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一种改进的力学测试方法以评估骨-植入物锚定性能

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DOI：

10.3791/51221

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2014年2月10日

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1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

本文内容

摘要

本文介绍了一种改进的机械测试方法，用于评估骨组织与候选植入物表面之间的锚定强度。该方法可使破坏力精确地垂直或平行于植入物表面平面，并能准确地将破坏力施加于特定的种植体周围区域。

摘要

材料科学的最新进展使得种植体表面在微观和纳米尺度上的形貌复杂性显著增加。因此，传统的种植体表面描述方法—— 即表面粗糙度的数值判定参数 - 不足以用于预测 体内 性能。生物力学测试为分析生物材料表面的性能提供了准确且具有可比性的平台。本文介绍了一种改进的力学测试方法，用于评估骨与候选植入物表面之间的固定效果。该方法适用于愈合的早期和后期阶段，可应用于各种经化学或机械改性的表面。 但不适用于光滑表面。将定制的矩形植入物双侧植入雄性Wistar大鼠的股骨远端，并连同周围骨组织一并取出。制备测试样本后，使用一种新型可拆卸模具进行包埋，并利用力学测试机进行破坏试验。该方法可使破坏力精确地垂直或平行于植入物表面平面施加，从而能够准确且可重复地分离出特定的种植体周围区域进行测试。

引言

评估骨与骨内植入物表面之间的骨性结合一直是研究的重点，已有多种机械测试方法被描述1,2。所有这些方法均施加外力以破坏所采用的骨/植入物模型，大致可分为剪切力测试（通常表现为推出或拔出模型）3,4、反向扭矩测试3,5以及拉伸测试类型6,7。在这些测试中，通常会发生骨组织8或植入物材料（如脆性玻璃和陶瓷材料9,10）的断裂；假设已形成一定程度的骨性结合，则骨/植入物界面仍（至少部分地）保持完整。此类实验结果意味着：不仅导致模型断裂（或破坏）所需的力并不等于分离骨/植入物界面所需的力11,12，而且所形成的断裂面具有复杂的表面积，难以进行精确测量。尽管如此，这些测试仍具有一定的临床相关性，因为它们可提供不同表面设计的植入物在骨内锚定能力的相对比较依据。然而也应注意到，此类比较仅在相同实验模型内部有效；而在不同实验模型之间进行比较则存在诸多困难，因为研究者常使用不同动物物种，其骨组织可能为板层骨或编织骨，采用松质骨或皮质骨愈合模型，且机械测试的几何构型和条件也各不相同。

为了获得骨/种植体界面抗拉强度的测量值，许多研究者使用种植体的名义表面积来计算"抗拉强度"数值，因为抗拉强度的定义是单位面积上的作用力。然而，如上所述，这种计算显然是一种近似方法，因为在许多所采用的破坏性测试中，骨/种植体界面仍保持完整。此外，如 Ronald et al.13 所讨论的，测量种植体表面积（特别是地形结构复杂的表面）受限于测量技术的分辨率。 然而，正如 Brunski et al.2 所综述的，当考虑种植体的名义表面积时，不同种植体表面设计所表现出的"抗拉强度"差异便不再显著，这表明具有更大表面积的种植体表面可提供更大的骨/种植体接触面积，因而需要更大的力才能使模型发生断裂。因此可以推断，地形结构更复杂的表面能够增强接触性骨生成，从而导致更高的骨种植体接触率（BIC）以及机械测试中更高的破坏值。接触性骨生成是两种不同现象的共同结果：骨引导作用和骨形成。事实上，我们已证明，在地形结构复杂的表面上，骨引导作用的增强可通过测量相应的 BIC 值进行量化14，且此类表面也会导致更高的机械破坏值12。

