使用4D共聚焦显微镜分析颅面形态的斑马鱼

Summary

时间推移共焦成像是一个强大的技术表征胚胎发育有益。在这里，我们描述的方法和表征颅面形态发生在野生型，以及PDGFRA，Smad5和与SMO突变体胚胎。

Abstract

延时成像是一种技术，它允许直接观察形态发生的过程中，或形状的生成。由于它们的光学清晰度和顺从遗传操作，斑马鱼的胚胎已经成为一种流行的模式生物与在活胚胎进行形态的延时分析。一个活斑马鱼胚胎的共焦成像要求的感兴趣组织的持续标记有荧光标记物，如转基因或注射染料。该过程要求的胚胎被麻醉并在这里以这样一种方式，健康发展继续正常进行。成像参数必须设置为占三维增长和平衡解决单个细胞，而得到发展的快速快照的需求。我们的研究结果表明，以荧光标记的斑马鱼胚胎的体内成像进行长期检测在不同组织行为的能力颅神经嵴造成颅面畸形。造成麻醉和安装发育迟缓是微乎其微的，而且胚胎是安然无恙的过程。时移成像胚胎可以在以后的发展点返回到液体培养基中，随后成像或固定。随着转基因斑马鱼线和良好的特点命运映射和移植技术，成像越来越丰盈任何需要的组织是可能的。因此，时间推移的体内成像结合有力地与斑马鱼基因的方法，包括突变体和显微注射的胚胎的分析。

Introduction

颅面形态发生是一个复杂的多步骤的过程，需要多种细胞类型之间协调的相互作用。大部分颅面骨骼是由神经嵴细胞来源，其中许多必须从背神经管迁移到被称为咽弓¹瞬态结构。与许多组织中，颅面骨骼的形态是不是可以通过胚胎在发育的特定时间点的静态图像理解更复杂。虽然它是耗时的执行， 在体内时间推移显微镜提供了一个连续的外观在发育中的胚胎的细胞和组织。在延时系列中的每个图像借给上下文别人，并帮助调查员走向推断，为什么出现一种现象，而不是演绎什么是发生在那个时候。

体内成像因此是一个功能强大的工具，描述实验方法解构，引导形态的途径。斑马鱼斑马鱼是脊椎动物胚胎发育的一个流行的遗传模式，并特别适于在体内成像形态的。现代，便利的方法转基因和基因组修饰突飞猛进提供给斑马鱼研究工具的数量。这些工具提升已经非常强大的方法进行基因操纵和显微镜。在几乎任何所需的遗传背景在体内几乎所有组织的成像更接近现实比幻想。

咽弓的形态发生运动是由信号的神经嵴和邻近的上皮细胞，两者外胚层和内胚层之间的交互引导。但是也有一些必要的驱动的颅面骨骼元素的形态由上皮细胞表达大量的信号分子。在这些信号分子，刺猬（嘘）是非常重要的f或颅面部发育^2-8。嘘是由口腔外胚层和内胚层咽^2,6,9,10均表示。....

Protocol

1。畜牧突变等位基因

1. 提高和斑马鱼的繁殖所描述的^21。
2. 在本研究中使用的斑马鱼突变体等位基因PDGFRA ^{b1059 16，SMAD5 B1100 22，}和SMO ^{B577 23。}来源这些斑马鱼品系包括ZIRC。

2。解决方案及器具的制备

注:所有的解决方案，并实现可预先和存储以供将来使用。

1. 使胚胎培养基（EM），如前所述^21。
2. 使4克/升的MS-222（三卡因）。溶解4克磷酸二钠（的Na ₂ HPO _4）在450ml的无菌水。加2克MS-222溶液中。内7.0-7.2调节pH至。加无菌水至500ml的总体积。
3. 可选:4克/升丁香油。权衡0.2克纯丁香油在50ml锥形管中。添加EM至50ml的总体积。贮存于4℃。
4. 使3％methylcellulo本身。把加入50ml的EM + 0.1 M羟乙基烧开。起锅。拌入1.5克甲基纤维素，直到溶液是均一的。贮存于4℃。
5. 使0.2％的琼脂糖。添加0.1克琼脂糖至50ml的EM。把EM烧开在微波炉或放在热板上并验证琼脂糖完全溶解。等分入微量离心管中并储存500μl的量在4℃下注意:根据需要体积可以进行调整。

Results

在野生型胚胎中，神经嵴人口下面，沿前/后和背/腹轴咽弓伸长移动时在一个方向喙（ 电影1）。在30小时后，受精（HPF），第一咽弓的前/后长度为1.8-1.9倍，其背/腹高度之间。背/腹伸长率稳步前进，比前/后延长至36.5 HPF更快。从这里，背/腹高高原各地的104微米至48 HPF。前/后继续延长至48个高倍视野，从低于1.5倍的背/腹高度36.5 HPF至1.95倍的背/腹高度在48 HPF整体前/后长度增加。

在其前端，第一咽弓形成上颌（背）和下颌骨的口腔外胚层分离（腹）域。第一咽弓的上颌域测量f它的rom远端尖端的口腔外胚层的后顶点。它生长于在4.6微米/小时（R ² = 0.9374）30-48 HPF之间近似为线性回归的速度和大约为104微米长，48个高倍视野（ 电影1）。

咽弓3-7从神经嵴细胞的单传经咽部内胚层²⁶分段的所有形式。 30-38之间的HPF，第五^次到7 ^.......

Discussion

时间推移共聚焦显微镜是一个强大的工具，用于发展的分析。在这里，我们验证了该方法的有效性学习咽弓形态中的斑马鱼突变体是采用转基因的标记的神经嵴细胞的重要信号通路。除了 ​​组织水平进行分析，时间流逝的分析也适用于分析在细胞尺度^28。许多广泛使用的斑马鱼的方法也可以被掺入到时间推移显微镜实验，包括显微注射吗啉代的，mRNA表达，或转基因构建体，以及胚胎之间移植。的多个显影组织分析仅由能力荧光标记的组织和由共聚焦显微镜的能力来检测不同的荧光基团的期望数目无串扰限制。可以从斑马鱼胚胎的离合器被成像的个体的数目受到严格的限制，但先进的技术允许几个胚胎在相同的时间段自动成像。求来执行，是不容易在早期时间点确定一个突变体的时间推移分析时，这是特别有用的。

当执行从时间推移共焦图象的测量，重要的是考虑某些发育延迟是由于该过程是很重要的。发育迟缓的情况并不少见的突变胚胎一样，所以兄弟控制的成像是必要的两个突变体/操纵胚胎以及野生型对照。甚至一度控制了分期，荧光标记的结构比较测量是困难的。荧光强度可以是个人之间以及同一结构的不同部分之间的高度变化。因此，非离散定量测量有一定程度的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 磅测试单丝线	Cortland Line Company	SLB16
琼脂糖 I	Amresco	0710
氩激光器	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
氯化钙	Sigma-Aldrich	C8106
毛细管，100 mm，0.9 mm 内径	FHC	30-31-0
丁香油	Hilltech加拿大公司	HB-102
高真空润滑脂	道康宁	2021846-0807
Isotemp 干浴培养箱	Fisher Scientific	2050FS
激光扫描显微镜	Carl Zeiss AG	LSM 710
硫酸镁六水合	Sigma-Aldrich	230391
显微镜盖玻片，22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
显微镜盖玻片，24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
氯化钾	Fisher Scientific	M-11321
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P3786
氯化钠	Fisher Scientific	M-11624
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S7907
温度控制器 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical， Inc.