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方法文章

可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

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⸱

DOI：

10.3791/51188

⸱

2014年3月12日

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

本文内容

摘要

本方案描述了如何在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎的组织内对分裂中的细胞进行成像。尽管已有多种方案描述了早期胚胎中细胞分裂的成像方法，但本方案重点介绍在胚胎发育中期至晚期阶段，对正在发育的组织内部细胞分裂过程的成像技术。

摘要

本方案描述了利用荧光显微镜对发育过程中分裂细胞进行成像的方法 秀丽隐杆线虫 胚胎。特别是，本方案重点介绍如何对位于表皮细胞下方的分裂期神经母细胞进行成像，这些神经母细胞可能在表皮形态发生过程中发挥重要作用。组织形成对于多细胞动物的发育至关重要。 并依赖邻近组织提供的外部信号。 秀丽隐杆线虫 是研究组织形态发生的理想模式生物 体内 由于其透明性以及结构简单，使得其组织易于通过显微镜进行研究。腹侧封闭是指胚胎腹侧表面被单层上皮细胞覆盖的过程。这一过程被认为由下方的成神经细胞所促进，这些细胞提供化学引导信号，介导上方上皮细胞的迁移。然而，成神经细胞具有高度增殖性，也可能作为腹侧表皮细胞迁移的机械基质。利用本实验方案的研究可揭示细胞间通讯在组织形成过程中的重要性，并可用于阐明参与发育组织中细胞分裂的相关基因的功能。

引言

尽管已有描述如何对早期细胞分裂进行成像的实验方案 秀丽隐杆线虫 胚胎，本方案描述了在胚胎发育中期对组织内细胞分裂进行成像的方法。在发育过程中对生物体进行成像的主要挑战之一是其对光毒性的敏感性。然而，随着转盘共聚焦显微镜和扫描场显微镜的普及，成像技术的应用范围得以进一步扩大。这两种系统均采用固态激光器和散射光，从而限制了生物体所暴露的紫外光水平。不过，宽场显微镜仍可用于成像 体内，特别是当它们配备了高灵敏度相机时（例如 EMCCD）、光圈控制和光照控制（例如 LED 或可调节的汞灯）。本实验方案介绍了如何使用共聚焦显微成像系统或宽场显微成像系统，对发育过程中细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 胚胎。例如，我们描述了如何对神经母细胞分裂进行成像。神经母细胞可通过向其上方的表皮细胞提供化学或机械信号，促进表皮形态发生，是细胞间通讯在组织形成中具有重要作用的典型范例。

Caenorhabditis elegans 因其透明性和简单的组织结构，是基于显微镜研究的理想模式生物1。此外，C. elegans 适用于遗传学方法和RNA干扰技术，且其许多基因具有人类同源基因，因此可用于鉴定组织形成的保守机制2-5。在 C. elegans 中，表皮的形成发生在胚胎发育中期，此时胚胎具有 >300 个细胞。表皮形态发生包括多个主要阶段，在此期间，胚胎被一层表皮细胞包裹，这些细胞通过收缩和延伸，将胚胎从卵圆形转变为细长的蠕虫形态6。腹侧封闭（ventral enclosure）是其中一种形态发生事件，指腹侧表皮细胞向腹侧中线迁移，覆盖胚胎的腹面（图1）。首先，两对位于前部的 Leading edge 细胞向腹侧中线迁移，并与对侧相邻细胞黏附并融合6。随后，位于后部的 pocket 细胞迁移，形成楔形结构，产生一个腹侧口袋6-7。目前对关闭该口袋的机制尚不完全清楚。一种可能的机制是，一种超细胞的肌动蛋白-肌球蛋白收缩结构以类似“束带”的方式将 pocket 细胞连接在一起，类似于伤口愈合过程8。有趣的是，部分 pocket 细胞的迁移由其下方特定亚群的成神经细胞（neuroblasts）介导9（位于表皮下方的神经前体细胞；图1B）。

