通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

摘要

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。 

摘要

许多微生物（如细菌）增殖极为迅速，种群密度可达到很高水平。在任何种群中，总有少量细胞积累了对细胞有害或有利的突变。如果某突变带来的适应性优势使该亚群获得显著的选择性生长优势，则该亚群个体可能迅速战胜甚至完全淘汰其邻近的同类。因此，微小的遗传改变以及获得有利突变的细胞在选择压力下的富集，可能导致整个细胞种群基因型的彻底更替。本文介绍一种通过共培养带有荧光标记的革兰氏阳性模式细菌Bacillus subtilis个体，以实时监测细菌种群中有利和不利突变的快速克隆扩增与清除过程的实验方法。该方法操作简便，能够直观展示细菌种群内个体之间的种内竞争现象。

引言

土壤细菌通常具有灵活的调控网络和广泛的代谢能力。这两种特性使细胞能够调整其分解代谢和合成代谢途径，以在特定生态位中与同类及其他微生物竞争可利用的营养物质¹。然而，当细菌无法适应环境时，其他机制可能成为物种存活的关键。事实上，由于许多细菌增殖迅速，种群可达到很高的细胞密度，亚群中可能自发积累有益突变，使细胞获得选择性生长优势，从而提高其适应性。此外，突变热点和应激诱导的适应性突变可促进不适应环境的细菌发生进化^2,3。因此，突变的积累以及在持续选择压力下的生长是微生物多样性极为丰富的根源，即使在同一属内也是如此^4,5。正如在自然界中一样，细菌基因组的演化在实验室中也会因持续的选择性培养而发生。这一点以革兰氏阳性菌 B. subtilis 的驯化过程为例，该菌株在全球范围内被广泛用于基础研究和工业生产。20世纪40年代，B. subtilis 经过DNA损伤性X射线处理，随后在特定生长条件下进行培养⁶。在驯化过程中，细菌积累的突变导致许多生长特性的丧失，即 实验室菌株 B. subtilis 168 丧失了形成复杂菌落的能力^7,8。

如今，对于研究最为深入的模式细菌Escherichia coli和B. subtilis，已有多种强大工具可用于对其基因组进行....

方案

1. 琼脂平板、培养基、冷冻保存菌种及预培养物的制备

1. 准备培养基和所需试剂（参见材料与试剂表）。
2. 划线接种 B. subtilis 菌株（例如. BP40（rocG⁺ gudB^克隆扩增 amyE::P_gudB-yfp）和 BP52（rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp）分别表达一个和两个活性GDH² 将在SP培养基琼脂平板上的竞争实验中使用，以获得单菌落。于37℃过夜培养平板 °C.
3. 挑取单菌落，接种于含有4 ml LB液体培养基的无菌培养管中。在28℃下过夜培养细菌。 °C 和 220 rpm。
4. 在28℃下培养过夜培养物 °C，以避免细胞裂解或形成芽孢。
5. 在波长600 nm处测量培养物的光密度（OD₆₀₀使用标准分光光度计。
6. 如果培养物已达到 OD₆₀₀ 为达到2.0的OD值，将0.75 ml培养物与0.75 ml无菌50%甘油溶液在1.5 ml离心管中混合。最终OD₆₀₀ 应为1.0，以获得....

结果

本文所述方法已成功用于可视化由分别携带编码荧光蛋白 CFP 和 YFP 的 cfp 与 yfp 基因标记的 B. subtilis 菌株组成的细胞群体中的种内竞争。如图3所示，该方法能够以非常直观的方式展示种内竞争。通过将样品点样于较小区域，可一眼观察到细胞群体的克隆组成。尽管该方法不适用于定量分析，但对于粗略估计不同生长参数（例如氮源）对初始等量混合的两种菌株群体发育的影响仍具有实用价值（图3）。此外，在小规模实验中，可利用单个琼脂平板检测在相同生长条件下培养的不同 B. subtilis 菌株的适合度。对于定量分析，建议将样品均匀涂布于整个琼脂平板表面，以避免菌落重叠，从而能够清晰识别并计数由单个细胞衍生出的菌落。通过对适当稀释度的样品进行平板接种，只需计数黄色和蓝色荧光菌落，即可精确测定细胞群体随时间推移的克隆组成（见图4）。正如我们先前报道的那样，谷氨酸脱氢酶（GDH）活性对 B. subtilis 的适合度具有显著影响，.......

