吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体成熟是一个复杂且受到严密调控的过程，在此过程中，新生的吞噬体通过与细胞质中多种细胞器和区室进行精确协调的相互作用，发生剧烈的转变。该过程对于吞噬细胞的生理功能至关重要，它赋予吞噬体裂解和杀菌特性，并最终完成吞噬体与溶酶体的融合以及吞噬溶酶体的生成，后者被认为是吞噬体成熟的最后也是关键阶段。在本报告中，我们描述了一种基于活细胞成像的方法，用于对溶酶体向吞噬体内容物递送的动态过程进行定性和定量分析，这一过程是吞噬溶酶体生成的标志性事件。该方法利用IgG包被的微珠作为吞噬作用的模型，使用荧光染料标记的葡聚糖分子作为腔内溶酶体货物探针，从而在活体巨噬细胞中通过延时成像和共聚焦激光扫描显微镜实时追踪溶酶体内容物向吞噬体的动态递送。本文详细阐述了该方法的背景、准备步骤以及逐步的实验设置，以便其他实验室能够简便而精确地实施该技术。我们所描述的方法简单、可靠，更重要的是，可轻松适用于不同系统和多种实验条件下对吞噬体相互作用与成熟过程的研究，例如使用不同类型的吞噬细胞、功能缺失实验、不同探针以及不同的吞噬颗粒。
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本文内容
摘要
引言
专业吞噬细胞（包括巨噬细胞）在免疫系统中发挥着关键作用。除了作为先天免疫系统的首道防线外，它们还通过信号传导和抗原呈递功能，在适应性免疫的激活过程中发挥至关重要的作用1-3。尽管专业吞噬细胞的功能具有多重性，吞噬体成熟仍是其杀菌功能和抗原加工功能的核心基础4,5。当通过受体介导的方式吞噬并摄取细菌等吞噬靶标后，新生吞噬体会经历一系列复杂且高度协调的过程，与胞内内吞网络及其他多种细胞器进行相互作用和物质交换6。这些细胞结构之间交换物质的性质，以及融合事件的调控机制和时间进程，决定了吞噬体腔内的微环境和吞噬体膜的组成7，从而决定了发育中吞噬体的命运8。
吞噬体成熟过程的生理相关性体现在多种胞内病原体为逃避、阻滞或干扰该过程而采用的不同策略上9。这些策略大多直接或间接地阻止了吞噬体成熟过程的最终关键阶段：即吞噬体与晚期内体/溶酶体区室的融合，而正是这一融合使吞噬体获得了成熟吞噬体所含的大部分水解酶和抗菌因子7,8,10。因此，对这一最终关键步骤的分析可为我们提供强有力的指标，用以判断吞噬体的成熟状态，以及在特定实验条件下其自然生理状态是否受到正面或负面的影响。
晚期内体/溶酶体区室通常被认为是内吞途径的终末区室，其特征在于存在多种阶段特异性的标志分子，从而可与早期内吞区室相区....
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方案
本方案中的动物护理及所有操作均遵循机构和国家的指导原则。
提前准备好标有“Π-" 的试剂。
1. BMMs 的制备
- 通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 去除股骨和胫骨，将骨骼从组织中分离，并修剪两端以便获取骨髓。
- 将骨骼置于冰上预冷的 PBS 或冰上预冷的 DMEM 培养基（添加 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）中，冰上保存直至下一步操作。
注意在II级生物安全柜中进行以下步骤，以最大限度降低污染风险。 - 使用连接1 ml注射器的26 G（0.45 mm）针头，以含青霉素/链霉素的冷PBS冲洗髓腔。
- 以350 × g离心10分钟，轻柔沉淀细胞，将沉淀重悬于BMM培养基中，并接种于无涂层的无菌微生物培养皿中。
- BMM 培养基的制备
- Dulbecco改良型Eagle培养基 DMEM
- 10% 灭活胎牛血清
- 20% 小鼠成纤维细胞 L929 细胞系培养上清液（巨噬细胞集落刺激因子，M-CSF 来源）
- 5% 马血清
- 2 mM 谷氨酰胺
- L9....
