采用造血祖细胞过继转移法评估派伊尔集合淋巴结中鼠源浆细胞样树突状细胞的发育

摘要

本方案描述了利用FACS介导的细胞分离、水动力基因转移以及Peyer氏斑中免疫细胞亚群的流式分析等技术，评估浆细胞样树突状细胞由共同树突状细胞前体在Peyer氏斑中分化过程的实验步骤。

摘要

本实验方案详细描述了一种分析纯化的造血祖细胞在肠道派伊尔集合淋巴结（PP）中生成浆细胞样树突状细胞（pDC）能力的方法。通过荧光激活细胞分选（FACS）从C57BL6小鼠骨髓中分离获得常见的树突状细胞祖细胞（CDPs，lin^- c-kit^lo CD115⁺ Flt3⁺），并将其转移至缺乏显著PP pDC群体的受体小鼠体内；在此实验中，选用Ifnar^-/-小鼠作为细胞转移的受体。在部分小鼠中，通过水动力基因转移（HGT）方法导入编码Flt3配体（Flt3L）的质粒，以在CDP过继转移前强制过表达树突状细胞生长因子Flt3L。Flt3L的过表达可扩增来源于转移（或内源性）造血祖细胞的树突状细胞群体。在祖细胞转移后7–10天，根据CD45标记物的表达情况，将来源于过继转移祖细胞的pDC与受体来源的细胞区分开来，其中来源于转移CDPs的pDC为CD45.1⁺，而受体小鼠细胞为CD45.2⁺。通过流式细胞术分析受体小鼠PP单细胞悬液，评估转移的CDPs对PP中pDC群体的贡献能力及其对Flt3L的响应性。该方法可用于检测其他祖细胞群体是否具有生成PP pDC的能力。此外，该策略还可用于研究预测会影响PP中pDC发育的因素的作用机制，例如通过转移经适当敲低、敲除或过表达假定发育相关因子的祖细胞亚群，和/或通过HGT调控循环细胞因子水平。该方法也可能用于分析PP中的pDC如何影响PP内其他免疫细胞亚群的频率或功能。本方法的一个独特之处在于使用Ifnar^-/-小鼠，这类小鼠的PP pDC数量相较于野生型动物显著减少，从而可在无需致死性照射的干扰条件下实现PP pDC的重建。

引言

本文展示了一种用于评估常见树突状细胞前体（CDPs）是否能够生成派伊尔集合淋巴结（Peyer's patch, PP）中浆细胞样树突状细胞（pDC）群体的实验方案。该方法的总体目标是评估pDC在派伊尔集合淋巴结（PP pDCs）中的发育调控机制。这一研究具有重要意义，因为PP中的pDC与其他组织（如骨髓、血液和脾脏）中的pDC存在差异，因此目前尚不清楚PP pDC与其他pDC群体在发育和/或功能上是否存在关联。具体而言，pDC被广泛认为是造血系统中主要的I型干扰素（IFN）产生细胞，能够通过Toll样受体7和9（TLR7/9）的刺激迅速分泌IFN^1-3。然而，PP pDC在受到TLR激动剂刺激时产生I型IFN的能力显著缺陷^4,5。此外，PP pDC在发育和/或积累过程中依赖于I型干扰素（IFN）受体（IFNAR1）或IFN信号分子STAT1的信号传导，这与骨髓和脾脏中的pDC也有所不同⁵。这些数据提示，PP pDC与其他器官（e.g. 骨髓、脾脏）中的pDC可能受到不同的调控机制控制⁵。

该方法的开发依据源于对树突状细胞（DC）生物学认知的最新进展。大多数（即使不是全部）DC亚群均来源于表达FMS样酪氨酸激酶3受体（Flt3）的造血祖细胞^6-10；然而，DC的发育并不局限于经典的髓系和淋巴系途径。例如，表达Flt3⁺的共同髓系祖细胞（CMPs，lin^- IL-7R^- Sca-1^- c-kit⁺ CD34⁺ FcγR^lo/-）可分化为CDP（lin^- c-kit^lo CD115⁺ Flt3⁺），后者进一步分化为浆细胞样DC（pDCs）和经典DC（cDCs）^9,10。相比之下，表达Flt3⁺的共同淋巴系祖细胞（CLPs，lin^- IL-7R⁺ Sca-1^lo c-kit^lo）主要分化为pDCs¹¹。因此，以往研究表明，在Flt3L调控下，pDCs至少来源于两种不同的造血祖细胞群体，尽管典型的研究通常局限于骨髓、脾脏和/或血液中的pDC亚群。因此，生成派伊尔集合淋巴结（PP）中pDCs的祖细胞群体尚需进一步研究。明确PP中pDCs的来源将有助于揭示它们是否与其他pDC群体共享共同的发育通路，或在PP中生成时采用独特的机制。

