体外光动力疗法对骨肉瘤细胞的细胞毒性疗效 In Vitro

摘要

本方案可用于评估光动力疗法（PDT）在细胞系中的疗效，并在将该疗法应用于动物模型之前优化PDT的实验条件。

摘要

近年来，寻找更有效且全身副作用更小的抗癌疗法一直存在困难。因此，光动力疗法成为一种更具肿瘤选择性的新型治疗策略。

光动力疗法（PDT）利用一种无毒的光敏剂（PS），在特定波长的光照射及氧气存在的情况下被激活，产生活性氧自由基，从而引发细胞毒性反应¹。尽管该疗法近二十年前已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但目前仅用于治疗少数几种癌症类型（如皮肤癌、膀胱癌）以及某些非肿瘤性疾病（如银屑病、日光性角化病）²。

PDT 的主要优势在于能够进行局部治疗，从而避免全身性副作用。此外，它可用于治疗位于敏感部位（例如 神经或血管周围）的肿瘤。本文考虑在骨肉瘤（OS，一种骨肿瘤）中采用术中 PDT，以清除手术切除肿瘤后残留在周围组织中的原发肿瘤卫星灶。该治疗旨在减少复发次数，并降低（术后）转移的风险。

在本研究中，我们介绍 体外 PDT 操作流程旨在确定光动力疗法（PDT）的最佳治疗参数，以有效处理广泛使用的骨肉瘤（OS）细胞系，这些细胞系用于在成熟的胫骨内 OS 小鼠模型中模拟人类疾病。通过分光光度计检测光敏剂 mTHPC 的摄取情况，并在 652 nm 激光照射下激发 mTHPC 以诱导光毒性，通过 WST-1 检测法及存活细胞计数评估细胞死亡效应。所建立的技术可帮助我们明确未来动物实验中 PDT 的最佳治疗条件，为评估 PDT 疗效提供一种简便、快速的工具。 关键词：光动力疗法，mTHPC，骨肉瘤，细胞摄取，光毒性，WST-1 检测，存活细胞计数，小鼠模型 体外 在应用之前 体内.

引言

目前，骨肉瘤（OS）——一种原发性骨肿瘤——的先进治疗方法包括新辅助化疗与手术相结合的综合治疗。该治疗方案使局限性疾病患者的生存率从化疗使用前的约20%提高到目前的60-70%^3,4。然而，在过去二十年中，局限性骨肉瘤患者的总体生存率已趋于停滞^4,5。此外，30-40%的患者在确诊后3年内复发，而转移性疾病的患者生存率仍然很低，仅为20-30%^4,6,7。为了改善这些患者的预后，亟需开发新的治疗策略。

光动力疗法（PDT）是一种相对较新的抗癌治疗方法，其利用特定波长的光激发光敏剂（PS）。光敏剂经血液注射后可在肿瘤细胞内聚集。在氧气存在的情况下，激光照射激发光敏剂，产生氧自由基，从而在肿瘤细胞内引发细胞毒性反应并导致细胞死亡。除这一主要机制外，PDT 还通过两种额外的生物学过程抑制肿瘤生长：PDT 可引起肿瘤微血管的血管收缩和血栓形成，进而导致肿瘤内部出现局部缺氧和无氧状态，最终引发肿瘤梗死。最后，PDT 损伤并杀死的肿瘤细胞可触发局部免疫反应，这是PDT一个相当独特的特征。该过程涉及补体系统以及抗原呈递树突状细胞的活化⁸。因此，形成了肿瘤抗原呈递的条件，并进一步激活淋巴细胞，从而产生针对肿瘤的特异性免疫反应。

迄今为止，光动力疗法（PDT）已用于治疗多种类型的软组织肿瘤和增生，如日光性角化病、巴雷特食管、支气管内肿瘤、膀胱癌、基底细胞癌以及头颈部癌症的姑息治疗²该治疗可诱导局部大范围坏死，且副作用较小，因此具有选择性清除肿瘤组织的潜力。尽管具有这些优势，光动力疗法（PDT）的应用在技术上仍比化疗药物的使用更为复杂。为了达到最大疗效，需对光敏剂（PS）浓度、光照时间及总光能量传递进行优化。这可通过以下方式实现 在体 实验，但由于需要优化的参数相对较多，因此更高效的方法是首先确定最佳条件 体外.

