使用电子 von Frey 装置测量小鼠后爪触觉敏感性的变化

摘要

电子 von Frey 测量是传统 von Frey 细丝的有效和改进的替代方案，因为它们可以快速、精确地测量啮齿动物机械撤退阈值在炎症事件前后对持续施加压力刺激的变化。

摘要

测量炎症诱导的后爪从机械压力中撤离阈值的变化是评估啮齿动物疼痛感知变化的有用技术。戒断阈值可以首先在基线时测量，然后在药物、毒液、损伤、过敏原或其他诱发的炎症之后，通过在皮肤的非常特定的区域施加准确的力来测量。与传统的 von Frey 测量相比，电子 von Frey 装置可以精确评估小鼠后爪撤退阈值，这些阈值不受可用细丝尺寸的限制。测量的简便性和快速性允许将触觉敏感性结果的评估纳入快速发作的炎症和神经性疼痛的不同模型中，因为可以在短时间内进行多次测量。个体啮齿动物受试者的实验测量可以根据个体基线反应和排除标准进行内部控制，这些标准很容易建立，以标准化实验组内部和实验组之间的基线反应。因此，使用电子 von Frey 装置的测量代表了对成熟的经典基于 von Frey 细丝的啮齿动物机械异常性疼痛测定的有用修改，该测定也可用于其他非人哺乳动物模型。

引言

慢性非传染性疾病在人类死亡率和发病率负担中占不成比例的份额¹。慢性疼痛越来越被认为是全球疾病负担的重要组成部分²。这为疼痛的预防、管理和治疗的创新提供了巨大的动力。同时，有大量证据表明疼痛的潜在生物学是复杂的³。保护性以及适应不良和慢性疼痛的潜在机制表明免疫和神经系统之间存在错综复杂的相互作用^3,4。阐明这些机制需要从分子解剖到行为分析的严格定量、可重复的实验方法。

啮齿动物模型在表征炎症和神经性疼痛的分子参与者方面具有不可估量的价值⁵。先前指定对有害刺激的反应的时间和强度的减少用于测量这些动物的疼痛状态，因为啮齿动物受试者无法报告疼痛感⁶。在可由感染^7,8、化学暴露^6、9、10、手术切口¹¹ 以及神经结扎引起的神经性疼痛引起的炎症性伤害感受的啮齿动物模型中，对温度和压力的改变反应通常用作组织敏感性的指标。

机械敏感性或对压力刺激的反应，通常使用经典的 von Frey 细丝 （CvF） 进行测量 - 一系列（例如 0.4-15 g¹³）手动应用于测试组织的加权尖端，以连续增量应用于测试组织，直到在对照组与实验受试者中诱导疼痛行为。有多种方法可以使用这些尖端或头发来评估机械敏感性^6,13;最常用的方法如下。具有一定压力的尖端（在系列内;例如 2 g¹³）作为起点，大鼠或小鼠的 50% 撤退阈值（产生反应所需的刺激强度，在尖端施加到组织上的 50% 次）是通过根据先前指定的反应行为的显示上下移动尖端重量来确定的¹³。然后在基线和治疗后时间点之间比较治疗组的绝对 50% 戒断阈值。这种手动技术非常耗时。除了增加每个受试者被限制在 von Frey 室中的时间外，这也增加了将各种重量的测试尖端应用于发炎组织的次数，从而在研究中对啮齿动物造成更大的不适。此外，计算 50% 的退出阈值并在啮齿动物组之间进行比较;实验对象的个体反应通常不会与他们个体未经治疗的基线反应标准化，据我们所知，有一个例外⁶。因此，啮齿动物受试者通常不会根据先前确定范围内的一致基线反应报告为分配到治疗组，也不会根据一组一致应用的排除标准评估个体受试者，这些排除标准允许对基线反应进行标准化任何特定的研究和测定。

