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方法文章

利用4D共聚焦显微镜分析斑马鱼颅面形态发生

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DOI：

10.3791/51190

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2014年1月30日

 ,  , 
1Institute for Cell and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

本文内容

摘要

延时共聚焦成像是一种用于表征胚胎发育的有力技术。本文中，我们描述了该方法，并对野生型以及 pdgfra, smad5, 和 smo 突变胚胎。

摘要

延时成像是一种能够直接观察形态发生过程，即生物体形状形成过程的技术。由于斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性，并易于进行遗传操作，已成为在活体胚胎中开展形态发生延时分析的常用模式生物。对活体斑马鱼胚胎进行共聚焦成像时，需要使目标组织持续表达荧光标记物，例如转基因或注射染料。该过程要求将胚胎麻醉并固定，同时确保其发育保持正常状态。成像参数的设置需考虑胚胎的三维生长特性，并在分辨单个细胞与快速获取发育动态图像之间取得平衡。我们的结果展示了开展长期 体内 对荧光标记的斑马鱼胚胎进行成像，以检测颅神经嵴中导致颅面异常的不同组织行为。麻醉和固定所引起的发育延迟极小，且该过程不会对胚胎造成损伤。经延时成像的胚胎可返回液体培养基中，并在后续发育阶段再次进行成像或固定。随着转基因斑马鱼品系的日益丰富，以及谱系示踪和移植技术的成熟，对任何目标组织进行成像已成为可能。因此，延时 体内 成像技术与斑马鱼遗传学方法（包括对突变体和显微注射胚胎的分析）相结合，具有强大的优势。

引言

颅面形态发生是一个复杂的多步骤过程，需要多种细胞类型之间的协调相互作用。颅面骨骼的大部分来源于神经嵴细胞，其中许多细胞必须从背侧神经管迁移至称为咽弓的 transient 结构中1与许多组织一样，颅面骨骼的形态发生过程比通过特定发育时间点的胚胎静态图像所揭示的更为复杂。尽管该过程耗时较长， 体内 延时显微成像可连续观察发育中胚胎的细胞与组织。时间序列中的每一幅图像都为其他图像提供背景信息，有助于研究者推断相关生物学过程 为什么 一种现象发生，而非推断 什么 正在此时发生。

体内成像因此成为了解构引导形态发生通路的实验方法中一种强大的描述性工具。斑马鱼Danio rerio是研究脊椎动物胚胎发育的常用遗传模型，尤其适用于形态发生的体内成像。现代便捷的转基因与基因组编辑技术正迅速增加斑马鱼研究人员可用的工具数量，这些工具进一步增强了原本已十分成熟的遗传操作与显微成像方法。在几乎任何所需遗传背景下对几乎任何组织进行体内成像，正日益接近现实而非幻想。

咽弓的形态发生运动由神经嵴与邻近的上皮（包括外胚层和内胚层）之间的信号相互作用所引导。上皮表达多种对颅面骨骼结构形态发生至关重要的信号分子。在这些信号分子中，音猬因子（Sonic Hedgehog, Shh）对颅面发育具有关键作用2-8。Shh 在口腔外胚层和咽部内胚层中均有表达2,6,9,10。内胚层中 Shh 的表达调控咽弓的形态发生运动10、弓内神经嵴细胞的模式形成10以及颅面骨骼的生长11。

Bmp 信号通路对颅面发育也至关重要12，并可能影响咽弓的形态发生。Bmp 信号通路调控神经嵴细胞在咽弓内的背腹模式形成13,14。在斑马鱼中，smad5 基因的破坏会导致严重的腭部缺陷，以及麦克尔软骨在中线处无法正常融合15。此外，这些突变体还表现出腹侧软骨结构的减少和融合，其中第 2nd、第 3rd，有时还包括第 4th 咽弓结构在中线处发生融合15。这些融合现象强烈表明，Bmp 信号通路调控着这些咽部结构的形态发生。

Pdgf 信号通路对于颅面发育是必需的，但其在咽弓形态发生中的作用尚不清楚。小鼠和斑马鱼的 Pdgfra 突变体均表现出严重的中面部裂16-18。至少在斑马鱼中，这种中面部裂是由于神经嵴细胞迁移异常所致16。神经嵴细胞在进入咽弓后仍持续表达 pdgfra。此外，Pdgf 配体由面部上皮以及咽弓内部表达16,19,20，因此 Pdgf 信号通路也可能在细胞迁移完成后参与咽弓的形态发生过程。然而，目前尚未对 pdgfra 突变体中咽弓形态发生的发育过程进行分析。