先前的研究表明，成神经细胞可调控腹侧表皮细胞的迁移和腹侧闭合过程。 VAB-1（Ephrin受体）和VAB-2（Ephrin配体）在成神经细胞中高表达，有助于前部与后部成神经细胞之间的相互分离；vab-1或vab-2基因发生突变会导致腹侧闭合表型10-13。然而，启动子拯救实验表明，vab-1在覆盖其上的腹侧表皮细胞中同样必需，且腹侧表皮细胞还表达其他由成神经细胞分泌的导向信号的受体9。尽管这些受体中的任何一个发生突变均会引起腹侧闭合表型，但尚不明确缺陷的产生是源于成神经细胞定位异常，还是腹侧表皮细胞对导向信号响应失败所致14。在不影响成神经细胞分泌导向信号能力的前提下改变其分裂过程，可能有助于阐明成神经细胞在表皮形态发生过程中提供机械输入的作用。最近研究发现，一个细胞分裂相关基因ani-1（anillin）在成神经细胞中高表达（图2A），其表达缺失会导致成神经细胞分裂缺陷。有趣的是，这些胚胎表现出腹侧闭合表型（Fotopoulos, Wernike 和 Piekny，未发表观察结果）。

Anillin 对细胞分裂至关重要，尤其在胞质分裂过程中发挥关键作用，后者指母细胞物理分裂为两个子细胞的过程。胞质分裂由肌动蛋白-肌球蛋白收缩环的形成所驱动，该收缩环在时空上必须受到严格调控，以确保其与姐妹染色单体的分离过程精确偶联。在后生动物中，胞质分裂的主要调控因子是 RhoA（在秀丽隐杆线虫中称为 RHO-1）。 秀丽隐杆线虫），一种小GTP酶，其与GTP结合时具有活性。鸟嘌呤核苷酸交换因子Ect2/ECT-2激活RhoA后，RhoA-GTP与下游效应分子相互作用，形成收缩环并介导其向内收缩15Anillin 是一种多结构域蛋白，其C端与RhoA结合，N端与肌动蛋白和肌球蛋白结合。在哺乳动物或果蝇S2细胞中，Anillin对于稳定收缩环的位置是必需的。16Anillin 耗竭导致收缩环发生侧向振荡，最终细胞分裂失败，形成多核细胞17-19有趣的是，尽管 秀丽隐杆线虫 ani-1 在早期胚胎中协调肌动球蛋白收缩性，但它对胞质分裂并非必需。然而，如上所述， ani-1 在胚胎发育中期，神经母细胞的胞质分裂需要该因子（Fotopoulos, Wernike 和 Piekny，未发表观察结果）。胞质分裂失败会改变神经母细胞的数量和位置，可能影响化学导向信号分子的分布，或改变组织的力学特性。这两个模型均强调了神经母细胞在腹侧包裹过程中的非自主性作用，以及胚胎发育过程中组织间通讯的重要性。

本实验方案描述了如何对细胞分裂过程进行成像 秀丽隐杆线虫 利用荧光显微镜观察中期胚胎发育。大多数关于细胞分裂机制的研究均在培养皿中的单个细胞内进行（例如HeLa 或 S2 细胞）或细胞数量有限的早期胚胎中（例如 秀丽隐杆线虫 单细胞胚胎， 非洲爪蟾, 或棘皮动物胚胎）。然而，研究组织内的细胞分裂同样重要，因为外部信号可能影响分裂面的时间和位置。此外，细胞可能提供化学或机械信号来影响邻近组织的发育，理解细胞间通讯如何促进组织在发育过程中形成具有重要意义。