在这里，我们提出了一种替代方法，使用电子 von Frey 装置 （EvF） 测量暴露于 Bothrops jararaca 毒液后小鼠后爪的触觉敏感性。Cunha 及其同事⁶ 率先在啮齿动物中使用 EvF 技术，并系统地比较了 CvF 和 EvF 的疗效，以证明 EvF 在啮齿动物炎症性疼痛模型中提供了"更敏感、客观和定量"的触觉敏感性测量。简而言之，在 EvF 测量中，将具有适合被测组织刚度的均匀直径 （0.8 mm） 的不吸湿性聚丙烯 von Frey 尖端连接到电子探针和读数器上，该读数显示啮齿动物从尖端缩回的力/重量。CvF 和 EvF 测量之间存在几个重要差异。首先，使用 EvF 测量基线和实验反应的过程大大简化，因为可以越来越大的力对后爪施加压力，直到有反应并且不需要像 CvF 那样更换尖端;动物在检测室中花费的时间更少，因此在实验过程中压力更小，更舒适。其次，EvF 允许以可接受的基线阈值范围的形式相对容易地为研究对象实施合理的排除标准。这允许在治疗组内和治疗组之间实现基线反应的标准化。第三，受试者在实验治疗后的反应总是与其自己的个体基线反应进行比较，从而为测量创建重要的内部对照。第四，由于压力可以连续施加，而不是以手动细丝重量的形式提供增量，因此以更高的分辨率记录了提款阈值的准确性。与精心设计的 CvF 测定一样，基于 EvF 的实验也由同一研究者（对治疗不知情）施加力并记录反应行为进行。重要的是要注意，这项技术需要研究人员花费时间和精力来确定测量的内部一致性，并且需要规划实验，以便为由于基线反应不一致而可能不得不排除的小鼠留出适当的余量。

一种易于实施、有效、控制良好的机械敏感性评估有助于将行为评估添加到炎症事件（如毒液螫入）的模型中 - 我们在这里使用的示例来说明 EvF 测量在测量触觉敏感性变化方面的能力和能力。我们发现雄性 ND4 瑞士小鼠在后爪注射来自南美蝮蛇 Bothrops jararaca 的毒液后表现出增强的机械敏感性。行为反应伴有受影响组织中的水肿、中性粒细胞流入和肥大细胞脱颗粒。

方案

Macalester College 的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准了所有方案。这些实验使用 8-12 周龄雄性 ND4 瑞士小鼠。

1. Bothrops jararaca 毒液制备和注射

1. 注意：B. jararaca 毒液有毒。处理粉末和制备溶液时，请戴上手套、口罩和护目镜。
2. 使用带有 29 G x 1/2 in 针头的 3/10 ml 胰岛素注射器，通过足底内注射 45 μg/kg B. jararaca 毒液（方案确定）或 0.9% 盐水载体（10 μl）。注意：根据实验设计，可以将治疗和对照溶液分别注射到每个后爪中，以提供每个受试者的内部控制。

2. 电子 von Frey 装置的设置和作

1. 将电子 von Frey 装置放在探头支架上。确保探头和电缆正确连接到显示单元，然后打开仪器。在设置模式下将读数设置为零 （0.00 g），然后将提供的测试砝码 （5.00 g） 轻轻地放在 von Frey 探针的锥体上。
2. 将读数记录在实验室笔记本中，并在完成测试会话后重复此过程。如果测试砝码读数前后的读数相差大于 0.20 g，或者如果读数在应用测试砝码后出现波动，则可能需要重新校准设备（由制造商提供）。
3. 要评估小鼠后爪的撤出阈值，请使用探针随附的适当聚丙烯尖端。尖端的选择取决于被探测的组织。刚性尖端适用于不太敏感、较坚韧的后爪组织，而半柔性尖端可能是更柔软区域（例如肛门生殖器嵴）的更好选择（Chatterjea，未发表）。轻轻地将刚性尖端安装到探头的锥体上。
4. 要记录最大施加压力，请将作模式从设置切换到作，以便在显示屏上记录最大施加压力。在此模式下，当探头缩回时，最大施加压力读数将保存在显示屏上。

