方法文章

可视化的神经细胞胞质分裂过程中 C。线虫胚胎

DOI：

10.3791/51188

⸱

2014年3月12日

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

本文内容

摘要

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本协议描述了如何在图像秀丽隐杆线虫的胚胎组织中分裂的细胞。虽然一些协议描述了如何像细胞分裂在胚胎早期，这个协议描述了如何在图像中胚胎发育晚期一个发展中的组织内的细胞分裂。

摘要

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该协议描述了使用荧光显微镜的图像内开发秀丽隐杆线虫的胚胎分裂的细胞。特别是，这个协议的重点在于如何图像划分成神经细胞，这是发现了表皮细胞的下方和可以是用于表皮的形态很重要。组织的形成是后生动物发展是至关重要的，并依赖于外部线索来自邻近组织。C。线虫是一个很好的模式生物来研究组织形态发生在体内 ，由于其透明度和简单的组织，使得其组织容易通过显微镜来研究。腹侧外壳是其中胚胎的腹侧表面被上皮细胞单层的过程。此事件被认为是由底层的神经细胞，它提供化学品的指导线索进行调解覆上皮细胞的迁移提供便利。然而，成神经细胞是高度增殖和也可以充当作为机械基片的腹侧表皮细胞。使用此实验方案的研究可以在组织形成揭开间沟通的重要性，并且可以用来揭示发展组织中参与细胞分裂的基因的作用。

引言

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虽然有说明如何像细胞分裂初期C.协议线虫的胚胎，这个协议描述了如何像细胞分裂中期胚胎发育过程中组织内。其中一个在开发过程中的生物成像的主要挑战一直是他们的光毒性的敏感性。然而，增加无障碍旋转盘共聚焦显微镜或扫描显微镜领域已经允许更广泛的成像应用。这两个系统使用固态激光器和散射光，限制紫外线的生物体暴露于的电平。但是，广角台灯仍然可以用于成像在体内 ，尤其是当它们配备相机具有高灵敏度（ 例如 EMCCD），光圈控制和调光（ 例如发光二极管或可调汞灯泡）。本协议描述了如何使用一个基于共聚焦系统或宽视场系统，以图像的细胞分裂中开发C。线虫</ em>的胚胎。作为一个例子，我们介绍了如何像神经细胞的细胞分裂。神经母细胞可以促进表皮细胞的形态通过提供化学或机械的线索来覆表皮细胞，并提供了细胞间通讯在组织中形成的重要性一个很好的例子。

秀丽隐杆线虫是一种理想的模式生物，由于其透明度和简单的组织机构1显微镜为基础的研究。此外，C。线虫是服从遗传方法和RNAi，并且由于它的许多基因具有人同系物，它可用于鉴定保守机制，组织形成2-5。在C线虫 ，形成表皮层的过程中胚发生时，当胚胎有> 300个细胞。表皮形态包括几个主要阶段，在此期间，胚胎被封闭在一层表皮细胞的收缩和延伸，改造EMBR的哟从....

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方案

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1。为维护虫株及表演RNAi技术制备板的

  1. 线虫生长培养基平板
    1. 板
      1. 准备线虫生长培养基（NGM）板保持蠕虫病毒株，并进行遗传杂交。的合成将3克氯化钠，17克琼脂和2.5克细菌蛋白胨，用1升的蒸馏水在一个2升的烧瓶，并添加金属搅拌棒。
      2. 高压灭菌的烧瓶中溶解的琼脂和灭菌介质。然后将烧瓶在搅拌盘，并允许媒体，边搅拌边冷却。
      3. 一旦媒体已经冷却下来，还是有点温暖的触碰（45-50℃），加入1 ml 1米氯化钙 1毫升1米硫酸镁4，1毫升5毫克/毫升溶液中的胆固醇和25ml 1米磷酸钾缓冲液（PPB，配方表中试剂/材料;过滤消毒原液），并立即传媒倒入小培养皿（60毫米×15毫米，填补了菜〜3/4的顶端或13毫升/板USI纳克自动点胶机）。注意:对于长期维护的某些菌株四环素可被添加到板（12.5微克/毫升），使细菌的RNA酶III基因的Tn10转座子灭活。
      4. 让媒体固化在室温下过夜。注:钢板应保持在生物罩或在实验室中是不容易污染的区域。此外，删除已建立的盖子（ 如清洁用纸巾）来限制真菌污染的任何凝结。如四环素也被添加到板，然后盖上他们用铝箔作为这种抗生素是光敏感。
      5. 第二天，种子干燥NGM板与大肠杆菌中的悬浮液大肠杆菌 （OP50应变，见1.1.2节）已经轻轻涡旋。为了使板进行交配，增加约50μlOP50，以每块板的中心（形成一个小圆圈....