在此，我们演示 体内 对咽囊期转基因斑马鱼进行共聚焦显微镜观察，并描述此期间咽弓的形态发生过程。我们进一步展示了受Bmp、Pdgf和Shh信号通路突变影响的组织行为。

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方案

1. 动物饲养与突变等位基因

  1. 按照文献21所述方法饲养和繁殖斑马鱼。
  2. 本研究中使用的斑马鱼突变等位基因为 pdgfra b1059 16、smad5 b1100 22 和 smob577 23。这些斑马鱼品系来源包括 ZIRC。

2. 溶液与实验用具的准备

注意：所有溶液和器械均可预先制备并储存以供后续使用。

  1. 按先前所述方法制备胚胎培养基（EM）21。
  2. 制备 4 g/L MS-222（Tricaine）。将 4 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶解于 450 ml 无菌水中。向溶液中加入 2 g MS-222。调节 pH 值至 7.0–7.2 范围内。用无菌水定容至 500 ml。
  3. 可选：制备 4 g/L 丁香油溶液。称取 0.2 g 纯丁香油至 50 ml 锥形管中，用 EM 定容至 50 ml。4 °C 保存。
  4. 制备 3% 甲基纤维素溶液。将 50 ml EM 与 0.1 M HEPES 混合加热至沸腾，移离热源。搅拌加入 1.5 g 甲基纤维素，直至溶液均匀。4 °C 保存。
  5. 制备 0.2% 琼脂糖溶液。将 0.1 g 琼脂糖加入 50 ml EM 中，在微波炉或加热板上加热至沸腾，并确认琼脂糖完全溶解。分装为每管 500 μl 至微量离心管中，4 °C 保存。注意：可根据需要调整体积。
  6. 制备毛细管穿刺针。在内径为 0.9 mm 的毛细管内滴加一滴强力胶。将一段 4–5 cm 长、承重 6 磅的单丝钓鱼线插入毛细管中，使线末端伸出管端约 3–4 mm。
  7. 为每个样品制备两个带桥接盖玻片。用强力胶将 22 × 22-1 盖玻片粘在 24 × 60-1 盖玻片的两端，中间部分保持空置。对于年龄小于 1 天的胚胎使用单层（每端一个小型盖玻片），1 至 4 天的胚胎使用双层（每端上下叠放两个小型盖玻片），5 天及以上胚胎使用三层（每端上下叠放三个小型盖玻片）。
  8. 用高真空润滑脂填充一支 10 ml 注射器。注意：真空润滑脂可作为密封剂，防止样品在长时间内脱水，且相较于易挥发的密封剂，其潜在毒性较低。

3. 共聚焦显微镜观察用斑马鱼胚胎的封片（见图1）

  1. 制备麻醉液。将一份0.2%琼脂糖置于微波炉中，每次加热20 秒，间歇融化直至完全呈液态。将8 µl MS-222加入192 µl的0.2%琼脂糖中，或在195 µl的0.2%琼脂糖中加入5 µl浓度为4 g/L的丁香油，混合均匀。将混合液置于42 °C加热金属块中保温。注意：在斑马鱼胚胎中，长期暴露于MS-222引起的发育延迟比丁香油更显著24。
  2. 如需要：在分析前手动去除待分析的未孵化转基因胚胎的卵膜。使用镊子缓慢撕开卵膜，直至胚胎完全释放。
  3. 麻醉斑马鱼胚胎。将1 ml浓度为4 g/L的MS-222母液加入24 ml胚胎培养液中。或者，将390 µl浓度为4 g/L的丁香油加入24 ml养鱼用水中24。注意：丁香油起效较慢，因此应在进行延时显微成像前至少15–20分钟完成此步骤。
  4. 在朝上放置的桥式盖玻片中央区域周围涂抹一圈真空脂。缓慢推动注射器，挤出均匀、连续的真空脂细线，使其紧邻并位于桥结构内侧及盖玻片边缘。
  5. 使用木制涂布棒在桥式盖玻片中央涂抹一圈4%甲基纤维素。
  6. 转移待成像胚胎。当胚胎处于麻醉状态时，用玻璃移液器将其吸入。将移液器垂直持握，使胚胎沉降至移液器内液体底部。将移液器移入琼脂糖溶液中，让胚胎自然落入琼脂糖内，切勿将液体吹出。
  7. 放置样品。用移液器吸取少量琼脂糖溶液及胚胎，将含有胚胎的琼脂糖液滴排至甲基纤维素上方。使用毛细管针将胚胎向下轻压至甲基纤维素表面，并调整胚胎至成像所需方向。
  8. 密封样品。
    1. 将另一片桥式盖玻片朝下覆盖在已固定的盖玻片上。对夹层盖玻片两侧施加均匀压力，直至桥结构完全接触，且琼脂糖液滴与上下两片盖玻片均密封贴合。确认胚胎已正确取向。
    2. 沿玻璃表面滑动木制涂布棒，抹平真空脂细线中的裂纹和缝隙，并擦去边缘多余油脂。