本文所述方法的一个独特优势在于使用在浆细胞样树突状细胞（pDCs）发育方面存在严重缺陷的PP小鼠作为造血祖细胞过继转移的受体。这些小鼠在编码IFNAR1的基因上存在遗传性缺失（Ifnar^-/- 小鼠）或 STAT1（Stat1^-/-) 显示PP pDCs显著减少⁵因此，这些品系提供了一个浆细胞样树突状细胞（pDC）减少的环境，使得可以在无需使用致死性照射等强烈细胞清除方案的情况下进行过继转移研究。本方法的另一个优势在于采用水动力基因转移（HGT）技术以促进循环中Flt3L水平的升高。该方法是一种经济有效的诱导Flt3L的策略。 在体内，相较于重组蛋白注射。大量研究（包括本实验室的研究）已采用水动力转染（HGT）在多种实验条件下诱导细胞因子的表达水平^5,12,13.

树突状细胞（DCs）的功能分工及其精确的免疫功能是免疫学研究中的重要课题。特别是浆细胞样树突状细胞（pDCs），在口服耐受和全身性抗病毒免疫反应中发挥着关键的介导作用，但它们似乎也参与了自身免疫性疾病和癌症的发生与发展^14-17。本文所述的实验方案将有助于更全面地探究调控派伊尔集合淋巴结（PP）中pDCs发育的分子机制。此外，该方法还可用于评估PP中pDCs的功能，并有望进一步拓展至研究PP内其他免疫细胞群体的调控机制与功能。

方案

在进行本文所述涉及小鼠的所有实验操作之前，必须事先获得机构批准。这些操作包括使用 C57BL/6 小鼠分离骨髓前体细胞， Ifnar^-/- 小鼠作为造血祖细胞过继转移的受体及利用HGT实现细胞因子过表达 体内. 研究人员或机构必须提供适当的动物饲养条件和护理。此外，对于用于水动力基因转移的质粒，可能需要获得机构的批准。即 重组DNA批准）。本文所述研究已获得MD安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会批准。

1. 水动力基因转移（HGT）

此步骤应在过继转移CDP前2天进行，以诱导循环中的Flt3L，从而在体内扩增DCin vivo⁵。每组至少准备5只受体小鼠。

1. 为了实现高效的HGT，应将受体 Ifnar^-/- 小鼠（CD45.2⁺）置于加热灯下照射5-10分钟，以扩张其血管。
2. 将小鼠放入固定装置中，并用70%乙醇对其尾部进行消毒。
3. 使用27 G 针头，在2 ml无菌PBS中注入5 μg编码Flt3L的质粒至尾静脉。对照组小鼠按相同方式经尾静脉注射5 μg空载体（pORF）。
4. 观察小鼠15-30分钟，确保尾静脉注射未引起不良反应。之后将小鼠送回饲养设施中饲养2天。

2. 小鼠骨髓中造血祖细胞的分离

此步骤应在同种异体造血干细胞移植（HGT）后第2天进行。使用同源CD45.1⁺小鼠作为骨髓前体细胞的来源，将细胞过继转移至受体Ifnar^-/- 动物（CD45.2⁺）。本实验方案中需使用同源品系，以区分供体与受体来源的树突状细胞（DCs），并避免因MHC不匹配导致的免疫介导性细胞耗竭。转移实验需要约10–20只小鼠，以提供足够数量的造血前体细胞（每只受体小鼠10⁵个细胞）。

