准确位置，包括坐骨神经远端和近端刺激点与引导电极之间的距离。实验建议：远端刺激点位于感应电极远端4 mm处，近端刺激点位于感应电极远端16 mm处（图2）。
图 2. 测量开始前实验状态的代表性图像。 白色箭头指示感应（黑色）电极和参考（红色）电极在左后肢腓肠肌上的位置。刺激将通过针状电极在相对于黑色感应电极的特定位置进行。远端刺激点（左后肢上标有“d.s.”的黑点）距感应电极为 4 mm；近端刺激点（标有“p.s.”的黑点）距离为 16 mm。右后肢上的红线表示坐骨神经的大致解剖走行。此外，图中还标出了相关后肢肌肉的大致位置作为解剖标志。星号表示直肠温度探针。
2. 测量
- 原理：使用一次性单极28 G针电极，通过重复生成的单个方波脉冲（持续时间0.1毫秒）对神经进行一系列刺激（重复频率200毫秒；见图3A）。为了进行离线数据分析，建议同时采集神经刺激信号以及由此产生的神经肌肉功能反应曲线（图3B）。将一系列最大反应进行平均，得到“代表性神经肌肉功能反应”，用于后续数据分析。为获得可靠数据，需在每个刺激位点和每只动物上记录并平均至少3条独立且最佳的反应曲线。
图3. 数据采集与分析流程（示意图）。 重复生成的脉冲通过针电极施加于坐骨神经（图3A上排）。同时记录多个相应的神经肌肉反应曲线（图3A下排）。将刺激脉冲引起的神经肌肉反应曲线进行平均并放大后（图3B上排），可观察到以下特征性参数（图3B下排）：信号反应的潜伏期、信号的持续时间和幅度均可标示并用于后续计算与统计分析。不规则的信号传导和/或次优记录通常会导致多种信号变形，表现为不止一个正向和负向偏转，或出现振幅降低的双峰形态（图3C）。 - 在确定的位置使用针电极进行近端刺激（图2中标记为“p.s.”）。
- 为获得最佳记录条件并达到最大振幅，应在刺激过程中实时观察实际的反应曲线。这样，实验者可立即评估反应曲线的形态以及振幅的大小。
- 如有必要，可轻微且小心地调整刺激针相对于坐骨神经的位置和/或角度。通过这种轻柔的优化，可获得尽可能大的稳定振幅，并得到典型的双相型反应曲线（图4）。
- 在确定的位置使用针电极进行远端刺激（图2中标记为“d.s.”）。
- 测量完成后，将测试小鼠转移至单独的笼子中，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在动物完全从麻醉中恢复之前，不得将其单独留下或与其他动物同笼。应及时给予长效镇痛药以控制术后疼痛。建议系统性给予非甾体类抗炎药（NSAIDs）和阿片类药物1-3天。
- 或者，在不给动物造成额外痛苦的前提下，以快速且人道的方式处死仍处于麻醉状态的小鼠，例如通过颈椎脱位法。
图 4. 确定具有最大幅度的复合肌肉动作电位记录的示意图。 展示了一组完整的记录序列。（a）起始刺激点处的复合肌肉动作电位反应最小。（b）轻微移动刺激针即可获得具有最大幅度的复合肌肉动作电位记录。（c）进一步调整针的位置会产生不同幅度的复合肌肉动作电位记录，包括接近最大幅度的记录。（d）更换刺激针位置后，连续记录到接近最大幅度的复合肌肉动作电位。注意：在最佳刺激部位进行重复刺激时，复合肌肉动作电位幅度可能出现典型的递减现象12,13。星号标示出用于平均计算的最大幅度复合肌肉动作电位记录。
3. 分析
- 使用适当的软件包（例如 AtisaPro），基于代表性的神经肌肉功能反应数据集提取神经传导参数。
注意：请特别谨慎处理与时间相关的数据判定，因为复合运动动作电位（CMAP）起始和终止时的拐点判定可能较为困难。在图3B中提供了一种经验证具有可重复性的方法，该方法利用起始后和终止前信号偏转处的切线进行判定。 - 计算“信号潜伏期”和“CMAP”数值。
- “潜伏期”表示刺激与CMAP起始之间的时间延迟，而从CMAP初始负向偏转起始至首次回到基线的时间跨度称为“CMAP持续时间”。利用远端与近端潜伏期之差，结合远端与近端刺激点之间的距离，计算传导速度。
传导速度 = 潜伏期 / 刺激点间距离 - “CMAP”（复合运动动作电位）的幅度表示CMAP信号中最大正向与负向转折点之间的差值（单位为 mV）。
CMAP = 正向转折点数值 - 负向转折点数值
- “潜伏期”表示刺激与CMAP起始之间的时间延迟，而从CMAP初始负向偏转起始至首次回到基线的时间跨度称为“CMAP持续时间”。利用远端与近端潜伏期之差，结合远端与近端刺激点之间的距离，计算传导速度。
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结果
本研究对总共12只小鼠的坐骨神经进行了系列体内电生理记录，每种性别各6只。采用本方案进行测量，获得如下结果：
雄性和雌性小鼠的坐骨神经传导速度平均值均约为 20 m/sec（图 5）。该结果与其他文献报道的测量值一致。此外，根据我们的数据，雄性和雌性之间在神经传导速度方面无显著差异。
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讨论
本方案提供了一种简便且可靠的方法，用于在麻醉小鼠上测定坐骨神经传导特性，而无需暴露目标神经。然而，该实验操作会因针头穿刺造成组织损伤。因此，在完成记录后处死动物是合理的选择。但与需要在记录前暴露神经的其他更具侵入性操作相比，组织损伤相对较小3,14。因此，重复测量是可行的，具体取决于相应研究的设计。然而，为确保结果的一致性，必须考虑若干关键因素。
为了实现最佳的记录条件，必须通过彻底脱毛、充分清洁皮肤以及使用接触凝胶来降低皮肤电阻，这些措施均有助于在测量过程中保持足够低的噪声水平/污染程度。
此外，重要的是要观察检测到的信号是否存在最佳的双相曲线形态，如图 3B所示。有时，我们也会检测到明显由逆向传导或部分神经分支引起的不规则信号传播所产生的曲线。这种情况会导致信号出现多种变形，表现为不止一个正向和负向偏转，或出现分裂的信号形态、振幅降低和/或信号增宽（图 3C）。为了确保信号从刺激点到肌肉的正常顺向传导，仅应选用那些...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由SFB 604、DFG MO 1421/2-1和Krebshilfe 107089（资助给H.M.）资助。A.S. 获得了儿童神经纤维瘤基金会（美国纽约）颁发的青年研究者奖。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 同心针电极（刺激用） | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0901 | |
| 数字环形电极（记录用） | Natus Medical Incorporated, San Carlos, CA, USA | 9013S0302 | |
| ToM - 测量塔（A/D 转换器） | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| AtisaPro 数据采集与分析软件 | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, Germany | ||
| HSE-刺激器 T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Germany |
参考文献
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