然而，值得注意的是，种植体周围骨组织可通过两种机制形成。在接触性骨生成过程中，来源于间充质的细胞迁移至种植体表面（骨传导），分化为成骨细胞，并进一步合成分泌 从头合成 种植体表面的骨基质（骨形成）。最初形成的骨基质为矿化的类骨质线，类似于正常骨重建过程中所见的结构15 （关于这种有时被认为未矿化的生物矿化结构，文献中存在诸多混淆）1 或与骨组织中的所有界面发生融合16 - 有关此主题的完整讨论，请参见 戴维斯和 Hosseini17接触成骨是骨结合现象的必要前提，但对于骨长入则非必需18骨的矿化水泥线在力学性能上弱于骨的矿化胶原区19因此，直观来看，如果水泥线基质与植入物纳米结构之间相互交错 与大段植入物内骨组织生长的特征相比，前者被破坏所需的机械力合理预期会小于后者，我们最近已通过实验验证了这一点12.

种植体周围骨组织也可通过远距离骨生成形成。在此情况下，骨组织沉积于原有骨表面，并逐渐向种植体表面靠近，最终形成包含无定形基质及成骨细胞残余物的界面20。通常，远距离骨生成与光滑或机械加工的骨内种植体表面相关，常见于皮质骨愈合过程；而具有复杂微拓扑形貌的表面则与接触性骨生成相关，后者更典型地出现在松质骨愈合中。采用光滑种植体表面与皮质骨愈合的拉伸试验模型已用于检测这种无定形生物基质的黏附性能，排除了复杂拓扑表面所伴随的接触性骨生成的影响，结果表明，所谓的“生化”结合在复杂拓扑表面所报告的“抗拉强度”值中仅占次要成分21。相反，Wong et al.22 采用松质骨愈合模型，发现种植体表面粗糙度与推出失效载荷之间存在“极佳的相关性”，并指出化学结合在骨组织与种植体表面锚定过程中确实作用甚微。尽管在所有骨内种植体周围愈合区域中，接触性骨生成与远距离骨生成可能不同程度地同时存在，但具有复杂微拓扑形貌的表面在松质骨愈合区域中已显示出特别优势23。后者在牙科文献中被归类为III类或IV类骨24。

我们的目的是聚焦于接触性骨生成的机制，以及在骨小梁愈合环境中可能形成的骨/种植体锚定作用。这种锚定作用依赖于种植体表面的形貌特征（见上文），可在不同的尺度范围内发生。一方面，仅有亚微米级的种植体表面特征参与骨结合—— 表现为骨类水泥线基质与此类表面的相互嵌合，这种现象已在生物活性玻璃、陶瓷及网状金属氧化物中被观察到。另一方面，骨组织（有时包含完整的血管系统）可长入种植体表面的多微米级或宏观尺度的结构特征中18。这两种情况均能实现骨组织在种植体表面的锚定，但其作用机制明显不同。然而，上述大多数力学测试方法存在一个共同缺陷，即施加的破坏力方向被严格设定为与种植体表面完全垂直或完全平行（取决于采用拉伸模式或剪切模式）。本文报道了一种克服该局限性的方法。

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方案

1. 植入物设计、制备与表面处理

  1. 使用商业纯钛（cpTi）制造矩形植入物（尺寸为 4 mm × 2.5 mm × 1.3 mm；长 × 宽 × 高）。沿植入物长轴中心钻一个孔（直径 = 0.7 mm），以增强植入物在手术部位的初期稳定性，并便于后续的力学测试（图 1）。
  2. 处理植入物的上表面和下表面。
    1. 为形成两种不同的表面，采用标准的喷砂（GB）处理，以构建具有复杂微米级形貌的表面。进一步对其中一半的植入物叠加磷酸钙（CaP）纳米颗粒，以构建具有复杂纳米级形貌的表面。

注意：可根据拟解决的实验问题的性质，采用不同的化学或机械处理方法来构建所需的表面形貌和/或化学特性。在本文提供的示例中，一组工业纯钛（cpTi）种植体经过喷砂处理（GB）—— 一种减材工艺—— 以形成复杂的微米级形貌。其中一半种植体进一步通过添加磷酸钙（CaP）纳米晶体进行改性，从而构建叠加的纳米级形貌（GB-DCD）。