3. 后爪撤退阈值评估的一般注意事项

1. 理想情况下，需要两名研究人员使用 EvF 设备测量后爪撤退阈值（机械敏感性）——一名用于作设备并进行测量，另一名用于转录记录的测量值并处理小鼠。
2. 为了减少偏倚，作该设备的研究者应对治疗和记录的退出阈值不知情。此外，为确保测量之间的一致性，同一个人应评估所有基线和实验戒断阈值。
3. 在安静、温度受控的房间内进行所有测量，并在第¹⁴ 天的同一时间进行。
4. 记录测量结果的实验者应将每只小鼠放入设置在网状地板支架上的多单元聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 外壳的各个腔室中。用穿孔的 PMMA 盖子盖住腔室，并在顶部放置一个重物，以防止小鼠逃脱。在支架下方放置吸收材料以吸收/收集排泄物。在基线或实验性撤离阈值评估 ^6,7,10 之前，让小鼠在腔室中适应 15 分钟。
5. 老鼠的后爪必须可以通过网状地板的开口轻松触及;因此，将网状地板支架放在带制动器的推车上，或放在可从四面八方进入的稳定工作台上，以舒适的高度放置。
6. 在测量过程中，可能必须用放置在测量室外的食物颗粒¹⁵ 或测量之前（但测量期间）沿着测量室地板的金属丝网敲击或运行笔产生的非常轻微的噪音来分散小鼠的注意力。这会使鼠标保持静止，使实验人员能够更轻松地开始进行测量。

4. 基线后爪撤退阈值评估

1. 第一组基线测量应在治疗前 48 小时进行。安装刚性尖端后将探头归零。用两只手慢慢抬起探针以刺激左后爪或右后爪的中间（脚垫区域）（如果两只爪子接受相同的治疗）。
2. 逐渐增加压力，直到观察到定义的伤害性反应行为，例如后爪缩回、后爪舔或四爪跳跃^6,10。指示另一名调查员转录引起观察到的行为的压力。
3. 测量位于相邻腔室中的小鼠的提款阈值。继续作，直到您评估了每只鼠标的提款阈值一次。再重复四次，以便按照前面描述的¹⁰ 次测量每只鼠标 5 次。
4. 对于每只鼠标，计算 5 次测量的中值，然后计算每个值与中位数的偏差程度。选择 3 个偏差最小的值，然后将它们平均以获得基线戒断阈值，如前所述¹⁰。在本演示中，通过使用 5 个值中的 3 个进行了标准化测量;虽然具体的测量次数可能因实验设计而异，但重要的是要确保所有小鼠被戳相同次数以评估基线。
5. 24 小时后重复基线测量。每只小鼠进行 5 次测量，并对最接近中位数的 3 次进行平均，以获得基线退出阈值。
6. 要计算小鼠的平均基线撤离阈值，请在治疗前 48 小时和 24 小时取其基线撤离阈值的平均值。如果平均基线撤出阈值低于 3.50 g，或者两个基线阈值相差 2.00 g 或更多，则将鼠标排除在实验之外。这些标准确保实验中的所有小鼠都具有一致的基线反应，以及足够高的基线戒断阈值，允许在治疗后观察到较低的阈值。
7. 注意：排除阈值将取决于被探测的组织、研究的动物品系以及使用的尖端类型。例如，我们发现 3.5 g 是 ND4 后爪组织的有用基准，但更多压痛区域（如肛门生殖器嵴）需要较低的排除阈值（Chatterjea，未发表）。
8. 将小鼠分配到治疗组，以便在给予治疗之前，实验组的平均退出基线尽可能相似。