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结果

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该实验方案描述了C。如何像细胞分裂线虫在胚胎发育中的胚胎。特别地，它描述了如何图象的成神经细胞，其可以促进表皮细胞的形态发生。表皮形态发生是由于表皮细胞形状的变化，迁移和黏附，而且还依赖于化学或机械线索来自相关神经母细胞（ 图1B）的组合。在神经母细胞分泌接收由受体腹表皮细胞，从而调节他们的迁移10,14,25的表面上的指导线索。此外，成神经细胞是高度增殖性，其可提供有助于腹面表皮细胞26的迁移的机械力。此协议可用于在胚胎发育中期，研究神经细胞的细胞分裂。首先，胚胎共表达标记，以可视化的神经母细胞生成:（PH值的mCherry）（HAM-1 GFP）进行胞质分裂。 HAM-1:GFP表达GFP（绿色荧光蛋白）标记的蛋白质，定位于神经母细胞的核27，并且有必要使用，因为有存在于中胚许多其他类型的细胞（> 300个细胞; 图3）。这也可以作为一个很好的标记分裂细胞中，由于DNA的有丝分裂过程中凝结成染色体。的mCherry:PH是受母体子（ 馅饼-1）

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讨论

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本协议描述在胚胎发育中的使用各类显微镜的图像细胞分裂。特别是，该协议强调了如何将图像的神经母细胞的分裂，细胞，可促进表皮形态。后生动物的开发和C在细胞间的沟通对组织形成重要线虫是研究在体内组织形成一个很好的模型。一个事件，很好地描绘组织的相互作用是表皮形态，它涵盖了胚胎一层上皮细胞。特别是，腹侧外壳是其中腹侧表皮细胞迁移到包围胚胎的腹侧表面上的过程中，并且依赖于相关的神经母细胞。在神经母细胞提供化学或机械提示，和腹侧外壳被破坏，如果成神经细胞的位置被改变。成神经细胞的数目（或极性）也可以是必不可少的发生腹外壳正确，并且要明白，规范他们的分裂机制是很重要的。本协议描述了如何像细胞分裂中使用C的活组织线虫胚胎同时表达两种荧光探针（的mCherry:PH值勾勒质膜和HAM-1:GFP标记神经细胞的细胞核）。
最重要的步骤，以图像C.生活线虫胚胎表达的荧光探针是:i）使用表达所需的荧光标记物的健康，年轻，成人雌雄同体（保持在20-25℃），ⅱ）使用突变体或RNAi过程中组织的形成来研究基因的要求，ⅲ）收集胚胎.......

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

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笔者想承认，这项工作是由加拿大自然科学和（NSERC）授予工程研究理事会的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂BioShop 加拿大公司#AGR001.1用于制作 秀丽隐杆线虫 NGM 和 RNAi 板
AgarBio Basic Inc.#9002-18-0用于制作细菌 LB 琼脂平板
AgaroseBioShop Canada Inc.#AGA001.500
抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体Life Technologies Corporation （Invitrogen #A11029
抗小鼠抗 GFP 抗体Roche Applied Science#11814460001
抗兔 Alexa Fluor 568 抗体Life Technologies Corporation （Invitrogen）#A11011
氨苄青霉素BioShop Canada Inc.#AMP201.5将粉末储存在 4 °C 和 -20 ° 溶解的氨苄青霉素;C
细菌酮 （蛋白胨-A）生物基础公司
CaCl2（氯化钙）BioShop Canada Inc.#C302.1
胆固醇BioShop Canada Inc.#CHL380.25溶于乙醇
DAPI Sigma-Aldrich#D9542用于核酸 （DNA） 染色
GlycerolBioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG（异丙基硫基-β;-半乳糖苷）Bio Basic Inc.#367-93-1将粉末和溶解的 IPTG 储存在 -20 °C;C
KH2PO4（磷酸钾，一元）BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4（磷酸钾，二元）BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440 （喂养媒介）Addgene#1654保持甘油原液为 -80 °C
MgSO4  （硫酸镁）BioShop 加拿大公司#MAG511.500
NaCl （氯化钠）Bio Basic Inc.#7647-14-5
Na2HPO4 （磷酸钠，二元）Bio Basic Inc.#7558-79-4
正常驴血清 （NDS）Wisent 生物制品#035-110
正丙基-3,4,5-三羟基苯甲酸酯（没食子酸丙酯）Alfa Aesar#A10877
Poly-L-赖氨酸Sigma-Aldrich#P8920为获得最佳效果，将显微镜载玻片涂布 3 次 
链霉素BioShop Canada Inc.#STP101.50将粉末储存在 4 °C 和 -20 ° 溶解的链霉素;C
四环素BioShop Canada Inc.#TET701.10将粉末储存在 4 °C 和 -20 ° 的溶解四环素;C
Tween-20Bio Basic 公司CAS#9005-64-5
胰蛋白胨BioShop Canada Inc.#TRP402.500
酵母提取物Bio Basic Inc.编号 #8013-01-2
#G213

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-81....

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标签

RNA

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