通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

摘要

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。 

摘要

许多微生物（如细菌）增殖极为迅速，种群密度可达到很高水平。在任何种群中，总有少量细胞积累了对细胞有害或有利的突变。如果某突变带来的适应性优势使该亚群获得显著的选择性生长优势，则该亚群个体可能迅速战胜甚至完全淘汰其邻近的同类。因此，微小的遗传改变以及获得有利突变的细胞在选择压力下的富集，可能导致整个细胞种群基因型的彻底更替。本文介绍一种通过共培养带有荧光标记的革兰氏阳性模式细菌Bacillus subtilis个体，以实时监测细菌种群中有利和不利突变的快速克隆扩增与清除过程的实验方法。该方法操作简便，能够直观展示细菌种群内个体之间的种内竞争现象。

引言

土壤细菌通常具有灵活的调控网络和广泛的代谢能力。这两种特性使细胞能够调整其分解代谢和合成代谢途径，以在特定生态位中与同类及其他微生物竞争可利用的营养物质¹。然而，当细菌无法适应环境时，其他机制可能成为物种存活的关键。事实上，由于许多细菌增殖迅速，种群可达到很高的细胞密度，亚群中可能自发积累有益突变，使细胞获得选择性生长优势，从而提高其适应性。此外，突变热点和应激诱导的适应性突变可促进不适应环境的细菌发生进化^2,3。因此，突变的积累以及在持续选择压力下的生长是微生物多样性极为丰富的根源，即使在同一属内也是如此^4,5。正如在自然界中一样，细菌基因组的演化在实验室中也会因持续的选择性培养而发生。这一点以革兰氏阳性菌 B. subtilis 的驯化过程为例，该菌株在全球范围内被广泛用于基础研究和工业生产。20世纪40年代，B. subtilis 经过DNA损伤性X射线处理，随后在特定生长条件下进行培养⁶。在驯化过程中，细菌积累的突变导致许多生长特性的丧失，即 实验室菌株 B. subtilis 168 丧失了形成复杂菌落的能力^7,8。

如今，对于研究最为深入的模式细菌Escherichia coli和B. subtilis，已有多种强大工具可用于对其基因组进行遗传操作，以解答特定的科学问题。有时，目标基因的失活会导致严重的生长缺陷，这种缺陷在标准培养基上清晰可见⁹。相比之下，引起轻微生长缺陷、因而仅对菌株适合度产生微弱影响的突变则常常被忽视。然而，在上述两种情况下，若将突变菌株长期培养并传代多代，通常会导致抑制子突变体的积累，这些抑制子突变体恢复了亲本菌株的表型^2,9。对抑制子突变体进行表征，并鉴定出恢复亲本突变菌株生长缺陷的突变位点，是一种非常有用的方法，有助于阐明重要且往往是新颖的细胞过程^10,11。

我们关注 B. subtilis¹² 中谷氨酸稳态的调控机制。与 E. coli 类似，当 B. subtilis 的谷氨酸稳态受到干扰（即. 谷氨酸降解受阻²）时，会通过积累抑制突变体来响应。这些抑制突变体通过自发突变获得的基因组改变已被证明能够迅速恢复谷氨酸稳态^9,13。因此，在 B. subtilis 的驯化过程中，其对特定生长条件的适应性变化反映在与谷氨酸代谢相关的酶合成及酶活性的进化上，这一点并不令人意外¹²。有研究提出，在驯化过程中培养基中缺乏外源性谷氨酸，是导致实验室菌株 168 中隐匿性谷氨酸脱氢酶（GDH）gudB^CR 基因出现并固定下来的驱动因素^2,14。我们的观察结果支持了这一假说：当外源性谷氨酸匮乏时，实验室菌株中较低水平的 GDH 活性为细菌提供了选择性生长优势²。此外，在无外源性谷氨酸的条件下培养能够合成 GDH GudB 的 B. subtilis 菌株，会导致 gudB 基因失活的抑制突变体不断积累²。显然，具有分解代谢活性的 GDH 对细胞不利，因为原本可用于生物合成的内源性谷氨酸会被降解为铵离子和 2-氧代戊二酸（图 1）。相反，当培养基提供谷氨酸时，具有高水平 GDH 活性的 B. subtilis 菌株相较于仅合成一种功能性 GDH 的菌株具有选择性生长优势。可以合理推测，高水平的 GDH 活性使细菌能够在利用培养基中其他碳源的同时，将谷氨酸作为第二碳源加以利用²（见 图 1）。因此，GDH 活性对细菌的适应性具有显著影响，具体取决于外源性谷氨酸的可利用性。