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方案

1. 线虫品系维持和RNAi实验用培养板的制备

  1. 线虫生长培养基平板
    1. 培养皿
      1. 制备线虫生长培养基（NGM）平板，用于维持线虫品系及进行遗传杂交。在2 L烧瓶中加入3 g NaCl、17 g 琼脂、2.5 g BactoPeptone和1 L蒸馏水，并放入一根金属搅拌子。
      2. 将烧瓶进行高压灭菌，以溶解琼脂并灭菌培养基。随后将烧瓶置于搅拌台上，边搅拌边冷却培养基。
      3. 待培养基冷却至手感微温（45–50 °C）时 °C），加入 1 ml 1 M CaCl₂2，1 ml 1 M MgSO₄4，加入1 ml浓度为5 mg/ml的胆固醇溶液和25 ml 1 M磷酸钾缓冲液（PPB；试剂/材料表中提供配方；储备液需过滤除菌），立即倒入小型培养皿（60 mm × 15 毫米；使用自动分液器将培养皿加液至距顶部约 3/4 处，或每板 13 毫升）。注意：对于某些菌株的长期维持，可在培养板中添加四环素（12.5 μg/ml）以实现Tn10转座子对细菌RNAse III基因的失活。
      4. 让培养基在室温下静置过夜固化。注意：平板应置于生物安全柜内或实验室中不易受污染的区域。同时，去除盖子上积聚的冷凝水。例如 用纸巾擦拭干净）以减少真菌污染。如果培养基中添加了四环素，则需用铝箔包裹培养皿，因为该抗生素具有光敏感性。
      5. 第二天，将干燥的NGM平板接种于悬浮液中 E. coli （OP50 菌株；见第 1.1.2 节）并轻轻涡旋混匀。为制备交配用平板，添加 ∼50 μ在每块平板中央加入适量OP50（形成一个小圆圈）。为制备用于维持线虫品系的平板，需在每块NGM平板上接种OP50。 ∼100-200 μl OP50（以确保其覆盖平板更大的区域）。
      6. 将接种好的平板在室温下干燥过夜。
      7. 第二天，将干燥的NGM平板倒置，并叠放在塑料储存容器中，于4℃保存 °C. 注意：培养皿最多可使用至 ∼3-4 周。含四环素的培养皿应避光保存。
    2. 食物
      1. 使用 E. coli OP50 [来自 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC；http://www.cbs.umn.edu/cgc）] 作为食物来源用于 C. elegans 注意：OP50 可以以甘油菌形式储存于 -80 °C（体积比1:1，50% v/v甘油）
      2. 为NGM平板制备OP50时，使用甘油保存菌种的小量 aliquot 制作划线平板（<10 μl；使用无菌移液器吸头）。将细菌涂布于LB琼脂平板（试剂/材料表中提供配方），并在37 °C 培养约 16 小时。注意：若出现污染问题，可使用链霉素抗性的 OP50 菌株，并在 LB 琼脂平板中添加链霉素（50 μg/ml
      3. 第二天，挑取单菌落，接种于500 ml锥形瓶中的100 ml液体LB培养基（试剂/材料表中提供配方）中。
      4. 37℃过夜培养 °C，振荡。
      5. 第二天，使用该细菌悬液接种NGM平板。注意：OP50可分装至50 ml锥形管中，于4 ℃保存 °C 为 ∼4-6 周
  2. RNA干扰
    饲喂是进行RNA介导的干扰（RNAi；用于敲低特定基因产物）的主要方法之一 秀丽隐杆线虫 秀丽隐杆线虫 雌雄同体可被喂食 大肠杆菌 HT115 菌株经转化携带一种诱导后可表达 dsRNA 的饲喂载体。该 dsRNA（或其片段）可传递至生殖腺，通常导致特定基因靶点的显著敲低。
    1. RNAi 平板
      1. 按照上述方法制备NGM平板（见第1.1.1节），但还需添加1 ml 1 M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷；用于诱导dsRNA表达）和500 μ50 mg/ml 氨苄青霉素（Amp；表达dsRNA的载体具有氨苄青霉素抗性）溶液，加入至预热的培养基（45–50 ℃）中 °C）。
      2. 平板干燥后，接种约50-100 μl 的 E. coli HT115（见第1.2.2节）。注意：未接种的平板可在4℃保存 °约 4-5 周
      3. 将接种好的平板在室温下静置过夜干燥。
      4. 第二天，将干燥的RNAi平板倒置，放入塑料储存容器中，在15-20℃保存 °C. 注意：接种的培养板在长达 ∼2-3 周
    2. RNAi 食品
      1. 使用 E. coli  HT115（来自CGC；见第1.1.2节），转化有喂养载体L4440，或含有目的基因cDNA的L4440。注意：已构建并提供可靶向基因组中大多数开放阅读框的喂养文库（克隆于L4440中并转化至HT115中） 例如包含来自 Y49E10.19 的一段片段 ani-120-21；http://www.gurdon.cam.ac.uk/~ahringerlab/pages/rnai.html）。注意：HT115 可以以甘油菌形式保存于 -80 °C（体积比1:1，50% v/v 甘油）
      2. 要构建靶向目的基因的新质粒，请参考 L4440 载体图谱，将 cDNA 克隆至两侧 T7 启动子之间，该启动子可由 IPTG 诱导。
      3. 使用标准转化方案将L4440质粒转化至HT115菌株中（例如 制备化学感受态细菌并进行热激转化。
      4. 如OP50所述（见第5节） 1.1.2）从甘油菌种中挑取细菌，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上划线培养 μg/ml 氨苄青霉素。注意：如果使用已有的 L4440 载体，跳过以下部分 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. 挑取单菌落，接种于5 ml含有5的LB培养基中 μ从50 mg/ml的氨苄青霉素储备液中加入l（LB Amp），置于37℃ °C，振荡。
      6. 约16小时后，用50 μl菌液接种5 ml新鲜LB氨苄青霉素培养基 μO/N 培养物的培养并在 37 ℃ 振荡培养 7–8 小时 °C.
      7. 将细菌在 4,000–8,000 × g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 μ新鲜LB氨苄青霉素培养基的升数
      8. 使用该细菌溶液按照上述方法接种RNAi平板（参见第节） 1.2.1）。注意：HT115 应立即使用，不得储存。