在下述实验中，我们测试了 体外 使用光敏剂5,10,15,20-四(间羟苯基)氯，简称mTHPC，进行光动力疗法的疗效（图1A）。mTHPC 是药品 Foscan 中的活性成分，目前临床上用于头颈部癌症的姑息治疗。它是最强效的光敏剂之一，在低浓度下即可引起显著的细胞损伤，并且在组织穿透能力方面已证实优于其他光敏剂。^9,10其光吸收光谱（图1B显示两个显著峰，一个位于417 nm，另一个位于652 nm，分别用于光敏剂在组织中的定位和光动力疗法的诱导。

目前，一种用于mTHPC的脂质体剂型正在研发中。本文描述了定量检测该脂质体剂型摄取量的方法，以及在两种人骨肉瘤细胞系——低转移性的HOS细胞和高转移性的143B细胞中进行光动力治疗（PDT）的操作步骤。部分此处展示的数据此前已有报道¹¹。本研究所述方法使我们能够探讨转移表型对PDT疗效的影响。将143B细胞原位注射至免疫缺陷SCID小鼠的后肢，可导致胫骨内转移性原发肿瘤的形成，该模型能高度模拟人类转移性骨肉瘤疾病。因此，本文提出的体外（in vitro）实验非常适合用于评估后续体内（in vivo）实验所需的最佳PDT参数设置。

方案

1. 低度与高度转移性 HOS 和 143B 骨肉瘤细胞系对 mTHPC 摄取的比较

1. 准备含有DMEM、Ham F12和热灭活胎牛血清的细胞培养基，其比例为4.5:4.5:1。
   注意：光敏剂mTHPC的脂质体配方已溶于水中，mTHPC的终浓度为1.5 mg/ml。
2. 将0.2 × 10⁶ 个HOS细胞和143B细胞/孔接种于6孔板中（每种条件设三个重复孔），过夜培养使细胞贴壁。
   注意：接种细胞数量需根据具体细胞系进行调整。实验时细胞融合度达到80–90%最为适宜。
3. 次日，将细胞分别与固定浓度的mTHPC孵育不同时间（时间依赖性摄取），或与不同浓度的mTHPC在固定时间内孵育（剂量依赖性摄取）。
4. 将细胞与特定时间点或特定浓度的mTHPC进行孵育。
   注意：本研究中，HOS和143B细胞系均分别与0.6 µg/ml mTHPC孵育0、2.5、5或10小时，或与0、0.6、2.5和10 µg/ml mTHPC孵育5小时。所用孵育时间和剂量可能因细胞系不同而有所调整。
5. 务必始终在避光或弱光条件下操作 ，以避免细胞直接暴露于光照下。
6. 在指定条件下孵育后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞三次。随后加入0.5 ml胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞并计数。
7. 消化后，将细胞以400 × g离心5分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于PBS中，调整细胞密度至200,000个细胞/ml。
8. 取100 µl上述细胞悬液（即 含20,000个细胞）加入96孔板中，在荧光分光光度计中测定细胞荧光强度。mTHPC荧光检测的参数设置为：激发波长417 nm，发射波长652 nm。
9. 为计算每个细胞内化mTHPC的量，需将相对荧光单位（RFU）按细胞数量和细胞体积进行归一化处理，方法如下：
10. 使用PBS中0–4 µg/ml范围内不同浓度的mTHPC制备标准曲线（每个浓度设三个重复）。取各稀释液100 µl加入96孔板，采用步骤1.6所述参数测定各孔荧光值。
11. 将测得的RFU值（对应20,000个细胞）除以mTHPC线性标准曲线的斜率，得到孔中mTHPC的浓度（单位：µg/ml）。
12. 将上述mTHPC浓度除以10，得到单孔中mTHPC的总量（单位：µg，对应100 µl细胞悬液），再将该值除以20,000个细胞的总体积。
13. 使用球体体积公式计算细胞体积：(4/3 × π) × r³。通过显微镜测量20个胰酶消化后的细胞直径，将其除以2得到半径 r。
14. 最后，将所有数据归一化至HOS细胞在孵育10小时后（剂量依赖性摄取）或经10 µg/ml mTHPC处理后（时间依赖性摄取）所得数值，设为100%。