讨论

已有多种方法被开发用于分析细菌的竞争性适应性¹⁶。在许多情况下，细菌被标记了不同的抗生素抗性盒¹⁷。与我们的方法类似，使用抗生素抗性盒标记细胞可评估细菌在特定培养条件下共培养期间的竞争性适应性。此外，该方法还可用于确定染色体上特定基因座存在差异的细胞之间的竞争性适应性¹⁷。然而，使用抗生素抗性盒监测竞争性适应性也存在一些缺点。由于抗性基因的表达通常由强度不同的启动子驱动，因此赋予抗生素抗性的酶可能在不同水平上产生，导致微弱的适应性效应无法通过该方法检测到。在我们的方法中，两种荧光蛋白基因均使用相同的筛选标记进行整合，且其表达由相同的启动子驱动²。另一个使用抗生素抗性盒监测竞争性适应性的缺点可能是该方法更为繁琐，因为菌落计数需要两种添加了相应抗生素的琼脂平板。另一种方法是通过直接监测生长速率并计算所谓的适应性指数来确定细菌的适应性¹⁶。显然，这是最精确的方法，因为细菌是单独培养的，某一基因型菌株可能产生的毒性物质不会影响竞争菌株的生长。此外，该方法无需使用可能影响细胞生长的抗生素。然而，这两种方法的直观性较差，因为描述竞争性适应性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(NH4)2SO4	Roth，德国	3746
琼脂	Difco，美国	214010
柠檬酸铁铵（CAF）	Sigma-Aldrich，德国	9714
CaCl2	Roth，德国	5239
葡萄糖	Applichem，德国	A3617
甘油	Roth，德国	4043
K2HPO4•3H2O	Roth，德国	6878
KCl	Applichem，德国	A3582
KH2PO4	Roth，德国	3904
KOH	Roth，德国	6751
MgSO4•7H2O	Roth，德国	P027
MnCl2	Roth，德国	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore，德国	102786
NaCl	Roth，德国	9265
营养肉汤	Roth，德国	X929
谷氨酸钾	Applichem，德国	A3712
胰蛋白胨	Roth，德国	8952
色氨酸	Applichem，德国	A3445
酵母提取物	Roth，德国	2363
1.5 ml 反应管	Sarstedt，德国	72,690,001
2.0 ml 反应管	Sarstedt，德国	72,691
15 ml 带螺旋盖的塑料管	Sarstedt，德国	62,554,001
培养皿	Sarstedt，德国	82.1473
1.5 ml 聚苯乙烯比色皿	Sarstedt，德国	67,742
15 ml 玻璃培养管	Brand，德国	7790 22
100 ml 带铝盖的摇瓶	Brand，德国	928 24
无菌 10 ml 玻璃移液管	Brand，德国	278 23
培养箱（28 和 37 °C）	New Brunswick	M1282-0012
标准移液器套装（2–20 μl，10–100 μl，100–1,000 μl）	Eppendorf，德国	4910 000.034, 4910 000.042,
适用于 1.5 和 2 ml 反应管的台式离心机	Thermo Scientific，Heraeus Fresco 21，德国	75002425
适用于 15 ml 塑料管的台式离心机	Heraeus Biofuge Primo R，德国	75005440
标准分光光度计	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro，德国	80-2112-21
体视荧光显微镜	Zeiss SteREO Lumar V12，德国	495008-0009-000
冷冻柜（-20 和 -80 °C）	-	-
冰箱（4 °C）	-	-
高压灭菌器	Zirbus，LTA 2x3x4，德国	-
pH 计	pH-meter 766，Calimatic，Knick，德国	766
涡旋振荡器	Vortex 3，IKA，德国	3340000
天平	CP2202S，Sartorius，德国	被替代
记号笔（永久性）	Staedler，德国	317-9
Powerpoint 软件	Microsoft，美国	-
Office Excel 软件	Microsoft，美国	-	数据处理程序
Adobe Photoshop CS5	Adobe，美国	被 CS6 替代，可下载	图像处理计算机程序
计算机	PC 或 Mac	-
体视荧光显微镜用 ZEN pro 2011 软件	Zeiss，德国	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. 通过 Zeiss 获取
特定溶液配方
SP 培养基
8 g 营养肉汤
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g 琼脂（用于固体 SP 培养基）			如需要
加 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
1 ml CaCl2（0.5 M），过滤除菌
1 ml MnCl2（10 mM），过滤除菌
2 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
LB 培养基
10 g 胰蛋白胨
5 g 酵母提取物
10 g NaCl
15 g 琼脂（用于固体 LB 培养基）			如需要
加 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
C-Glc 最小培养基
200 ml 5 x C 盐溶液
10 ml L-色氨酸（5 mg/ml），过滤除菌
10 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
10 ml III’ 盐溶液
25 ml 葡萄糖（20%）			121 °C 高压灭菌 20 分钟
加无菌 H2O 至 1 L
CE-Glc 最小培养基
200 ml 5 x C 盐溶液
10 ml L-色氨酸（5 mg/ml），过滤除菌
10 ml 柠檬酸铁铵（CAF，2.2 mg/ml），过滤除菌
10 ml III’ 盐溶液
20 ml 谷氨酸（40%）
25 ml 葡萄糖（20%），121 °C 高压灭菌 20 分钟
加无菌 H2O 至 1 L
5 x C 盐溶液
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
加无菌 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
III’ 盐溶液
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
加无菌 H2O 至 1 L，121 °C 高压灭菌 20 分钟
40% 谷氨酸溶液
200 g L-谷氨酸
加入约 80 g KOH 将 pH 调至 7.0
加无菌 H2O 至 0.5 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
0.9% 生理盐水（NaCl）溶液
加无菌 H2O 至 1 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
50% 甘油溶液
295 ml 甘油（87%）
加无菌 H2O 至 0.5 L			121 °C 高压灭菌 20 分钟
细菌（所有菌株均基于 Bacillus subtilis 168 菌株）
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	实验室菌种保藏
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)