本文介绍了一种非常直观的方法，用于监测和可视化染色体上单个位点不同的两种 B. subtilis 菌株之间的种内竞争（图2）。这两种菌株分别标记了编码黄色荧光蛋白（YFP）和青色荧光蛋白（CFP）的 yfp 和 cfp 基因，并在不同营养条件下进行共培养。通过随时间取样并将适当稀释的样品涂布于琼脂平板，可利用普通的立体荧光显微镜轻松监测每种培养物中的存活菌株。本文所述方法操作简便，适用于随时间推移可视化细胞群体中有利突变和有害突变的快速克隆扩增与淘汰过程。

方案

1. 琼脂平板、培养基、冷冻保存菌种及预培养物的制备

1. 准备培养基和所需试剂（参见材料与试剂表）。
2. 划线接种 B. subtilis 菌株（例如. BP40（rocG⁺ gudB^克隆扩增 amyE::P_gudB-yfp）和 BP52（rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp）分别表达一个和两个活性GDH² 将在SP培养基琼脂平板上的竞争实验中使用，以获得单菌落。于37℃过夜培养平板 °C.
3. 挑取单菌落，接种于含有4 ml LB液体培养基的无菌培养管中。在28℃下过夜培养细菌。 °C 和 220 rpm。
4. 在28℃下培养过夜培养物 °C，以避免细胞裂解或形成芽孢。
5. 在波长600 nm处测量培养物的光密度（OD₆₀₀使用标准分光光度计。
6. 如果培养物已达到 OD₆₀₀ 为达到2.0的OD值，将0.75 ml培养物与0.75 ml无菌50%甘油溶液在1.5 ml离心管中混合。最终OD₆₀₀ 应为1.0，以获得含有约10的冷冻菌种⁸ cells/ml
7. 将试管置于 -80 ℃ 保存 °C.
8. 制备三种标记了每种菌株的预培养物 cfp 和 yfp 编码荧光蛋白基因。将预培养物（含有4 ml LB液体培养基的无菌培养管）接种1 μ来自 -80 的 l 细胞 °C 冻存菌种。将培养物在 28 ℃ 下过夜培养 °C 和 220 rpm。

2. 细菌共培养、样品采集与样品保存

1. 新鲜配制 100 ml C-Glc 和 CE-Glc 最小培养基（参见试剂与材料表），并将每种培养基各 20 ml 转移至无菌的 100 ml 三角摇瓶中。
2. 取过夜培养的预培养物 0.1 ml，在 1.5 ml 比色皿中用 0.9 ml LB 培养基稀释，并测定 OD₆₀₀。
3. 对于竞争实验，选择不同菌株的预培养物，其 OD₆₀₀ 应相近，介于 1.0–1.5 之间。
4. 为获得混合细胞群体，将 OD₆₀₀ 合适的预培养物细胞稀释至 OD₆₀₀ 为 0.05，分别加入含 20 ml C-Glc 和 CE-Glc 最小培养基的 100 ml 三角摇瓶中。在竞争实验中，两种菌株应以 1:1 的比例混合。
5. 从摇瓶中取 10 ml 样品，转移至 15 ml 塑料离心管中，在标准台式离心机中以 4,000 × g 离心 10 分钟收集细胞，并弃去上清液。
6. 用 0.5 ml 新鲜 LB 培养基重悬细胞，转移至无菌的 1.5 ml 离心管中。加入 0.5 ml 50% 无菌甘油，剧烈涡旋混匀，将样品保存于 -80 °C 冰箱中，待后续处理。
7. 将摇瓶中剩余的细胞在 37 °C、220 rpm 条件下继续培养最多 24 小时。将摇瓶置于避光环境中，以防止荧光染料发生光漂白。
8. 在培养 7 小时和 24 小时后，分别取 0.1 ml 样品。测定样品在 C-Glc 或 CE-Glc 最小培养基中 1:10 稀释后的 OD₆₀₀ 并记录。
9. 从每种培养物中取适量细胞，制备 OD₆₀₀ 为 1.0 的冷冻保存样品。将样品储存于 -80 °C，待后续处理。