2. 线虫品系的培养

维持 秀丽隐杆线虫 根据标准方案，从CGC订购的菌株接种于NGM平板上1本方案所用菌株包括： 秀丽隐杆线虫 布里斯托尔野生型（CGC 菌株编号 N2）； unc-119(tm4063)；wgIs102 [ham-1::TY1::EGFP::3xFLAG + unc-119（+）]（CGC 菌株编号 OP102）； unc-119(ed3); ltIs44pAA173 [pie-1p-mCherry::PH(PLC1δ1) + unc-119(+)]（CGC OD70 菌株编号）； ajm-1(ok160)；jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)]（CGC 菌株编号 SU159）； unc-119(ed3)；xnIs96 [pJN455(hmr-1p::hmr-1:GFP::unc-54 3’非翻译区 + unc-119（+）]（CGC 菌株编号 FT250）。

  1. 挑选约3只表现正确表型的年轻成年雌雄同体个体转移至新鲜的NGM平板。注意：N2（Bristol品系；野生型）可在15–25℃之间培养 °C，但在较高温度下会更快达到密度。当线虫密度较高时，应制备新的培养物。
  2. 保留所有荧光菌株（例如 表达GFP和/或mCherry的线虫）在20-25 °C 以实现荧光蛋白的最佳表达。当线虫密度较高且食物较少时，应制备新的线虫品系。
  3. 使用一端熔接铂金丝的拉制玻璃毛细管（长约3-5 cm）作为挑虫工具。用光滑边缘将铂金丝末端压平。用该工具“舀取”雌雄同体线虫并转移至新培养板。每次使用前后将铂金丝过火灭菌，以避免不同品系间的交叉污染。