4. 转基因斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

（本方案已针对使用ZEN成像软件的蔡司LSM 710共聚焦显微镜进行优化，也可根据其他系统进行调整。）

  1. 启动设备。打开共聚焦显微镜及任何外部激光装置。开启连接共聚焦显微镜的计算机。启动共聚焦成像软件，并选择"启动系统"以激活图像采集控制功能。
  2. 准备加热载物台。降低共聚焦显微镜的载物平台，并将物镜移出工作位置。将默认载物台更换为电子加热载物台。打开加热载物台控制器，并将温度设定为 29.5 °C。
  3. 将样本置于视野中。将已固定的样本放置在载物台上。将 20X 物镜移入工作位置，并升起载物平台。启动可见光源，通过目镜观察，将胚胎头部置于视野中央。
  4. 设定实验参数。
    1. 通过选择待检测的荧光波长来激活荧光通道，并为每个通道选择颜色查找表（LUT）。如有需要，在软件中使用手动控制开启所需激光器（例如 561 nm 用于 RFP）。为每个荧光通道设置激光强度为 10.0，光电倍增管电压（HV 或增益）设置在 600–700 之间。将平均次数设为 4，位深度设为 16 位。
    2. 激活 Z 轴层扫和时间序列模块。将针孔设为实现 5 µm 或更小的 Z 轴分辨率，并将 Z 轴步进设为建议的最佳距离。
      注：通常，5 µm 的 Z 轴分辨率可使每个 Z 轴层扫图像在特定时间点快速采集，实现对胚胎的"快照"，同时分辨单个细胞。降低平均次数也可减少每幅图像的采集时间。
    3. 设定图像间所需的时间间隔（通常为 10–20 分钟）以及实验总时长。
  5. 设定位置信息。
    1. 将相机切换至实时模式。如有需要，调整焦距并提高激光强度以观察荧光信号。如需更宽视野，可将数字放大倍数设为 0.6。
    2. 调整载物台位置，确保所有感兴趣结构均可见，并在视野中为背侧和前侧的生长留出空间。通过胚胎上下层调整焦距，直至荧光信号的上下限清晰可见。将第一个和最后一个 Z 轴层扫切片位置设定在这些界限之外至少 100 µm 或更远。
  6. 优化荧光强度。
    1. 将显示 LUT 设为范围指示器。此时荧光结构应显示为白色，视野其余部分应为蓝色（无检测信号）或黑色。
    2. 将 HV/增益调至接近但未出现饱和（红色）像素的水平。如有需要，调整偏移量，使大部分背景不被检测（呈蓝色）。注：较小的针孔直径和较高的激光强度均可提高图像清晰度，但为保护活体组织，激光强度应保持较低。通常优先选择提高 HV/增益和增大针孔直径（<5 µm），而非提高激光强度。
    3. 保持针孔直径足够宽，以便及时采集图像，平均次数设为 4。Z 轴步进应始终根据针孔直径设置为建议的最佳距离。使用不同参数进行短时扫描（平均次数 = 1），并采用能达到所需分辨率的最低激光强度。
  7. 按预定时长运行实验。实验结束后，从加热载物台上取出胚胎，缓慢分离盖玻片。将盖玻片及胚胎浸入 EM 液体中，置于 30 mm 培养皿内。使用玻璃移液器轻轻将胚胎从盖玻片上冲洗下来，并将盖玻片移出培养皿。将胚胎放入 28.5 °C 培养箱中继续发育。
  8. 比较生长情况。实验结束时，对在实验开始时与实验样本发育阶段相似、但于 28.5 °C 培养箱中在 EM 中培养的琼脂糖固定同胞胚胎，采集单个 Z 轴层扫图像。
  9. 根据需要测量咽弓。部分共聚焦软件套件可进行测量。本文中的测量通过将单帧 .lsm 文件导入 Fiji25 并进行 Z 轴投影后完成。