1. 通过 CO₂ 窒息和颈椎脱位法处死 10 只同源 CD45.1⁺ 小鼠。
2. 将每只尸体置于解剖托盘上，并用 70% 乙醇对腹部和腿部进行消毒。
3. 在腹部中线处做一切口，并沿皮肤从腹部向每条腿剪开，沿腿部全长切开皮肤。
4. 轻柔地剥离每条腿的皮肤，并使用锋利剪刀在髋关节处剪下并移除腿部。
5. 使用锋利刀片小心剥离每条腿股骨和胫骨上的肌肉组织。
6. 用锋利的手术刀切除股骨和胫骨的两端，并将骨骼放入含有完全 RPMI 培养基（含 10% 热灭活胎牛血清、1% 青霉素/链霉素、1 mM 丙酮酸钠和 50 μM β-巯基乙醇的 RPMI 培养基）的培养皿中。
7. 准备一支含有 1 ml 完全 RPMI 培养基的注射器，连接 27 G 针头。
8. 将 27 G 针头插入股骨或胫骨的一端，通过缓慢注入完全 RPMI 培养基冲洗骨髓。确保骨髓细胞被充分冲出骨骼；可通过观察流出液体是否呈浑浊状态来判断。
9. 对每根股骨和胫骨重复冲洗 3 次，以彻底清除骨髓细胞。
10. 在培养皿中轻轻吹打细胞 3–5 次，制备单细胞悬液。
11. 将骨髓细胞通过 40 μM 细胞筛过滤，以去除碎片，并将滤出细胞收集至新的培养皿中。若筛网上出现细胞团块，可用无菌注射器活塞末端轻轻施压将其分散。
12. 根据制造商说明书，使用商用红细胞裂解缓冲液裂解总骨髓细胞悬液中的红细胞（RBC）。每 4–6 × 10⁷ 个细胞（通常为一只小鼠的细胞数）使用 2 ml 红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。
13. 通过离心（500 × g，4 分钟）沉淀骨髓细胞，轻柔吸除培养基，用 10 ml FACS 缓冲液（1× PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS）重悬细胞，再次离心沉淀细胞，然后轻柔吸除洗涤缓冲液。
14. 重复步骤 2.13 所述洗涤过程，共完成两次洗涤。

3. 荧光激活细胞分选（FACS）分离 CDPs

此步骤需要使用MidiMACS细胞分离仪和MACS LD柱进行初始的阴性筛选，以及配备至少3个激光器的流式细胞分选仪，用于在用荧光标记抗体染色后纯化多色前体细胞亚群。

1. 在步骤 2.14 的第二次洗涤后，计数骨髓细胞。按照步骤 2.13 所述方法通过离心收集细胞，并重悬于 FACS 缓冲液中，使最终浓度达到每 30 μl FACS 缓冲液含 4 × 10⁷ 个细胞。
2. 为进行 FACS 准备细胞，首先通过阴性选择技术富集谱系阴性细胞，该技术利用磁珠柱层析法从骨髓混合物中去除谱系阳性细胞。在阴性选择过程中，向 30 μl FACS 缓冲液中的细胞悬液中加入以下识别造血谱系标志物的商业化大鼠抗小鼠抗体（Abs）各 1 μg：CD3、CD19、CD11c、CD11b 和 Ter-119 抗体。每种抗体应以 2 μl/Ab 的体积加入细胞悬液中。
3. 将细胞悬液在 4 °C 下孵育 30 分钟。孵育结束后，按照步骤 2.13 所述方法用 10 ml FACS 缓冲液洗涤细胞两次。
4. 将细胞重悬，使最终浓度为每 40 μl FACS 缓冲液含 4 × 10⁷ 个细胞。每 40 μl 细胞悬液中加入 20 μl 羊抗大鼠 IgG 磁性微珠。轻轻混匀后在 4 °C 下孵育 30 分钟。按照步骤 2.13 所述方法用 10 ml FACS 缓冲液洗涤细胞。
5. 将最多 10⁸ 个骨髓细胞重悬于 500 μl FACS 缓冲液中。
6. 根据制造商说明，将 MACS LD 柱安装至 MidiMACS 细胞分选仪上，并用 2 ml FACS 缓冲液预冲洗柱子。
7. 将骨髓细胞悬液上样至柱中，最多可上样 2.5 ml FACS 缓冲液中的 5 × 10⁸ 个细胞。确保在柱子下方放置收集管（15 ml 锥形管）。用 2 ml FACS 缓冲液洗涤柱子 3 次，每次洗涤后收集流穿液，其中富含谱系阴性细胞。对从柱子中洗脱（流穿）的材料中的细胞进行计数。
8. 为通过 FACS 对造血祖细胞亚群进行阳性选择，使用以下荧光标记抗体对细胞进行染色：IL-7R（Pacific Blue）、Flt3（PE）、Sca-1（PE.Cy7）、CD115（APC）、c-kit（APC.Cy7）抗体，以及针对 CD3、CD19、CD11c、CD11b、F4/80 和 Ter119 的谱系标志物抗体混合物（均标记为 PerCP Cy5.5）。每种抗体使用 0.5–1 μl，总体积为 100 μl。将细胞悬液在 4 °C 下孵育 20–30 分钟。
9. 按照步骤 2.13 所述方法洗涤细胞，并重悬于 FACS 缓冲液中，浓度为每毫升含 2–3 × 10⁷ 个细胞。通过带有 35 μm 滤网帽的细胞滤器管过滤细胞，以去除细胞团块。此最后一步至关重要，可避免堵塞 FACS 仪器。
10. 将细胞悬液置于 FACS 管中，放入 FACS 仪器样品台，根据指定的标志物表达谱分选 CDP 细胞（lin^- c-kit^lo CD115⁺ Flt3⁺）。将纯化的细胞收集至含有 5 ml 完全 RPMI 培养基的 15 ml 管中。
11. FACS 分选结束后记录分选细胞的绝对数量。按照步骤 2.13 所述方法通过离心收集细胞，并重悬于无菌 PBS 中，用于过继转移实验。

