体外光动力疗法对骨肉瘤细胞的细胞毒性疗效 In Vitro

摘要

本方案可用于评估光动力疗法（PDT）在细胞系中的疗效，并在将该疗法应用于动物模型之前优化PDT的实验条件。

摘要

近年来，寻找更有效且全身副作用更小的抗癌疗法一直存在困难。因此，光动力疗法成为一种更具肿瘤选择性的新型治疗策略。

光动力疗法（PDT）利用一种无毒的光敏剂（PS），在特定波长的光照射及氧气存在的情况下被激活，产生活性氧自由基，从而引发细胞毒性反应¹。尽管该疗法近二十年前已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但目前仅用于治疗少数几种癌症类型（如皮肤癌、膀胱癌）以及某些非肿瘤性疾病（如银屑病、日光性角化病）²。

PDT 的主要优势在于能够进行局部治疗，从而避免全身性副作用。此外，它可用于治疗位于敏感部位（例如 神经或血管周围）的肿瘤。本文考虑在骨肉瘤（OS，一种骨肿瘤）中采用术中 PDT，以清除手术切除肿瘤后残留在周围组织中的原发肿瘤卫星灶。该治疗旨在减少复发次数，并降低（术后）转移的风险。

在本研究中，我们介绍 体外 PDT 操作流程旨在确定光动力疗法（PDT）的最佳治疗参数，以有效处理广泛使用的骨肉瘤（OS）细胞系，这些细胞系用于在成熟的胫骨内 OS 小鼠模型中模拟人类疾病。通过分光光度计检测光敏剂 mTHPC 的摄取情况，并在 652 nm 激光照射下激发 mTHPC 以诱导光毒性，通过 WST-1 检测法及存活细胞计数评估细胞死亡效应。所建立的技术可帮助我们明确未来动物实验中 PDT 的最佳治疗条件，为评估 PDT 疗效提供一种简便、快速的工具。 关键词：光动力疗法，mTHPC，骨肉瘤，细胞摄取，光毒性，WST-1 检测，存活细胞计数，小鼠模型 体外 在应用之前 体内.

引言

目前，骨肉瘤（OS）——一种原发性骨肿瘤——的先进治疗方法包括新辅助化疗与手术相结合的综合治疗。该治疗方案使局限性疾病患者的生存率从化疗使用前的约20%提高到目前的60-70%^3,4。然而，在过去二十年中，局限性骨肉瘤患者的总体生存率已趋于停滞^4,5。此外，30-40%的患者在确诊后3年内复发，而转移性疾病的患者生存率仍然很低，仅为20-30%^4,6,7。为了改善这些患者的预后，亟需开发新的治疗策略。

光动力疗法（PDT）是一种相对较新的抗癌治疗方法，其利用特定波长的光激发光敏剂（PS）。光敏剂经血液注射后可在肿瘤细胞内聚集。在氧气存在的情况下，激光照射激发光敏剂，产生氧自由基，从而在肿瘤细胞内引发细胞毒性反应并导致细胞死亡。除这一主要机制外，PDT 还通过两种额外的生物学过程抑制肿瘤生长：PDT 可引起肿瘤微血管的血管收缩和血栓形成，进而导致肿瘤内部出现局部缺氧和无氧状态，最终引发肿瘤梗死。最后，PDT 损伤并杀死的肿瘤细胞可触发局部免疫反应，这是PDT一个相当独特的特征。该过程涉及补体系统以及抗原呈递树突状细胞的活化⁸。因此，形成了肿瘤抗原呈递的条件，并进一步激活淋巴细胞，从而产生针对肿瘤的特异性免疫反应。