3. RNAi

  1. 进行RNA干扰实验
    1. 首先，将约8只L4期雌雄同体线虫置于未接种的NGM平板上，静置约30-60分钟 分钟 去除线虫中的OP50细菌。
    2. 然后将8只雌雄同体线虫转移至已铺有HT115菌液的NGM Amp IPTG平板上，该HT115菌株含有L4440质粒，可表达针对目标基因的dsRNA（例如. ani-1；参见步骤1.2）约24小时。注意：根据目标基因或所需表型（可能取决于基因敲低效率），线虫在RNAi平板上的培养时间可适当缩短或延长（24小时后，需将雌雄同体转移至新的RNAi平板上）。
    3. 作为阴性对照，将线虫放置于接种了携带空L4440载体的HT115菌株的RNAi平板上。注意：这些胚胎应无任何表型。
    4. 作为阳性对照，将线虫放置于表达靶向具有明确表型特征基因的dsRNA的RNAi平板上。注意：对于 rho-1 (Y51H4A.3) 胚胎在 24 小时后完全致死，雌雄同体在 48 小时后不育。
  2. RNAi 效率
    应检测RNAi的敲低水平，特别是因为某些组织可能比其他组织更具抗性。在胚胎发育早期至中期，大多数组织对RNAi敏感，但在晚期胚胎或幼虫中，神经元对RNAi具有抗性。可使用不同品系以提高RNAi敏感性（例如：rrf-3），或生成组织特异性的RNAi（例如：sid-1 与神经启动子表达的转基因联合使用 unc-119).
    1. 蛋白质印迹法
      使用免疫印迹法 秀丽隐杆线虫 蛋白质可按照标准方案进行操作22.
      1. RNAi处理后，收集约10只性成熟雌雄同体（体内充满胚胎）线虫至微量离心管中，加入20–30 μl 1x SDS-PAGE 上样缓冲液重悬样品，沸水浴中裂解约 2 分钟。同样，另取一管收集 N2 线虫作为对照样品。注意：雌雄同体线虫的数量可能因一抗的敏感性不同而有所差异。
      2. 制备对照样品的稀释液（例如 3-100%) 加入上样缓冲液中。将对照组和RNAi样本按标准方案进行SDS-PAGE电泳（凝胶浓度根据目标蛋白的大小选择）。
      3. 将凝胶转移至膜上，并按照标准方案进行免疫印迹。注意：针对每种抗体，应使用其推荐的不同一抗和二抗稀释比例。
      4. 显影（Develop）例如 （如果使用化学发光）或扫描（例如 如果使用荧光检测法，对免疫印迹进行成像，并比较 N2 样品泳道与 RNAi 样品泳道中条带的密度，以确定基因敲低水平（例如 RNAi 条带的密度与 12% 对照条带相当，这表明蛋白水平降低了 88%。注意：要观察效率 ANI-1 敲低，参见 Maddox 等23
    2. 免疫染色
      免疫染色在 秀丽隐杆线虫 可按照标准方案进行22.
      1. RNAi处理后，收集产卵期的雌雄同体并采用以下两种方法之一收集胚胎。其中一种方法为：将雌雄同体置于含M9缓冲液（试剂/材料表中提供配方）的1.5 ml硅化微量离心管中，通过离心（1,000–4,000 × g）沉淀虫体。注意：同样方法收集N2品系的产卵期雌雄同体。
      2. 移除 M9 溶液。
      3. 加入1 ml漂白液（1 M NaOH，5% 次氯酸钠）至微量离心管中，孵育3分钟以排出胚胎。同样地，对N2雌雄同体进行漂白处理以制备对照玻片。
      4. 轻轻涡旋混匀，随后立即通过离心（4,000–8,000 × g）沉淀胚胎，并移除漂白液。注意：线虫与漂白液孵育的总时间不应超过5分钟。
      5. 用玻璃巴斯德吸管将胚胎用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS；50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤3次，并将胚胎转移至经多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。注意：对玻璃载玻片进行多聚-L-赖氨酸包被时，先擦拭载玻片，然后滴加一滴（约20–30 μL）多聚-L-赖氨酸溶液 μl）的多聚-L-赖氨酸，均匀铺展于表面，待其干燥。为获得最佳效果，再重复包被两次。另一种收集胚胎的方法（第部分 3.2.2.1-3.2.2.5）将一滴M9溶液置于经多聚赖氨酸包被的显微镜载玻片上，挑取约10条成年雌雄同体线虫放入液滴中。
      6. 在每张载玻片上加一片盖玻片（覆盖含有大部分胚胎的区域），并将载玻片置于液氮中。注意：对于直接放入液滴中的雌雄同体样本，需对盖玻片施加压力，以破裂雌雄同体并释放出胚胎。
      7. 将盖玻片在液氮中冷冻后立即弹掉，以实现胚胎的冻裂。
      8. 将载玻片置于冰冻甲醇中固定20分钟以固定胚胎。注意：对于某些抗原，使用交联性固定剂（如多聚甲醛）可能更为合适。参见Duerr的实验方案22.
      9. 通过在吐温-20 缓冲 Tris 盐水（TBST；50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）中清洗 4 次，每次 10 分钟，使胚胎复水并通透化  每个。
      10. 用疏水笔在载玻片上胚胎最集中的区域周围画圈，并将该区域周围吹干例如 PAP笔
      11. 加入约100 μ加入1毫升含5%正常驴血清（NDS；封闭剂）的TBST至每张载玻片（圈出区域），室温孵育20分钟。注意：将载玻片置于“湿盒”中（例如 带盖培养皿（内含湿润的纸巾）。
      12. 移除阻断物，加入约50-100 μl 加入用 TBST 稀释的一抗溶液至每张切片（圈出区域），室温孵育 2 小时。注意：根据抗体的不同，稀释比例和孵育时间可能有所变化。检测 GFP 时，我们使用 1/200 稀释的抗小鼠抗-GFP 一抗。用于检测 ANI-1，我们使用1/1600稀释的兔抗ANI-1一抗（由北卡罗来纳大学教堂山分校Amy Shaub Maddox惠赠）。若需延长孵育时间，将载玻片置于4 °C.
      13. 移除一抗（如有可能，保留以备后续使用），用 TBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
      14. 去除最后一次洗涤，加入约50–100 μ向每张切片（圈出区域）加入次级抗体（用TBST稀释）并室温孵育2小时。注意：根据抗体不同，稀释比例可能有所变化。检测GFP时，使用1/250稀释的抗小鼠Alexa Fluor 488次级抗体；检测ANI-1时，使用1/250稀释的抗兔Alexa Fluor 568次级抗体。
      15. 除去二抗，用 TBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。注意：如需染色 DNA，加入约 50–100 μDAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；1 mg/ml）用TBST按1:500稀释，孵育5分钟。
      16. 除去 DAPI，用 TBS 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。注意：若未进行 DAPI 染色，可跳过此额外洗涤步骤。
      17. 用 0.1 M Tris（pH 9）快速洗涤一次，弃去液体并加入约 15 μ37℃预热的封片剂的量 °C（4% 正丙基 3,4,5-三羟基苯甲酸酯（没食子酸丙酯）、50 mM Tris（pH 9）、50% 甘油）加入至每张载玻片（圈出区域）。
      18. 向每张载玻片（在圈出区域的封片剂上）加盖盖玻片，用滤纸吸去多余液体，并用指甲油封片。注意：载玻片可于 -20 ℃ 避光保存 °C.
      19. 使用宽场荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察载玻片上的胚胎。重要的是，需先利用对照组（N2 或非 RNAi）胚胎调整成像参数，以获得最佳像素强度的图像，随后在相同参数设置下采集 RNAi 胚胎的图像。以下为对照组胚胎成像示例 vs. ani-1 RNAi 胚胎如图所示 图2B.