4. CDPs 的过继性转移

此步骤通常在饲养受体小鼠的动物实验设施中进行。根据流式细胞分选仪的位置，可能需要在过继性转移前将纯化的前体细胞群体转运至动物实验设施。前体细胞悬液应保持无菌，并置于冰上运输。

1. 通过将10⁵个纯化的CDP稀释于100 μl无菌PBS中，制备用于注射的细胞悬液。将细胞悬液装入连接27 G 针头的注射器中。
2. 将受体Ifnar^-/-小鼠（CD45.2⁺）置于加热灯下5-10分钟，以利于经尾静脉进行有效注射。
3. 将小鼠放入固定装置中，并用70%乙醇消毒其尾部。
4. 使用27 G 针头，将10⁵个FACS纯化的CDP悬浮于100 μl PBS中，经尾静脉注射。
5. 观察小鼠15-30分钟，确保尾静脉注射未引起不良反应。之后将小鼠送回饲养设施。

5. 浆细胞样树突状细胞的分离及数量测定

1. 在过继转移后的第7至10天，处死受体小鼠。通过解剖轻轻打开小鼠腹腔，暴露肠道。
2. 取出整个肠道并置于含PBS的湿滤纸上。使用精细镊子和剪刀，沿小肠壁收集所有可见的派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PP）。C57BL6和Ifnar^-/-小鼠每只通常有5–10个PP，这些结构不同于沿小肠分布的孤立淋巴滤泡¹⁸。需注意，即使在同一小鼠体内，PP的结构也可能存在明显差异，因此应仔细识别并完整分离所有PP。
3. 将PP置于含有PBS的培养皿中，用镊子清除粪便残留物。重复此步骤两次，以彻底清洁PP组织。
4. 在50 ml锥形瓶中，用含1 mg/ml胶原酶IV的10 ml 1×Hank's平衡盐溶液（HBSS），于37 °C剧烈搅拌消化PP组织1小时。
5. 将消化后的PP组织转移至40 μm细胞筛上层，用无菌注射器活塞将细胞压过筛网。用15 ml离心管收集穿过滤网的PP单细胞悬液。
6. 以500 × g离心5分钟，沉淀滤过的PP细胞，并将细胞重悬于6 ml 37% Percoll溶液（37% Percoll溶于RPMI培养基）中。将6 ml 70% Percoll溶液（70% Percoll溶于RPMI培养基）轻柔地注入细胞悬液下方，形成37%/70% Percoll梯度分离液。
7. 以800 × g离心20分钟，离心机刹车设置为关闭。单个核细胞将富集于37%与70% Percoll液界面处。离心结束后，小心吸取界面层的单个核细胞。将收集的细胞以离心法沉淀，并用50 ml完全RPMI洗涤液清洗两次。使用大体积洗涤液以确保彻底去除Percoll。
8. 使用以下抗体对分离的PP细胞进行染色，以检测来源于过继转移前体细胞（CD45.1⁺）或受体小鼠自身（CD45.2⁺）的鼠源浆细胞样树突状细胞（pDC）：CD45.1（APC.Cy7）、CD45.2（PE.Cy7）、CD11c（Pacific Blue）、CD11b（PerCP Cy5.5）、B220（APC）、Siglec-H（PE）和PDCA-1（FITC）抗体。按照第3.9和3.10步所述进行流式细胞术分析。通过CD11c⁺ CD11b^- B220⁺ Siglec-H⁺ PDCA-1⁺表型鉴定pDC。PP中pDC的绝对数量可通过以下公式计算：% pDC × PP总细胞数 = PP中pDC数量。