3. 样品处理、涂布与培养以进行定量分析

1. 收集所有样品后，将冻存菌种解冻，并用0.9%生理盐水（参见试剂与材料表）将细胞稀释至10^-3。
2. 取0.1 ml的10^-3稀释液接种于SP培养基琼脂平板上，使用无菌玻璃涂布棒均匀涂布细胞。
3. 将平板置于37 °C避光条件下过夜培养，直至出现单菌落。

4. 通过体视荧光显微镜计数存活细胞以进行定量分析

1. 用记号笔将琼脂平板底部划分为四个区域，以便在体视荧光显微镜下计数存活菌落时更便于定位。
2. 将平板倒置放置于显微镜下，使用冷光源调节焦距，使菌落清晰可见。
3. 待菌落清晰对焦后，切换至CFP对应的滤光片组，以观察cfp标记菌株的存活细胞。用记号笔标记已计数的菌落，逐一计数并记录该菌株的存活数。
4. 用乙醇擦除标记，切换至YFP滤光片组，以观察yfp标记菌株的存活细胞。再次用记号笔标记菌落进行计数，并记录存活数量。

5. 半定量分析的样品处理与显微镜观察

1. 用于示意图，点样 10 µ10 的 l^-4 步骤 3.1 的稀释液（约 100 个细胞） 在SP琼脂平板上（参见 图3).
2. 在 37 ℃ 下将平板培养过夜 °在黑暗中培养，直至单菌落出现。
3. 将无盖的培养皿置于显微镜下，使用冷光源将菌斑调至清晰对焦。
4. 拍摄菌落斑点图像以制作示意图。使用冷光源拍摄菌落图像时，选择合适的曝光时间。
5. 不移动培养皿，更换为CFP滤光片组，调整曝光时间并拍摄图像。同样使用YFP滤光片组进行操作，并保存图像以供后续分析。

6. 数据分析

1. 使用 Excel 等软件进行定量数据分析。根据计数的菌落数量，计算黄色和蓝色菌落占菌落总数的百分比，菌落总数设为 100%。
2. 利用计算所得的数据绘制堆叠柱状图（见图 4和 图 5）。使用 Adobe Photoshop 等图像处理软件，将从不同位置拍摄的图像合并成组合图。或者，也可使用可从 http://rsbweb.nih.gov/ij/ 免费下载的软件 ImageJ 进行图像处理。
3. 打开使用 CFP 滤光片组和 YFP 滤光片组拍摄的同一位置的图像。调整对比度和亮度，以降低培养基产生的背景荧光。
4. 选择其中一幅图像并全选，复制该图像并粘贴到另一幅图像上。
5. 可使用“颜色减淡”功能合并图像，或通过通道选项卡叠加荧光图像。来自不同培养基和不同时间点的菌落合并图像，反映了不同菌株在液体培养中的生长情况。

7. 特定提示：染料转换实验及用 cfp 和 yfp 标记的同源菌株的共培养

在 B. subtilis 中表达两种荧光蛋白编码基因中的任意一种都可能影响其适合度，从而影响细菌的生长速率。因此，建议进行以下实验，以排除在培养过程中某一竞争菌株从细胞群体中被消除的现象仅仅是由于荧光蛋白的负面影响所致：