4. 活体成像用玻片的制备及胚胎的收集

  1. 用于活体成像的琼脂糖垫制备
    1. 将一块干净且预热的显微镜载玻片置于另外两块载玻片之间，每侧载玻片上贴有1-2条胶带。
    2. 使用玻璃巴斯德吸管，向载玻片上加入一滴2% w/v的琼脂糖溶液（溶于加热的蒸馏水中）。
    3. 迅速将另一块干净的显微镜载玻片垂直盖在第一块载玻片上，以压平琼脂糖液滴。注意：邻近载玻片上的胶带决定了垫层的厚度。
    4. 让琼脂糖垫干燥1-2分钟，然后小心移除上层载玻片，避免破坏下方的琼脂糖垫。注意：有时垫层会转移到上层载玻片上，只要保持完整仍可使用。
    5. 在制备后数分钟内将胚胎转移至琼脂糖垫上（见步骤4.2）。注意：垫层应呈不透明状； 一旦变得透明，则过于干燥而无法使用。
  2. 胚胎收集
    1. 采用以下方案收集用于活体成像的胚胎，该方案源自Sulston et al.24
    2. 从NGM或RNAi平板上挑选约4-6只未饥饿的成年 gravid 蠕虫，放入凹面载玻片的孔中，加入20-30 μl M9缓冲液。
    3. 使用灭菌手术刀在精囊两侧（或阴门附近）切开蠕虫，使胚胎释放到溶液中。
    4. 将连接有吹吸管（拉制为细口径）的橡胶管通过口吸方式吸取胚胎。或者，使用连接巴斯德吸管橡胶头的毛细玻璃管收集胚胎。
    5. 将吸出的胚胎转移至另一个含有M9缓冲液的孔中，以帮助将其与蠕虫残骸分离。
    6. 随后，将胚胎吸至新制备的琼脂糖垫上（见步骤4.1）。
    7. 使用粘附在牙签上的睫毛毛将胚胎聚集成簇，以增加可在同一x, y平面上拍摄的胚胎数量。注意：为避免缺氧，每次聚集的胚胎数量不应超过10个。
    8. 接着，用盖玻片覆盖载玻片，并用预热的液态VALAP（石蜡油、羊毛脂和石蜡按1:1:1比例熔融混合）部分封边，以防止成像过程中胚胎脱水。注意：可向垫上添加额外的M9缓冲液，以确保胚胎有足够的液体用于成像。也可使用石蜡油代替VALAP进行部分封固，但其刚性较差，可能导致盖玻片滑动并污染显微镜物镜。