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结果

在野生型胚胎中，随着神经嵴细胞的迁移，咽弓沿头尾轴和背腹轴伸长，并向头侧方向移动（影片1）。在受精后30小时（hpf），第一咽弓的头尾长度为其背腹高度的1.8至1.9倍。背腹向伸长持续稳定进行，且在36.5 hpf之前其速度超过头尾向延伸。此后，背腹高度在36.5 hpf至48 hpf期间趋于平稳，约为104 µm。头尾向延伸则持续至48 hpf，整体头尾长度从36.5 hpf时不足背腹高度的1.5倍增加至48 hpf时的1.95倍。

在前端，第一咽弓由口外胚层分隔为上颌（背侧）和下颌（腹侧）区域。第一咽弓的上颌区域从其远端尖端测量至口外胚层的后顶点。在30至48小时（hpf）期间，其生长速率通过线性回归估算为4.6 µm/hr（r2 = 0.9374），在48 hpf时长度约为104 µm（影片1）。

咽弓3-7均通过咽部内胚层对单一群神经嵴细胞的分节作用而形成26在30-38 hpf之间，5th

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讨论

延时共聚焦显微镜是分析发育过程的有力工具。在此，我们展示了该方法在研究重要信号通路突变的斑马鱼咽弓形态发生中的应用价值，实验中使用了一种可标记神经嵴细胞的转基因品系。除了组织水平的分析外，延时分析也适用于细胞尺度的研究28。许多常用的斑马鱼实验方法也可整合到延时显微成像实验中，包括显微注射吗啉代寡核苷酸（morpholinos）、mRNA 或转基因构建体，以及胚胎间的组织移植。对多种发育中组织的成像分析仅受限于组织荧光标记的能力，以及共聚焦显微镜在无串扰情况下检测所需数量不同荧光染料的能力。一次斑马鱼胚胎批次中可成像的个体数量受到严重限制，但先进成像技术可在相同时间内实现多个胚胎的自动成像。当需要对早期时间点难以识别的突变体进行延时分析时，这一技术尤为有用。

在对延时共聚焦图像进行测量时，需要注意该成像过程本身可能导致一定的发育延迟。突变体胚胎中也常出现发育延迟现象，因此无论是突变体或经处理的胚胎，还是野生型对照组，都必须同时成像其同胞对照样本。即使已对胚胎发育阶段进行了校正，荧光标记结构的比较测量仍然具有挑战性。荧光强度在不同个体之间以及同一结构的不同区域之...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢Melissa Griffin和Jenna Rozacky在鱼类饲养方面提供的专业帮助。PDM感谢EGN在写作方面的协助以及给予的慷慨与耐心。本研究工作由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）R01DE020884项目资助，项目负责人JKE。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 磅测试单丝线Cortland Line CompanySLB16
琼脂糖 IAmresco0710
氩离子激光器LASOS Lasertechnik GmbHLGN 3001
氯化钙Sigma-AldrichC8106
毛细管，100 mm，0.9 mm 内径FHC30-31-0
丁香油Hilltech Canada, Inc.HB-102
高真空润滑脂Dow Corning2021846-0807
Isotemp 干浴孵育器Fisher Scientific2050FS
激光扫描显微镜Carl Zeiss AGLSM 710
六水合硫酸镁Sigma-Aldrich230391
显微镜盖玻片，22 x 22-1Fisher Scientific12-542-B
显微镜盖玻片，24 x 60-1Fisher Scientific12-545-M
氯化钾Fisher ScientificM-11321
磷酸氢二钾Sigma-AldrichP3786
氯化钠Fisher ScientificM-11624
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS7907
TempController 2000-2PeCon GmbH
Tricaine-SWestern Chemical, Inc.

参考文献

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