1. 重复整个实验，并共培养荧光标记相反的菌株（例如 较早的 cfp-标记的菌株现在用 yfp 基因和 反之亦然尽管结果相反，但所得结果应可与先前观察到的一种菌株对另一种菌株具有选择性生长优势的现象相比较。
2. 重复整个实验，共培养带有荧光标记的同基因型菌株 yfp 以及 cfp (例如 BP40（rocG⁺ gudB^克隆扩增 amyE::P_gudB-yfp）和 BP41（rocG⁺ gudB^克隆扩增 amyE::P_gudB-cfp)). 通过随时间追踪细胞群体的组成，评估两种荧光团中任意一种对细菌适合度的负面影响。

结果

本文所述方法已成功应用于可视化由标记了分别编码荧光蛋白CFP和YFP的cfp和yfp基因的B. subtilis菌株组成的细胞群体中的种内竞争。如图3所示，该方法能够以非常直观的方式展示种内竞争。通过将样品点样于较小区域，可一目了然地观察到细胞群体的克隆组成。尽管该方法不适用于定量分析，但对于粗略估计不同生长参数（即. 氮源）对初始等量混合两种菌株的细胞群体发育的影响仍具有实用价值（图3）。此外，在小规模实验中，可利用单个琼脂平板测试在相同生长条件下培养的不同B. subtilis菌株的适应性。对于定量分析，建议将样品在整个琼脂平板表面涂布，以避免菌落重叠，从而能够明确识别并计数由单个细胞形成的菌落。通过在琼脂平板上接种适当稀释的样品，可简单通过计数黄色和蓝色荧光菌落来精确测定细胞群体随时间推移的克隆组成（见图4）。正如我们先前报道的，GDH活性显著影响B. subtilis的适应性，具体取决于外源谷氨酸的可利用性