5. 活体成像

  1. 为了观察神经母细胞，获取一种表达与荧光蛋白融合的神经母细胞特异性蛋白的线虫品系（例如 HAM-1:GFP，CGC 菌株编号 OP102)。为检测细胞膜，需使用一种同时表达可识别脂质的蛋白结构域并连接另一种荧光蛋白的线虫菌株。例如mCherry:PH，菌株编号 CGC OD70
  2. 从对照组或处理组的荧光雌雄同体线虫中收集胚胎 ani-1 个RNAi平板（参见方案3和4），并按上述方法制备载玻片（参见方案4）。
  3. 使用落射荧光显微镜以四维（x、y、z 和时间推移）成像胚胎。可采用宽场成像系统［配备 GFP 和 TexasRed 滤光片的自动化荧光显微镜，物镜放大倍数最高达 60X 或 100X，高分辨率 CCD（电荷耦合器件）相机，高度电动化的载物台（例如压电Z轴）和专用采集软件] 或活体扫描扫场共聚焦显微镜 [自动荧光扫描显微镜，配备488 nm和561 nm激光器，物镜最高可达100倍，EMCCD（电子倍增CCD）相机，高度电动化载物台例如 压电Z轴）和专用采集软件]。注意：对于宽场成像系统，使用LED光源和EMCCD相机可降低光毒性。此外，也可使用转盘共聚焦显微镜替代扫场系统。
  4. 要在任一系统上对神经母细胞分裂进行成像，使用10X或20X物镜找到胚胎的x、y视野，并选择一个胚胎正在进行背侧嵌合（腹侧封闭前一步骤）的合适x、y视野； 图1A）或处于腹侧封闭的早期阶段（∼350 分钟 第一次细胞分裂后； 图1A).
  5. 在扫场显微镜上，使用488 nm和561 nm的100 mW激光器，功率设为40%，狭缝宽度为50。在宽场成像系统上，使用GFP和TexasRed滤光片，光照强度设为低至中等（若可调节）。注意：对于宽场成像系统，LED光源光毒性较低，更为理想。
  6. 在任一系统上，使用60X或100X油镜物镜，采集20个Z轴层扫图像，步长为0.2 μ每2分钟采集一次，共10分钟。注意：尽管HAM-1:GFP和mCherry:PH探针的表达水平相对较高，但每种探针的曝光时间需根据不同显微镜系统进行优化。注意：对于宽场成像系统，建议减少Z轴层厚以降低光毒性；若需进行较长时间的活体成像，应减少时间点的采集数量。
  7. 为尽量减少胚胎在宽场显微系统下因暴露于紫外光（若使用汞灯）而产生的光毒性，应将光圈关闭至30%，并降低光照强度（使用可调节照明系统）。注意：尽管使用上述两种系统均无需增益（gain），但其他显微镜可能配备强度较低的光源或数值孔径不同的物镜，可能需要使用增益以获得最佳像素强度的图像。应使用对照胚胎测试成像条件，确保所观察到的表型并非由人为光毒性所致。

6. 显微镜数据的分析

  1. 为分析图像，将文件导出为TIFF格式，并使用专业软件（例如基于Java的图像处理程序）将TIFF文件作为图像栈打开例如 ImageJ，NIH，http://rsbweb.nih.gov/ij/）。注意：根据采集图像所使用的成像软件，文件可保留其原始格式并在 ImageJ 中直接打开。建议采用此方式，以便保留文件中的元数据。
  2. 将图像序列拆分为单个“图像”，并根据需要选择时间点和Z平面。注意：尽管采集了20个Z平面的图像序列，但许多神经母细胞位于其中 <1 μ在中晚期胚胎发育过程中厚度为 m，仅需少数几个 Z 平面。
  3. 为每个时间点重新叠加选定的Z平面，并分别生成Z轴投影图像。然后，将各时间点的投影图像叠加在一起，形成时间序列。
  4. 调整每个通道的亮度和/或对比度。
  5. 然后，选择一个感兴趣区域，裁剪该区域（如有必要可进行旋转）。
  6. 使用“合并通道”功能创建合并图像，并为每个通道选择不同的颜色。将合并后的图像转换为RGB模式。
  7. 将各通道的灰度图像从步骤中反转 6.3 或 6.4（在“编辑”下使用“翻转”功能）以更清晰地显示图像。
  8. 将所有最终图像保存为8位TIFF格式，用于在基于矢量的软件程序中制作图表，或保存为Quicktime文件以制作视频。
  9. 如果需要测量像素大小（例如 使用 ImageJ 或其他图像处理软件测量胚胎大小（若需在图像中添加比例尺）。注意：使用不同物镜采集的图像，其像素大小不同。