注意：在10,000倍 放大下观察经喷砂处理的微米级表面与经修饰的纳米级表面时，表面特征无明显差异。然而，在100,000倍 放大下观察时，差异变得十分明显 （图2）。先前已有研究表明，此类表面改变对骨引导作用具有显著影响14。

2. 动物模型与手术步骤

  1. 使用年轻的雄性Wistar大鼠（200–250 g）建立本模型。所有实验操作必须经当地动物护理委员会批准。动物可自由获取饮水和大鼠标准饲料。
    注意：选择Wistar大鼠进行本实验是由于此前对该品系大鼠具有使用经验，但也可采用其他大鼠品系。食物和水的获取条件可根据具体研究问题的性质进行调整。

  2. 使用鼻罩吸入麻醉法对大鼠进行麻醉：1 L/min 氧气中含 4% 异氟烷2/分钟 用于诱导；1 L 氧化亚氮和 0.6 L 氧气中含 2% 异氟烷2/分钟以维持麻醉状态。在继续操作前，进行标准的足趾夹捏测试以确认麻醉效果。
  3. 术前和术后通过皮下注射给予 0.01–0.05 mg/kg 的布托啡诺作为镇痛剂。
  4. 通过部分随机分配，将植入物双侧植入大鼠股骨远端干骺端。该方法可在同一只大鼠的左右股骨中分别植入来自不同表面形貌选择的两种不同植入物，实现对侧比较，从而优化统计分析。
  5. 剃除动物体毛 用10%聚维酮碘清洁每只后肢的前外侧区域。为防止低体温，将麻醉后的大鼠置于循环温水垫上。
  6. 使用15号手术刀沿大腿外侧皮肤做切口以暴露肌肉。采用钝性分离技术牵开肌束，以微创方式暴露股骨远端。
  7. 使用骨膜剥离器刮除覆盖在股骨表面的薄层骨膜，以充分暴露皮质骨用于钻孔。在钝性分离和去除骨膜时，必须注意避免损伤膝关节的生长板和关节软骨。
  8. 清洁并检查后，将股骨向外旋转，以暴露股骨远端的前表面（图3A).
  9. 为准备手术区域，通过骨组织的两层皮质骨，在骨中央钻出一个贯穿双层皮质的矩形槽。为避免组织过热，手术助手必须在钻孔全程持续进行生理盐水冲洗。钻孔操作分为三个阶段进行：
    1. 首先，使用连接在牙科手机上的1.3 mm牙科钻头，穿透经解剖暴露的前侧皮质骨，在股骨中线上钻出两个相距2.5 mm的孔。
    2. 接下来，使用第二个钻头（1.3 mm 锥形牙科磨头）将这些孔延伸穿过对侧皮质，形成双侧皮质的平行孔。
    3. 最后，使用第三根定制的侧切钻头，沿近远中方向连接各孔，形成种植体植入位点图3B).
  10. 使用附带的针将可吸收缝线穿过骨缺损，并绕过股骨外侧皮质返回。
  11. 将植入物穿入缝线的自由端，并引导其进入缺损部位，使其紧密嵌合。在此过程中，植入物的长轴应垂直于股骨的长轴。图3C).
  12. 在术后恢复期和愈合早期，将缝线环绕股骨外侧以提供植入物稳定性。使用剩余缝线缝合肌肉组织，并用外科缝钉（9 mm 伤口夹）重新对合皮肤组织。
  13. 检查手术部位是否有感染迹象，并每日监测动物的行走能力。在处死时未能完全恢复行走能力或出现股骨骨折的动物，应从分析中排除。

3. 样品采集

  1. 术后第9天，经CO2暴露后通过颈椎脱位法处死动物。
  2. 处死后立即分离股骨并清除软组织。立即将标本保存于15%蔗糖缓冲液中，以维持组织水合状态，为后续力学测试做准备（图4A）。
    注意：标本在设施间转运过程中需保存于蔗糖缓冲液中以维持组织水合。在进行力学测试前，标本将在溶液中保存约2–3小时 。