注意：基线测量可以在实验前 48 小时之前进行。但是，在治疗开始前应定期完成至少 2 组基线测量。

5. 实验性后爪撤退阈值评估

1. 在实验设计确定的适当时间点评估治疗后的后爪撤退阈值（机械敏感性）。测量完成后，立即将小鼠放回笼子中，以便获得食物和水。
2. 遵循上述步骤;进行 3 次而不是 5 次测量，以减少过度刺激（治疗过的）后爪组织的可能性，尤其是在多个时间点评估敏感性时。如果所进行的三次测量中，任意两次相差超过 2.00 g，请进行第四次测量。
3. 计算 3 次测量的平均值，以获得每只小鼠的实验提款阈值。对于进行了 4 次测量的任何小鼠，计算偏离中位数最少的三只小鼠的平均值，以获得实验退出阈值。
4. 为了获得每只小鼠在特定时间点的 delta 提款阈值，请从实验提款阈值中减去基线。对所有小鼠和所有实验时间点重复⁹。
5. 对收集的数据进行适当的统计分析。在这里，我们使用 JMP 9.0（SAS、Cary、NC）进行单因素方差分析和 Tukey HSD 事后分析。

结果

局部 B. jararaca 毒液给药会导致 ND4 瑞士雄性小鼠后爪触觉敏感性和组织水肿发生变化。

施用 45 μg/kg B. jararaca 毒液 1.5 小时后，ND4 瑞士雄性小鼠在比基线低 3.0 g 的压力下撤回后爪（图 1A）。所有组的基线退出发生在 ~4.5 g 施加的压力下;毒液处理后，实验小鼠在 1-1.5 g 施加的压力下撤回后爪（数据未显示）。在所有测试时间点，与基线相比，盐水处理的对照小鼠对压力的反应几乎没有降低。在毒液螫入后 3 小时和 6 小时，治疗小鼠的反应阈值降低明显维持（图 1A），并且在 24 小时时与对照组无法区分（数据未显示）。毒液中毒小鼠的后爪显示炎症特征的组织水肿。在毒液给药后 1.5 小时，处理过的后爪（如前所述¹⁰ 次测量）比基线时厚 1.5 毫米;水肿持续 3 小时和 6 小时（图 1B）。相比之下，盐水处理的爪子在整个实验期间没有表现出肿胀或厚度变化。对于此处显示的代表性实验，共有 21 只小鼠用于基线测量，并选择 14 只小鼠纳入实验。这些被分配到治疗组，使得每组整体基线时的平均戒断反应约为 4.5 g。

B. jararaca 毒液诱导的触觉敏感性变化伴随着肥大细胞脱颗粒和中性粒细胞流入 ND4 瑞士雄性小鼠的后爪。

除了触觉敏感性和组织水肿增加外，我们还评估了毒液与盐水处理小鼠后爪中的中性粒细胞内流（图 2A-B）和肥大细胞脱颗粒（图 2C-D）。中性粒细胞是第一个从循环中被募集到病灶中的炎症细胞，已知可介导炎症伤害性反应^10,16,17。肥大细胞是组织驻留的前哨细胞¹⁸，肥大细胞脱颗粒与小鼠后爪¹⁰ 和大鼠硬脑膜的伤害感受反应有关¹⁹。

在这里，我们发现与盐水处理的后爪相比，流入毒液后爪的中性粒细胞增加了近 1,000 倍（图 3A），通过计数苏木精-伊红染色的 4 μm 石蜡包埋的矢状面足底组织切片¹⁰ 在毒液给药后 1.5 小时从安乐死小鼠中收获。

在盐水处理的爪子中，后爪组织中的足底肥大细胞基本完整或显示轻度脱颗粒（图 3B）。相比之下，毒液中毒的后爪显示 15-20% 的肥大细胞中度和广泛脱颗粒（图 3B）。上述组织切片用甲苯胺蓝染色，并观察每个肥大细胞的可见颗粒数，以确定如前所述¹⁰ 的脱颗粒状态。