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结果

本实验方案描述了如何对细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 胚胎发育中期的胚胎。特别是，本文描述了如何对神经母细胞进行成像，这些神经母细胞可能促进表皮形态发生。表皮形态发生是由于表皮细胞形状改变、迁移和黏附共同作用的结果，但也依赖于下方神经母细胞提供的化学或机械信号。图1B神经母细胞分泌引导信号，由腹侧表皮细胞表面的受体接收，从而调控这些细胞的迁移10,14,25此外，神经母细胞具有高度增殖性，这种增殖可能产生机械力，从而促进腹侧表皮细胞的迁移。26该方案可用于研究中期胚胎发育过程中的神经母细胞分裂。首先，构建共表达标记物的胚胎，以观察正在进行胞质分裂的神经母细胞（HAM-1:GFP 和 mCherry:PH）。HAM-1:GFP 表达一种绿色荧光蛋白（GFP）标记的蛋白，该蛋白定位于神经母细胞的细胞核27，且在胚胎发育中期存在许多其他细胞类型，因此必须使用>300 个细胞； 图3）。由于DNA在有丝分裂期间会凝缩成染色体，因此这一特征也可作为细胞分裂的良好标记。mCherry:PH是一...

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讨论

本方案描述了利用多种显微镜技术对中期胚胎发育过程中细胞分裂进行成像的方法。特别地，本方案重点介绍了如何对神经母细胞（可能参与表皮形态发生的细胞）的分裂过程进行成像。在多细胞动物发育过程中，细胞间通讯对组织形成具有重要作用。 秀丽隐杆线虫 是研究组织形成的理想模型 体内一个能很好地体现组织间相互作用的事件是表皮形态发生，该过程通过一层上皮细胞覆盖胚胎。其中，腹侧封闭是指腹侧表皮细胞迁移以包覆胚胎腹面的过程，这一过程依赖于其下方的神经母细胞。神经母细胞提供化学或机械信号，若其位置发生改变，腹侧封闭将受到破坏。神经母细胞的数量（或极性）也可能对腹侧封闭的正常进行至关重要，因此理解调控其分裂的机制具有重要意义。本实验方案描述了如何在活体组织中对细胞分裂进行成像 秀丽隐杆线虫 共表达两种荧光探针的胚胎（mCherry:PH用于标记细胞质膜轮廓，HAM-1:GFP用于标记神经母细胞核）。
成像活体样本的最关键步骤 秀丽隐杆线虫 表达荧光探针的胚胎：i) 使用健康且年轻的表达目标荧光标记的雌雄同体成虫（在20–25 °C条件下培养），ii) 利用突变体或RNAi研究基...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此致谢，本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂BioShop Canada Inc.#AGR001.1用于制备 C. elegans NGM 培养基和 RNAi 培养板
琼脂Bio Basic Inc.#9002-18-0用于制备细菌 LB 琼脂平板
琼脂糖BioShop Canada Inc.#AGA001.500
抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11029
抗小鼠抗 GFP 抗体Roche Applied Science#11814460001
抗兔 Alexa Fluor 568 抗体Life Technologies Corporation (Invitrogen)#A11011
氨苄青霉素BioShop Canada Inc.#AMP201.5粉末储存于 4 °C，溶解后的氨苄青霉素储存于 -20 °C
Bactopetone （蛋白胨-A）Bio Basic Inc.#G213
CaCl2（氯化钙）BioShop Canada Inc.#C302.1
胆固醇BioShop Canada Inc.#CHL380.25溶于乙醇
DAPI Sigma-Aldrich#D9542用于核酸（DNA）染色
甘油BioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷）Bio Basic Inc.#367-93-1粉末及溶解后的 IPTG 储存于 -20 °C
KH2PO4（磷酸二氢钾）BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4（磷酸氢二钾）BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440 （饲喂载体）Addgene#1654以甘油菌形式保存于 -80 °C
MgSO4  （硫酸镁）BioShop Canada Inc.#MAG511.500
NaCl（氯化钠）Bio Basic Inc.#7647-14-5
Na2HPO4（磷酸氢二钠）Bio Basic Inc.#7558-79-4
正常驴血清（NDS）Wisent Bioproducts#035-110
n-丙基-3,4,5-三羟基苯甲酸酯（没食子酸丙酯）Alfa Aesar#A10877
聚-L-赖氨酸Sigma-Aldrich#P8920为获得最佳效果，需对显微镜载玻片进行三次包被 
链霉素BioShop Canada Inc.#STP101.50粉末储存于 4 °C，溶解后的链霉素储存于 -20 °C
四环素BioShop Canada Inc.#TET701.10粉末储存于 4 °C，溶解后的四环素储存于 -20 °C
Tween-20Bio Basic Inc.CAS#9005-64-5
胰蛋白胨BioShop Canada Inc.#TRP402.500
酵母提取物Bio Basic Inc.#8013-01-2

参考文献

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