  3. 为进行力学测试，使用连接高速系统的圆柱形金刚砂钻头，将骨组织修剪至与植入物宽度一致。最终测试标本为植入物两面各连接一段骨弓结构（图4B）。若在制备或运输过程中有骨弓脱落，则该标本的力学测试值记为0 N。
    注意：修剪标本时必须极为轻柔且精准，以避免损伤或预加应力于界面。骨修复性骨痂可沿植入物长轴生长，甚至侵入纵向孔洞。此类多余骨组织必须通过精确修剪至矩形植入物的准确尺寸予以清除，否则可能干扰力学测试结果。

4. 机械测试

设计了一种定制的可拆卸模具，用于封装每个样本，从而为机械测试提供一种可重复且精确的样本制备方法。该设计能够隔离种植体周围骨组织中0.5 mm的区域，形成一致的测试区域，同时在封装过程中保持样本居中且完全水平，使得施加的力可精确垂直于种植体表面。完整的工程图纸见图5，最终组件见图6。

注意：所有测试均需使用万能材料试验机进行，横梁速度设置为 30 mm/min。测试完成后，如需对残留骨组织进行定性评估，可使用解剖显微镜。

  1. 样本的包埋与力学测试
    1. 将样本从蔗糖缓冲液中取出，并轻轻吸干。
    2. 将样本放置于定制模具中。将销钉水平穿过模具壁上的孔以及植入物中央的孔。将稳定板置于模具后侧，以固定植入物（图7）。
    3. 用可流动牙科复合树脂填充模具底部，并使用高强度固化灯照射60秒进行固化。
      注意：应选择不产生放热反应的复合树脂，因为反应过程中产生的热量可能影响组织特性。
    4. 固化后，打开模具并取出已硬化的样本块。用永久性记号笔在侧弓处画一条细黑线，用于标识。
    5. 将测试样本的预制复制品固定在台钳上，并将装置中心对准力学测试仪的基座。
    6. 将样本牢固固定在台钳中，并将尼龙线穿过植入物上的孔（图8）。将线的两端连接至移动横梁的中心。为保持一致性，始终先标记并测试侧弓部分，然后重复该过程处理内弓部分。

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结果

所有动物在术后恢复期间，其活动能力均随时间推移而增加。这一点非常重要，因为载荷对不同尺度范围的形貌具有不同的影响，我们近期已有报道12。机械测试后试样的典型力-位移曲线如图9A所示，每种种植体表面的平均数据如图9B所示。记录每个试样达到的最大力值，并对各组数据取平均值进行比较（每组 n = 28）。GB-DCD 表面在底层具有复杂微米级形貌的基础上叠加了亚微米级形貌特征，其破坏力显著高于未经修饰的 GB 微米级表面（p < 0.0001）（图9B）。

机械测试后可观察到，92%的样本在目标种植体周围区域发生断裂（图10）。

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讨论

本文提出的力学测试模型为评估骨与候选植入物表面之间骨性结合的锚定性能提供了一种改进方法，因其可实现测试样本与破坏力作用轴之间精确的垂直或平行对齐，并将骨折区域限制在植入物表面半毫米范围内。该模型可便捷地整合到任何经化学或机械方式改性表面的效果比较研究中；但不适用于光滑表面，因这类表面在样本操作过程中易从骨组织上脱落。植入物可由多种生物材料制备而成。数据易于采集，只要力学测试设备经过适当校准，即 最小限度过滤。可使用不同的时间点来评估愈合不同阶段的力学性能。此外，该模型可轻松应用于影响骨愈合的人类疾病动物模型，例如糖尿病、放射治疗和自身免疫性疾病。

该模型最初针对雄性Wistar大鼠设计，但也可轻松适用于其他品系。大鼠的骨骼结构，尤其是股骨，尽管体积较小，但在植入定制假体后仍能承受正常的行走负荷，且术后恢复迅速。由于采用了简单的几何结构，该设计易于扩展应用于更大的动物模型。虽然在小鼠体内也可进行类似手术，但其股骨明显更小，需要使用更小的植入物，并在进行破坏性测试时给操作带来挑战。

由于我们先前在关注早期愈合阶段生物学机...