结果

我们的结果展示了从小鼠骨髓细胞中分离CDP的门控策略（图1），具体步骤详见方案2和方案3。CDP约占骨髓总细胞的0.1%，每只小鼠可分离出约4-6 × 10⁴个CDP。在过继转移后，CDP可分化为pDC和cDC¹⁰。

图1. CDP的FACS分选策略。 从小鼠C57BL6的骨髓中收集骨髓细胞。使用MACS磁珠分...

讨论

本文所述的过继转移技术用于评估共同树突状细胞前体（CDPs）对缺乏派伊尔集合淋巴结浆细胞样树突状细胞（PP pDCs）的受体小鼠中PP pDC群体的贡献例如 Ifnar^-/- 小鼠）。在未来的实验中，评估其他前体细胞亚群在生成PP pDCs方面的潜力将非常重要，特别是PP pDCs是否来源于Flt3⁺ CLPs。这个问题具有重要意义，因为目前尚不清楚为何PP中的pDCs在PP聚集过程中对IFNAR-STAT1信号表现出独特的敏感性。⁵，以及PP pDCs是否遵循与其他器官中pDCs相似的发育信号。

理论上，该方法也可在所有器官均缺乏 pDC 群体的小鼠中进行。例如，缺乏转录因子 E2-2（即 pDC "主调控因子"）的小鼠（i.e. Tcf4^-/- 小鼠）表现出显著的 pDC 耗竭¹⁹。然而，Tcf4^-/- 小鼠具有胚胎致死性，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J	JAX	664
B6.SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
15 ml 圆锥形离心管	BD Biosciences	352095
50 ml 圆锥形离心管	BD Biosciences	352070
无菌手术镊
无菌小型剪刀
无菌大型剪刀
40 μm 细胞筛	BD Biosciences	352340
35 μm 细胞筛配套离心管	BD Biosciences	352235
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
FACS 缓冲液			PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS，过滤除菌
Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
胶原酶 IV	Worthington	LS004188
山羊抗大鼠 IgG 磁珠	Milteyni Biotec	130-048-501
LD 柱	Milteyni Biotec	130-042-901
大鼠抗 D3	BD Biosciences	555273
大鼠抗 CD19	BD Biosciences	553783
大鼠抗 CD11b	BD Biosciences	553308
大鼠抗 CD11c	BD Biosciences	553799
大鼠抗 Ter119	BD Biosciences	553671
抗 CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
抗 CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
抗 CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
抗 CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
抗 F4/80 (PerCP)	eBiosciences	45-4801
抗 Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
抗 Sca-1 (PE.Cy7)	eBiosciences	25-5981
抗 CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
抗 c-kit (APC.Cy7)	eBiosciences	47-1171
抗 IL-7R (Pacific Blue)	eBiosciences	48-1271
抗 Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
抗 CD45.1 (APC.Cy7)	BD Biosciences	560579
抗 CD45.2 (PE.Cy7)	Biolegend	109830
抗 CD11c (Pacific Blue)	eBiosciences	48-0114
抗 B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
抗 Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
抗 PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
细胞分选仪	BD Biosciences		例如 BD Fortessa
加热灯
小鼠固定器
1 ml 注射器	Becton Dickinson	309602
27½ G 针头（无菌）	Becton Dickinson	305109