在PDMS膜上拉伸微图案化细胞

摘要

本手稿介绍了一种利用单向拉伸对贴壁细胞或组织施加或释放力的技术。

摘要

施加在细胞和/或组织上的机械力在众多生物学过程中起着重要作用。我们开发了一种可拉伸接种于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜上细胞的装置，该装置兼容显微成像。该技术具有良好的可重复性和多功能性。PDMS膜可进行微图形化处理，以将细胞或组织限定于特定几何形状内。第一步是采用深紫外光刻技术将微图形打印到PDMS膜上。随后将PDMS膜安装至机械拉伸装置上，并在膜上方用生物相容性润滑脂密封一个腔室，以允许在拉伸过程中实现滑动。将细胞接种于微图形上，并使其贴附铺展数小时。通过使用微米级螺钉，可对样品进行多次拉伸和回缩操作。在不到一分钟内即可实现最大程度的拉伸（约30%）。本文介绍的技术未包含电动装置，而电动装置对于快速施加重复拉伸循环和/或计算机控制的拉伸是必需的，但该功能可后续添加。对细胞或组织进行拉伸有助于研究与细胞自身产生的力、细胞对机械应力的响应以及组织形态发生相关的问题。本视频将展示如何避免在进行此类看似简单的实验时可能出现的典型问题。

引言

在高等生物中，构成组织的细胞会受到来自外部环境或邻近细胞的机械张力和拉伸力的作用^1,2。细胞必须适应并抵抗这些力，以维持组织的完整性。这些力在发育过程中的组织形态发生中也具有重要作用^3,4。对培养的细胞施加机械力，可以模拟组织中可能发生的情况，同时能够定量且独立地控制细胞形态和细胞形变^5,6。为此，可采用多种技术。例如，可通过原子力显微镜（AFM）或其衍生技术对细胞（整个细胞或其部分）施加压力^7,8 ，或拉伸细胞所生长的基底。

本文所述方法展示了如何拉伸接种有细胞的平面基底。该技术最初是为了评估作用于有丝分裂期哺乳动物细胞的力而开发的⁹。处于有丝分裂期的细胞通过回缩纤维与基底保持连接，当膜被拉伸时，会对这些纤维施加力，从而引发有丝分裂纺锤体的旋转。将黏附性微图形与拉伸相结合的意义在于，能够独立控制单个细胞所受的力及其形状。例如，可在施加单轴拉伸的同时，将一个椭圆形细胞拉伸为完全各向同性的圆形。如果细胞未接种在微图形上，单轴拉伸会导致细胞伸长，且大多数细胞的长轴会与拉伸方向对齐。此时，便难以区分细胞长轴对齐所产生的效应与施加拉伸本身所产生的效应。

该装置适用于所有活细胞成像实验，包括长时间延时荧光显微镜观察，并可在实验过程中添加药物。深紫外光 微图形化方法¹⁰ 在 Azioune et al.¹¹ 中有详细描述。PDMS 上的图形化方法见 Azioune et al.¹² 。本拉伸实验方案是 Carpi et al.¹³ 的视频版本。

方案

1. PDMS 的钝化

1. 从预成型的聚二甲基硅氧烷（PDMS）上切割一块约35 mm × 20 mm的片状材料 制成的薄片（例如材料表中列出的 GelPak）。
2. 移除聚二甲基硅氧烷（PDMS）上下两面的塑料保护层（如有必要），然后使用镊子将其放入塑料（非细胞培养处理）培养皿中。
3. 用70%乙醇在30次/分钟振荡的旋转器上孵育PDMS 5分钟。
4. 用气流吹干表面。
5. 用深紫外光（λ = 180 nm）照射5分钟，紫外灯与样品距离约为5 cm（灯具参考信息见材料表；不同灯具参数可能有所差异）。
6. 准备 200 µl 每次处理PDMS样品时，为每块PDMS准备EDC/NHS溶液（该溶液必须现用现配，因为其反应活性在数小时内即会下降）。取1 ml pH 6.0的0.05 M MES + 0.5 M NaCl缓冲液，加入11.5 mg Sulfo-NHS和19.2 mg EDC。
7. 将PDMS薄膜从培养皿转移至未经过光照的培养皿盖上，以确保PDMS周围环境具有高度疏水性，从而有利于下一步操作。
8. 加入 EDC/NHS 溶液，在室温下孵育 15 分钟。
9. 用清水冲洗 EDC/NHS。
10. 加入PLL-g-PEG 溶液（0.5 mg/ml，溶于 10 mM HEPES，pH 8.6），室温孵育 3 小时至过夜。
11. 用 PLL 洗涤g-聚乙二醇与水。经钝化的聚二甲基硅氧烷（以PLL功能化）g-PEG）可在 4 °C 下保存数天。