图 1.局部 B. jararaca 毒液给药会导致 ND4 瑞士雄性小鼠后爪机械敏感性的变化和组织水肿。在足底内 B. jararaca 毒液 （Bjv;45 μg/kg） 或载体（生理盐水）治疗 （10 μl） 前 48 小时和 24 小时评估基线戒断阈值和基线爪宽。在治疗后 1.5 、 3 和 6 小时评估戒断阈值 （A）。在基线和治疗后 1.5、3 和 6 小时使用数字卡尺评估足底中部区域的平均爪宽（小鼠左爪和右爪的平均宽度），以确定如前所述的组织水肿¹⁰ （B）。将显着性与Sal处理的小鼠进行比较（* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p <分别为 0.001）。n = 每个治疗组 10-11 只小鼠。单击此处查看大图。

图 2.B. jararaca 毒液诱导的机械敏感性伴随着肥大细胞脱颗粒和中性粒细胞流入 ND4 瑞士雄性小鼠的后爪。治疗后 1.5 小时用 CO₂ 对 3 只小鼠/治疗实施安乐死，切除其后爪，在 10% 福尔马林中储存 24 小时，并转移至 70% 乙醇中，在 15% EDTA 中脱钙 1-2 周，并包埋在石蜡中。用苏木精-伊红 （A-B） 和甲苯胺蓝 （C-D） 对 4 μm 矢状面切片进行染色，分别用于观察中性粒细胞 （A-B） 和肥大细胞 （C-D）。图像以 400X 和 1,000X 采集，如注释所示。点击这里查看大图。

图 3.B. jararaca 毒液诱导的机械敏感性伴随着肥大细胞脱颗粒水平的显着增加和中性粒细胞流入 ND4 瑞士雄性小鼠的后爪。使用奥林巴斯 CX21LED 显微镜对染色组织切片上的中性粒细胞和肥大细胞进行计数。在 400 倍放大倍率下，从脚跟到脚趾的相邻视野中，每次治疗用 3 个后爪计数中粒细胞 （A）。将肥大细胞计数在 3 个脚垫/处理中，并根据细胞边界外的可见颗粒数量对其脱颗粒状态进行评分：完整 （0）、轻度 （0-10）、中度 （10-20）、广泛 （21+），如前所述¹⁰ （B）。 为避免对相同的细胞进行两次计数，研究人员在评估后爪切片的中性粒细胞数量和肥大细胞脱颗粒水平时，使用了刻在目镜标线上的网格。研究人员对治疗 s 不知情。将显着性与 Sal 处理的小鼠进行比较 （* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001）。n = 每个治疗组 3 只小鼠。 单击此处查看大图。

讨论

测量戒断反应的变化是用于评估啮齿动物疼痛和炎症模型中触觉敏感性变化的重要工具。在这里，我们演示了电子冯弗雷设备执行此评估的效用。这种技术有几个优点：i）我们可以在相当接近的多个时间点快速评估多只小鼠对施加压力的退出反应，ii）我们可以使用单个尖端对小区域组织施加连续和特定的压力，iii）我们可以准确测量施加的精确压力以获得退出反应， iv） 我们可以轻松实施稳健的基线截止值、排除标准和内部控制，以确保行为评估尽可能准确和客观。

确保 EvF 测定获得最佳结果的关键步骤是仪器的事先校准和一致的测量实践。如协议部分所述，仪器需要小心处理，并确保在使用前和使用期间进行适当的校准。在进行任何测量之前，必须确认测试砝码读数，以确保最佳的机器功能。如果读数波动较大或测试砝码读数不准确，应立即联系制造商对设备进行校准。考虑到这一点，如果可能的话，建议使用备用电子冯弗雷设备，以免因意外需要校准仪器而影响时间敏感的实验。此外， 一名训练有素的研究者应为给定研究或一系列实验进行所有基线和实验测量，同时对治疗组保持不知情。小鼠应在安静的房间中进行评估，保持恒温，适应EvF室至少15分钟，但不要在室内限制超过必要的时间（特别是如果在一天内进行多次测量），以尽量减少压力和不适引起的行为变化。