- BMM 培养基的制备
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结果
正确制备用于成像的细胞和微珠至关重要。图1展示了本方法中接种、探针负载及初始成像步骤的概要，该流程基于我们针对BMMs优化的实验方案。因此，必须根据所使用的细胞类型和探针种类对实验参数进行测试和优化。
在将IgG包被的磁珠加入预加载的细胞后，选择视野时应尽可能包含最多数量的潜在摄取事件和最多数量的细胞，同时保持方案中预设的放大倍数。如图2所示，这种方法可在每段延时视频中获得更大量的可分析吞噬体。除了增加每组实验每次视频所产生的数据点数量外，该策略还可减少由不同边缘条件引入的变异，从而提高数据的稳健性。
建议由同一个人以盲法进行信号关联测量程序（图2），如果可能的话。由于每个吞噬体的感兴趣区域（ROI）需在每帧图像后手动选择和移动，采用盲法可减少多种人为误差来源，降低偏倚。
虽然通常“样本量越大越好”的原则在此同样适用，但为避免对单个细胞赋予过高权重（因为同一培养物中的所有.......
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讨论
在接下来的部分中，我们将讨论该方法的关键步骤及其局限性。此外，我们将一些常见问题与相应的解决方案联系起来，介绍可能的改进方案，并探讨本方法的优势以及适用于该方法的互补技术。
磁珠的制备，包括将IgG偶联至磁珠表面的过程，至关重要，应避免使用非新鲜制备的磁珠。此外，每次实验前必须从冷冻储备液中新鲜配制葡聚糖（经稀释和灭菌）。为确保细胞摄取、区室分布及累积的一致性，葡聚糖的加载必须遵循精确的时间安排。同时，不仅应使用相同的显微镜装置和软件设置，还应尽可能保持外围条件恒定。例如 温度，CO2湿度，微珠添加技术 等等另一个关键点是视野或目标细胞的选择，在开始成像前应对样品进行全面观察，以选取具有代表性的细胞。
该方法的主要局限性之一是获得具有统计学意义的样本量所需进行的实验数量较多。由于在选定分辨率下，单个视野中可观察到的吞噬体数量有限，因此所述方法相对耗时且工作量较大。若仅随机选取极少数吞噬体进行结果汇总，则少数极端异常值可能对平均值产生显著影响。而较大的样本量则能够掩盖吞噬.......
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致谢
感谢吞噬体生物学实验室成员对本文稿的审阅。本工作由亥姆霍兹青年研究员基金（亥姆霍兹协会的倡议与网络基金）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）优先计划SPP1580项目基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（D-MEM） | PAA, 奥地利 | E15-009 | |
| 不含酚红的杜尔贝科改良伊格尔培养基（D-MEM） | PAA, 奥地利 | E15-047 | |
| 胎牛血清（FBS） | PAA, 奥地利 | A15-151 | |
| L-谷氨酰胺 | PAA, 奥地利 | M11-004 | |
| PBS | PAA, 奥地利 | H15-002 | |
| 青霉素/链霉素 | PAA, 奥地利 | P11-010 | |
| WillCo-dish® 玻璃底培养皿（35 mm ∅, #1.5） | WillCo Wells, 荷兰 | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM 玻璃底培养皿，35 mm | Greiner Bio one, 德国 | 627871 | 替代品：可提供分段式版本 |
| 羧基化乳胶微球 | Polysciences, 美国 | #09850 | 提供不同直径，我们使用了 3 μm |
| 聚苯乙烯微粒 | Kisker Biotech, 德国 | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, 德国 | 305.1.3 | |
| 小鼠全IgG | Rockland, 美国 | 010-0102 | |
| EDAC 交联剂 | Sigma-Aldrich, 美国 | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, 美国 | T1503 | |
| 1-ml 注射器 Omnifix -F | B.Braun, 德国 | 9161406V | |
| 26 G 针头（0.45*25 mm） | B.Braun, 德国 | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, 奥地利 | E15-039 | |
| 马血清 | Gibco, 美国 | 16050-122 | |
| MES 一水合物 | Sigma-Aldrich, 美国 | M2933 | |
| 0.2 μm 一次性针式滤器 | Sartorius, 德国 | 83.1826.001 |
参考文献
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
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