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披露

作者获得了Biomet 3i（美国佛罗里达州棕榈滩花园）的资金和材料支持。Biomet 3i未参与本稿件的撰写或所述实验的设计。

致谢

作者谨此感谢 Biomet 3i 提供的持续资金支持，特别感谢 Randy Goodman 在定制部件设计与制造方面的帮助。Spencer Bell 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）提供的工业研究生奖学金。我们还要感谢 John Brunski 博士在论文撰写过程中提供的宝贵反馈意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco Life Technologies, Burlington, ON, 加拿大14190-250
10% 中性缓冲福尔马林溶液Sigma-Aldrich Co. LLC., 加拿大HT501128-4L
定制矩形植入物（商业纯钛；尺寸：4 mm × 2.5 mm × 1.3 mm，沿长轴中心钻有 0.7 mm 孔）Biomet 3i, FL, 美国N/A
定制可拆卸模具Biomet 3i, FL, 美国N/A
异氟烷Baxter Internationl Inc.N/A
丁丙诺啡Bedford LaboratoriesN/A
10% 聚维酮碘Bruce Medical, MA, 美国FR-2200-90
手术刀Almedic, Medstore, 多伦多大学, 加拿大2586-M36-0100
15 号手术刀片（无菌）Magna, Medstore, 多伦多大学, 加拿大2586
24G 骨膜剥离器Spectrum Surgical, OH, 美国EX7
镊子Almedic, Medstore, 多伦多大学, 加拿大7747-A10-108
组织镊Almedic, Medstore, 多伦多大学, 加拿大7722-A10-308
剪刀Almedic, Medstore, 多伦多大学7603-A8-240
吸收性通用手术巾（无菌）Vitality Medical1089
纱布（非无菌）VWR89133-260
25G × 5/8" 针头（一次性）BD, 加拿大305122
注射器（无菌）VWR, 加拿大CABD309653
持针器Almedic, Medstore, 多伦多大学, 加拿大A17-132
Dynarex 外科手套（无菌）Amazon.com2475
外科口罩Fisherbrand, Medstore, 多伦多大学, 加拿大296360759
0.9% 无菌生理盐水Medstore, 多伦多大学, 加拿大 自有品牌1011-L8001
毛发剪Remington, 美国N/A
4-0 PolysorbSynetureSL5627G
9 mm 伤口夹Becton Dickinson, MD, 美国427631
ImplantMED DU 900 和 WS-75 牙科手机 W&H Dentalwerk, 奥地利DU1000US
1.3 mm 扭转钻头Brasseler, GA, 美国203.21.013
1.3 mm 牙科磨头 Biomet 3i, FL, 美国custom
1.2 mm 圆柱形侧切磨头Biomet 3i, FL, 美国custom
圆柱形金刚砂磨头Brasseler, GA, 美国H1.21.014
高速牙科钻孔系统手机：KaVo Dental Corporation, IL, 美国N/A
手机控制器：DCI International, OR, 美国
99.5% 超纯蔗糖BioShop Canada Inc., Burlington, ON, 加拿大57-50-1
可流动牙科复合材料Filtek Supreme Ultra Flowable Restorative, 3M ESPE, St Paul, Minnesota, 美国6033XW
Sapphire Plasma Arc 高强度固化灯Den-Mat Holdings, Santa Maria, CA, 美国N/A
Instron 4301 配 1000 N 负荷传感器Instron, Norwood, MA, 美国N/A
Leica Wild M3Z 立体变倍解剖显微镜Leica, Heerbrugg, 瑞士N/A
QImaging Micropublisher 5.0 RTV 数码相机，配备 QCapture 2.90.1 采集软件QImaging, Surrey, BC, 加拿大N/A
电子数显卡尺 Fred V. Fowler Company, Inc., Newton, MA, 美国N/A
力学测试仪器Instron, Norwood, MA, 美国N/A

参考文献

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