方案

1. 低度与高度转移性 HOS 和 143B 骨肉瘤细胞系对 mTHPC 摄取的比较

1. 准备含有DMEM、Ham F12和热灭活胎牛血清的细胞培养基，其比例为4.5:4.5:1。
   注意：光敏剂mTHPC的脂质体配方已溶于水中，mTHPC的终浓度为1.5 mg/ml。
2. 将0.2 × 10⁶ 个HOS细胞和143B细胞/孔接种于6孔板中（每种条件设三个重复孔），过夜培养使细胞贴壁。
   注意：接种细胞数量需根据具体细胞系进行调整。实验时细胞融合度达到80–90%最为适宜。
3. 次日，将细胞分别与固定浓度的mTHPC孵育不同时间（时间依赖性摄取），或与不同浓度的mTHPC在固定时间内孵育（剂量依赖性摄取）。
4. 将细胞与特定时间点或特定浓度的mTHPC进行孵育。
   注意：本研究中，HOS和143B细胞系均分别与0.6 µg/ml mTHPC孵育0、2.5、5或10小时，或与0、0.6、2.5和10 µg/ml mTHPC孵育5小时。所用孵育时间和剂量可能因细胞系不同而有所调整。
5. 务必始终在避光或弱光条件下操作 ，以避免细胞直接暴露于光照下。
6. 在指定条件下孵育后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞三次。随后加入0.5 ml胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞并计数。
7. 消化后，....

结果

通过本文所报告的技术，我们研究了基于mTHPC的光动力疗法（PDT）在人骨肉瘤（OS）细胞中的应用。首先，在低转移性的HOS细胞和高转移性的143B骨肉瘤细胞系中，研究了mTHPC摄取的时间依赖性和剂量依赖性。mTHPC的摄取可通过荧光分光光度计检测其荧光强度来评估（图2，经Reidy 等¹¹许可转载）。图2A展示了mTHPC摄取的时间依赖性变化。细胞悬液的荧光强度反映了细胞内mTHPC的含量。图2B展示了HOS和143B细胞在孵育5小时后的剂量依赖性mTHPC摄取情况。高转移性细胞系143B中的mTHPC摄取趋势高于低转移性的亲本HOS细胞系。

通过检测细胞代谢活性（使用WST-1法）以及在mTHPC中孵育5小时后，于避光条件下继续培养或经激光照射230秒后再于避光条件下继续培养24小时后的残留细胞数量，评估mTHPC在143B细胞中的暗毒性和光毒性。

剂量依赖性的暗毒性如

讨论

为了在光动力治疗（PDT）中实现最佳的细胞毒性效果，选择合适的激光参数和孵育时间至关重要。本文所述方法可稳定、高效地检测光敏剂（PS）的摄取，并定量评估PDT诱导的细胞毒性。 体外利用光敏剂mTHPC的特定吸收波长，可直接测定细胞对光敏剂的摄取情况，并可激活该光敏剂以产生活性氧类等细胞毒性物质。

使用此方法 体外 设置过程中，光敏剂浓度、药物-光照间隔和激光光强度等所有参数均可根据所用光敏剂和细胞系的特性轻松调整。细胞计数可直接反映存活并贴壁的细胞数量，结合WST-1检测（监测细胞代谢活性），可对细胞存活率提供较为准确的评估。然而，该方法仅能模拟“初次杀伤效应”。 即 光敏剂激活后立即产生的活性氧对细胞的毒性。 体内 观察到的后续血管收缩以及免疫系统的激活（这对完全清除肿瘤至关重要）只能在动物体内进行研究。

图2显示，在高转移性的143B细胞中，mTHPC的摄取水平随时间和剂量增加而升高，且高于其亲本低转移性HOS细胞系。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	PAA GmbH，德国弗赖堡	E15-883
HAM F12	PAA GmbH，德国弗赖堡	E15-817
热灭活胎牛血清	GIBCO，巴塞尔，瑞士	10500-064
mTHPC	biolitec 研究有限公司，耶拿，德国		由于该脂质体配方源自R&研发 目前无目录号。储备液：1.5 mg/ml；以二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）与二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）按9:1比例混合提供； >99% 纯度）
Spectramax Gemini XS 酶标仪	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	ID# 861
蔡司 Observer.Z1 显微镜	Axio Observer，Axio Vision 版本 4.6.3 SP1，德国耶拿
Ceralas PDT 652 nm 激光器	biolitec AG，耶拿，德国	LD652nm2W400μ
水溶性四唑盐（WST）试剂	罗氏诊断有限公司，瑞士罗特克赖茨	1644807