2. 光敏剂光毒性测定 体外

1. 在96孔板中每孔接种3,000个细胞（每种mTHPC浓度设三个复孔），过夜培养使细胞贴壁。同样准备另一块96孔板，按以下方法处理细胞，但随后将其留作相差显微镜成像使用。
   注意：接种细胞数量需根据各细胞系的具体情况调整。实验时细胞融合度达到50–60%为最佳。
   1. 需为每种mTHPC浓度设置相应的暗毒性对照组细胞。这些细胞在有或无选定浓度mTHPC的条件下孵育，但不进行光照。
2. 次日，根据细胞系的不同，用不同浓度的mTHPC（0、0.0001、0.001、0.01、0.03、0.075、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、 和10 µg/ml）处理细胞，避光孵育5小时。
   1. 参见第1.3.2节
      注意：光照前的孵育时间取决于细胞系和所用光敏剂（PS），因此建议在独立实验中测试不同浓度和不同时间点。
3. 按指定时间孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并加入不含mTHPC的新鲜培养基。
4. 使用针对mTHPC吸收光谱特异的652 nm半导体激光器对细胞进行光照（见图1）。
   1. 将激光器功率设定为距离细胞13.5 cm处21.88 mW/cm²，以获得5 J/cm²的能量剂量，光照时间为230秒。暗毒性对照组细胞（无论是否含有mTHPC）均不进行光照。
      注意：进行光敏剂激发所用激光操作时，务必佩戴护目镜以保护眼睛。
5. 光照后，将细胞置于37 ºC避光培养24小时。随后加入水溶性四唑盐（WST-1）试剂（每100 µl培养基中加入10 µl）。
6. 加入WST-1试剂3小时后，在415 nm波长下测定96孔板各孔的吸光度。
7. 为计算存活细胞百分比，将每种条件下未经mTHPC处理的细胞吸光度均值设为100%（即 光照但无mTHPC组，以及未光照且无mTHPC组）。

3. 通过细胞计数估算细胞数量

1. 在24孔板中每孔接种20,000个细胞，置于培养箱中过夜贴壁。
2. 用mTHPC（0.001、0.003、0.15、0.6和1.25 µg/ml）处理细胞，孵育5小时，然后按照上述方法进行光照。
3. 收集培养基，用PBS洗涤细胞一次，胰酶消化后，以400 × g离心5分钟收集细胞。
4. 离心后吸除上清液，将细胞重悬于200 µl新鲜培养基中。
5. 使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。

结果

通过本文所报告的技术，我们研究了基于mTHPC的光动力疗法（PDT）在人骨肉瘤（OS）细胞中的应用。首先，在低转移性的HOS细胞和高转移性的143B骨肉瘤细胞系中，研究了mTHPC摄取的时间依赖性和剂量依赖性。mTHPC的摄取可通过荧光分光光度计检测其荧光强度来评估（图2，经Reidy 等¹¹许可转载）。图2A展示了mTHPC摄取的时间依赖性变化。细胞悬液的荧光强度反映了细胞内mTHPC的含量。图2B展示了HOS和143B细胞在孵育5小时后的剂量依赖性mTHPC摄取情况。高转移性细胞系143B中的mTHPC摄取趋势高于低转移性的亲本HOS细胞系。

通过检测细胞代谢活性（使用WST-1法）以及在mTHPC中孵育5小时后，于避光条件下继续培养或经激光照射230秒后再于避光条件下继续培养24小时后的残留细胞数量，评估mTHPC在143B细胞中的暗毒性和光毒性。

剂量依赖性的暗毒性如

讨论

为了在光动力治疗（PDT）中实现最佳的细胞毒性效果，选择合适的激光参数和孵育时间至关重要。本文所述方法可稳定、高效地检测光敏剂（PS）的摄取，并定量评估PDT诱导的细胞毒性。 体外利用光敏剂mTHPC的特定吸收波长，可直接测定细胞对光敏剂的摄取情况，并可激活该光敏剂以产生活性氧类等细胞毒性物质。

使用此方法 体外 设置过程中，光敏剂浓度、药物-光照间隔和激光光强度等所有参数均可根据所用光敏剂和细胞系的特性轻松调整。细胞计数可直接反映存活并贴壁的细胞数量，结合WST-1检测（监测细胞代谢活性），可对细胞存活率提供较为准确的评估。然而，该方法仅能模拟“初次杀伤效应”。 即 光敏剂激活后立即产生的活性氧对细胞的毒性。 体内 观察到的后续血管收缩以及免疫系统的激活（这对完全清除肿瘤至关重要）只能在动物体内进行研究。

图2显示，在高转移性的143B细胞中，mTHPC的摄取水平随时间和剂量增加而升高，且高于其亲本低转移性HOS细胞系。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	PAA GmbH，德国弗赖堡	E15-883
HAM F12	PAA GmbH，德国弗赖堡	E15-817
热灭活胎牛血清	GIBCO，巴塞尔，瑞士	10500-064
mTHPC	biolitec 研究有限公司，耶拿，德国		由于该脂质体配方源自R&研发 目前无目录号。储备液：1.5 mg/ml；以二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）与二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）按9:1比例混合提供； >99% 纯度）
Spectramax Gemini XS 酶标仪	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	ID# 861
蔡司 Observer.Z1 显微镜	Axio Observer，Axio Vision 版本 4.6.3 SP1，德国耶拿
Ceralas PDT 652 nm 激光器	biolitec AG，耶拿，德国	LD652nm2W400μ
水溶性四唑盐（WST）试剂	罗氏诊断有限公司，瑞士罗特克赖茨	1644807