与现有的 CvF 技术相比，EvF 测量提供了显着改进。研究人员可以施加连续压力，而不必像在 CvF 灯丝实验⁶ 中那样在不同重量的尖端之间切换。这可以减少组织上的戳伤，这在组织发炎或受伤的情况下尤其重要。可以测量发生退出的精确压力，而使用 50% 退出测量值，这些测量值也受到 CvF 测量中使用的可用灯丝重量的限制¹³。由于可以实施合理且统一的排除标准（如上所述），因此可以将小鼠分配到实验组，以便所有组在实验开始时具有相似的平均基线。EvF 测量评估对给定刺激的行为反应 的变化 ，而不是绝对反应本身。因此，每只小鼠的伤害性反应变化被测量为其个体实验和基线戒断之间的差异，从而为每次测量提供内部对照。

也许 EvF 最显着的局限性是，与手动对应物类似，同一研究人员必须对特定系列的基线和实验测量进行所有测量。这使得从时间、人员和设备的角度来看，扩大该技术具有挑战性。我们发现，一次~20只小鼠（取决于测定室的配置）可以在多个时间点在30-45分钟或更短的时间内测量，前提是测量之间至少有45分钟。这方面的一个相关考虑因素是个体实验者的学习曲线。在单个研究人员开始全面实验之前，必须建立内部一致性，这需要数小时的专门练习，包括重复的基线响应测量，直到达到所需的一致性。此外，使用基线截止值意味着并非所有为实验设定基线的小鼠都可以包括在内;我们发现，每次实验基线化的小鼠中有 25-30% 通常被排除在外。

在修改和未来应用方面，EvF行为测量为各种炎症模型增加了一个强大的维度，以分析可能导致炎症病理的伴随急性和/或慢性疼痛。在毒液中，我们发现触觉灵敏度的明显、快速变化伴随着 ND4 雄性小鼠后爪组织肿胀、白细胞募集和肥大细胞脱颗粒的预期结果。这些发现证实了之前关于肥大细胞介质对大鼠热敏感性的贡献的观察²⁰ 和 B. jararaca 毒液诱导的机械敏感性在使用 CvF²¹ 测量的 ND4 瑞士小鼠中。EvF方案可以很容易地修改为用于后爪以外的组织， 例如 目前使用CvF的腹部⁷ 和肛门生殖嵴⁸ 。过敏、伤口愈合、神经病变和其他病理的啮齿动物模型可以很容易地适应，以包括包括后爪和后爪以外的组织的机械敏感性测量。

总之，EvF 是一种有用且有效的技术，它更新了啮齿动物伤害感受测量的经典方法，并且是探索各种疾病模型中疼痛的复杂潜在机制的重要新工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ND4 瑞士雄性小鼠	Harlan	0-32	此处使用的小鼠为 8-12 周龄，并根据 Macaleter College 的 IACUC 指南进行饲养和使用。
3 ml/100 胰岛素注射器，带 29 G 1/2 针头	BD	BD309301	每次使用后丢弃到适当的容器中。
B. jararaca 毒液	Sigma	V5625	注意：有毒物质。佩戴眼睛和皮肤防护装置。溶于无菌 0.9% 盐水中。
电子 von Frey 装置;探头 = 90 g 范围	IITC	2394	轻轻移动并确保它始终水平。要将探头归零，请按"Program"（编程）和"Clear"（清除）。要从设置模式切换到作模式，请按"功能"（用于"MH"读数）或"MAX"。
网架 + PMMA 腔室	IITC	410	放置在稳定的工作台或带有四个轮子的推车上，以便接触到四面八方。
仅限电子 von Frey 硬质吸头，90 g 范围	IITC	2390	n/a