2. PDMS 的图案化

1. 取一片聚二甲基硅氧烷（PDMS）片，将其放置在带有用于图案化的微结构的合成石英掩膜上（见图1）。将PDMS上带有PLL-g-PEG的一面朝向掩膜的铬面。
2. 在距紫外灯约5 cm的距离下，通过掩膜照射7分钟。
3. 在掩膜 + PDMS上加入水，然后缓慢将PDMS从掩膜上剥离。
4. 在pH 8.6的HEPES缓冲液中，用50 mg/mL的纤连蛋白溶液孵育1小时（室温）。也可使用其他细胞外基质蛋白，但本方案未对这些蛋白进行测试。
5. 用PBS冲洗。

3. 安装设备

1. 将先前钝化的PDMS安装到拉伸装置上（参见讨论部分以进行故障排除）。
   1. 将PDMS的一侧固定在拉伸器的固定部分。
   2. 将另一侧固定在拉伸器的可移动部分，注意不要夹住过多的PDMS片材。
2. 从一块较厚的PDMS平板上切割出一个矩形PDMS（22 mm × 19 mm），并在其内部再切割出另一个矩形，从而形成一个可容纳细胞和培养基的腔室（或框架）（见图2）。
3. 在此PDMS腔室下方涂抹硅脂，并将其放置在PDMS片材上方，以形成一个可保留培养基的腔室 。硅脂可在拉伸过程中使腔室在PDMS片材上顺畅滑动。

4. 细胞的图案化

1. 用Versene从50%融合度的培养瓶中消化细胞。
2. 计数细胞，并将其重悬至浓度为200,000个细胞/ml。
3. 在池中加入1 ml细胞悬液（更多细节参见讨论部分）。
4. 让细胞在图案上贴附10–30分钟（根据细胞类型而定，RPE-1细胞约需10分钟，HeLa细胞约需20分钟）。
5. 用预平衡的培养基轻轻冲洗未贴附的悬浮细胞（将培养基在培养箱中预平衡）。
6. 让细胞在图案上铺展数小时（RPE-1细胞至少需要2小时，HeLa细胞需要3小时）。
7. 在池上方加盖盖玻片，以防止蒸发以及PDMS破损时培养基泄漏。
8. 将装置置于倒置显微镜下开始成像。避免使用油镜，因其会因聚焦问题而无法正常工作。

5. 拉伸

1. 在调整载物台的 x、y 方向位置的同时，转动微米螺旋。 以及 z 轴（主要是 x 轴）。需要校正载物台位置，以补偿 PDMS 的扩张和失焦。（参见 "拉伸过程中" 讨论部分中的段落）。

结果

本视频方案中介绍的技术允许对有丝分裂期哺乳动物细胞的回缩纤维施加力学力。事实上，在细胞分裂过程中，当细胞进入有丝分裂阶段时，哺乳动物细胞会回缩并变为球形，同时在基底上留下由细胞膜包裹的细长肌动蛋白纤维。这些纤维（即回缩纤维）记录了细胞进入分裂前的几何形态。通过在PDMS薄膜上使用深紫外光透过光掩模制作微图形（图1），可实现对细胞黏附几何形状的控制。在细胞进入中期的起始阶段拉伸基底时，部分回缩纤维被从细胞体上拉离，从而在有丝分裂细胞的皮层上施加了机械力（图3）。研究表明，这些力可调控纺锤体轴的方向⁹。

讨论

尽管该技术已被多次使用且经过充分验证，但仍有一些关键步骤可能导致实验失败。

关于PDMS：

本研究使用了市售的薄型聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材GelPak。也可使用PDMS混合物直接浇铸制备PDMS片材。我们推荐使用GelPak，因其可重复性更佳，且相比自行制备的PDMS更不易破损。

关于该设备：

本方案中使用的拉伸装置是专门设计的 "自主研发"，但也可以将微图形化技术应用于商用拉伸装置，如FlexCell。定制选项更具多功能性，且成本低得多。

安装设备：

安装PDMS时可能导致其断裂。此外，PDMS容易被装反，且难以分辨哪一侧为正面。若对PDMS夹持过紧，会导致其变短，从而在拉伸相同距离时承受更大的张力，增加断裂风险。务必确保螺丝已充分拧紧，否则PDMS薄片在开始拉伸时或实验后续过程中可能发生滑移...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
凝胶夹具	凝胶夹具	PF-60-X4	提供不同厚度和黏性。另一种选择是自行浇铸PDMS 。
硅脂	GE Bayer有机硅	Baysilone-Paste	该产品具有生物相容性
拉伸装置	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC（N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）	Sigma	3450	在-20 °C下可稳定保存6个月
NHS（N-羟基琥珀酰亚胺钠盐）	Sigma	56485	防潮保存
Pll-g-peg（PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg）	SurfaceSolutions（苏黎世）
合成石英光掩模	Toppan		采用石英材质的标准二元光掩模
牛血浆纤维连接蛋白	Sigma	F1141