讨论

已有多种方法被开发用于分析细菌的竞争性适应性¹⁶。在许多情况下，细菌被标记了不同的抗生素抗性盒¹⁷。与我们的方法类似，使用抗生素抗性盒标记细胞可评估细菌在特定培养条件下共培养期间的竞争性适应性。此外，该方法还可用于确定染色体上特定基因座存在差异的细胞之间的竞争性适应性¹⁷。然而，使用抗生素抗性盒监测竞争性适应性也存在一些缺点。由于抗性基因的表达通常由强度不同的启动子驱动，因此赋予抗生素抗性的酶可能在不同水平上产生，导致微弱的适应性效应无法通过该方法检测到。在我们的方法中，两种荧光蛋白基因均使用相同的筛选标记进行整合，且其表达由相同的启动子驱动²。另一个使用抗生素抗性盒监测竞争性适应性的缺点可能是该方法更为繁琐，因为菌落计数需要两种添加了相应抗生素的琼脂平板。另一种方法是通过直接监测生长速率并计算所谓的适应性指数来确定细菌的适应性¹⁶。显然，这是最精确的方法，因为细菌是单独培养的，某一基因型菌株可能产生的毒性物质不会影响竞争菌株的生长。此外，该方法无需使用可能影响细胞生长的抗生素。然而，这两种方法的直观性较差，因为描述竞争性适应性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(NH4)2SO4	Roth，德国	3746
琼脂	Difco，美国	214010
柠檬酸铁铵（CAF）	Sigma-Aldrich，德国	9714
CaCl2	Roth，德国	5239
葡萄糖	Applichem，德国	A3617
甘油	Roth，德国	4043
K2HPO4•3H2O	Roth，德国	6878
KCl	Applichem，德国	A3582
KH2PO4	Roth，德国	3904
KOH	Roth，德国	6751
MgSO4•7H2O	Roth，德国	P027
MnCl2	Roth，德国	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore，德国	102786
NaCl	Roth，德国	9265
营养肉汤	Roth，德国	X929
谷氨酸钾	Applichem，德国	A3712
胰蛋白胨	Roth，德国	8952
色氨酸	Applichem，德国	A3445
酵母提取物	Roth，德国	2363
1.5 ml 反应管	Sarstedt，德国	72,690,001
2.0 ml 反应管	Sarstedt，德国	72,691
15 ml 带螺旋盖的塑料管	Sarstedt，德国	62,554,001
培养皿	Sarstedt，德国	82.1473
1.5 ml 聚苯乙烯比色皿	Sarstedt，德国	67,742
15 ml 玻璃培养管	Brand，德国	7790 22
100 ml 带铝盖的摇瓶	Brand，德国	928 24
无菌 10 ml 玻璃移液管	Brand，德国	278 23
培养箱（28 和 37 °C）	New Brunswick	M1282-0012
标准移液器套装（2–20 μl，10–100 μl，100–1,000 μl）	Eppendorf，德国	4910 000.034, 4910 000.042,
适用于 1.5 和 2 ml 反应管的台式离心机	Thermo Scientific，Heraeus Fresco 21，德国	75002425
适用于 15 ml 塑料管的台式离心机	Heraeus Biofuge Primo R，德国	75005440
标准分光光度计	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro，德国	80-2112-21
体视荧光显微镜	Zeiss SteREO Lumar V12，德国	495008-0009-000
冷冻柜（-20 和 -80 °C）	-	-
冰箱（4 °C）	-	-
高压灭菌器	Zirbus，LTA 2x3x4，德国	-
pH 计	pH-meter 766，Calimatic，Knick，德国	766
涡旋振荡器	Vortex 3，IKA，德国	3340000
天平	CP2202S，Sartorius，德国	被替代
记号笔（永久性）	Staedler，德国	317-9
Powerpoint 软件	Microsoft，美国	-
Office Excel 软件	Microsoft，美国	-	数据处理程序
Adobe Photoshop CS5	Adobe，美国	被 CS6 替代，可下载	图像处理计算机程序
计算机	PC 或 Mac	-
体视荧光显微镜用 ZEN pro 2011 软件	Zeiss，德国	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. 通过 Zeiss 获取
特定溶液配方
SP 培养基
8 g 营养肉汤
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g 琼脂（用于固体 SP 培养基）			如需要
加 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
1 ml CaCl2（0.5 M），过滤除菌
1 ml MnCl2（10 mM），过滤除菌
2 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
LB 培养基
10 g 胰蛋白胨
5 g 酵母提取物
10 g NaCl
15 g 琼脂（用于固体 LB 培养基）			如需要
加 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
C-Glc 最小培养基
200 ml 5 x C 盐溶液
10 ml L-色氨酸（5 mg/ml），过滤除菌
10 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
10 ml III’ 盐溶液
25 ml 葡萄糖（20%）			121 °C 高压灭菌 20 分钟
加无菌 H2O 至 1 L
CE-Glc 最小培养基
200 ml 5 x C 盐溶液
10 ml L-色氨酸（5 mg/ml），过滤除菌
10 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
10 ml III’ 盐溶液
20 ml 谷氨酸（40%）
25 ml 葡萄糖（20%），121 °C 高压灭菌 20 分钟
加无菌 H2O 至 1 L
5 x C 盐溶液
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
加无菌 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
III’ 盐溶液
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
加无菌 H2O 至 1 L，121 °C 高压灭菌 20 分钟
40% 谷氨酸溶液
200 g L-谷氨酸
加入约 80 g KOH 将 pH 调至 7.0
加无菌 H2O 至 0.5 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
0.9% 生理盐水（NaCl）溶液
加无菌 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
50% 甘油溶液
295 ml 甘油（87%）
加无菌 H2O 至 0.5 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
细菌（所有菌株均基于 Bacillus subtilis 168 菌株）
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	实验室菌种保藏
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)