本报告介绍了一种简单快速的鞘内穿刺技术，可在短暂轻度麻醉条件下对小鼠腰段脊髓进行局部siRNA转染。
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本文内容
摘要
摘要
本报告介绍了一种非侵入性急性鞘内注射的逐步操作技术 即 与导管植入无关。该手术技术的技术局限在于操作者手部的精细程度。注射过程迅速，尤其对于经过训练的实验人员而言；由于该技术对组织的破坏极小，因此可进行多次注射；此外，机体对异源工具的免疫反应（例如导管）不会发生，从而更准确、特异地反映脊髓的调控作用。由于药物主要局限于脊髓靶向区域，无需使用大剂量给药；更重要的是，可避免全身给药时常见的对其他组织的不良影响。1,2此外，我们将该技术与 体内 利用聚乙烯亚胺（PEI）试剂转染核酸3，这为研究脊髓功能提供了极大的灵活性 通过 递送药理学制剂以及基因、RNA 和蛋白质调节剂。
引言
脊髓是多种关键生物过程和生理功能的重要中枢，包括对伤害性（伤害感受性）传入信号的处理与传导4-7。为实现对脊髓的药理学调控，已发展出多种实验技术，例如鞘内导管的慢性植入8、脊髓微量注射以及鞘内穿刺注射9。每种技术各有优缺点，其适用性取决于具体的实验设计。虽然鞘内导管的慢性植入在大鼠中较易实现，但由于小鼠体型限制，该方法在小鼠中实施极为困难。由于导管在小鼠本就狭窄的硬膜下腔占据较大空间，导致手术成功率极低，并常引发运动功能障碍。此外，慢性植入的导管易发生频繁堵塞，使药物的长期递送难以实现。最后，还常出现免疫反应。
通过采用急性鞘内注射方法可避免上述问题 通过 在没有预先植入导管的情况下，使用一根针即可实现将药物和试剂快速且解剖位置局限地递送至小鼠脊髓。该方法完全保留了鞘内给药相较于其他全身性给药途径的优势例如 口服、静脉注射、腹腔注射 等等。例如脊髓调节的特异性，可降低剂量并限制副作用，以及递送物质的能力 通常不会穿过血脑屏障，因为在鞘内注射时，针头被插入硬脑膜与脊髓之间的间隙。然而重要的是，与其他鞘内给药方法相比，鞘内针注射法侵入性最小，可在同一动物体内进行多次应用，而不会造成明显的组织损伤，也不会因植入外来材料而引发免疫反应。但该方法需要较高的技术技巧，以精确地定位针头位置，从而确保疗效。
本文通过可视化方法演示了精准靶向腰段脊髓以实现最佳成功率的操作步骤。本实验选择在腰椎第5和第6节（L5与L6）椎体之间的沟槽处进行注射，该位置靠近脊髓末端，可最大限度降低脊柱损伤的风险。此外，我们还展示了利用该技术通过siRNA在脊髓中实现基因敲低的方法。
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方案
所有动物使用程序均符合当地管理机构（德国卡尔斯鲁厄政府区，卡尔斯鲁厄，德国）制定的伦理准则。
1. siRNA/PEI 复合物的制备
按照制造商的说明，制备siRNA/PEI复合物溶液，步骤如下：
- 溶液 A：将所需量的 siRNA 用无菌水（如有必要）稀释至终体积的四分之一，再用 10% 葡萄糖溶液进一步稀释至终体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。siRNA 的最佳用量需通过实验确定，但每只动物使用 10 µl 复合溶液中含 1 µg siRNA 是优化实验的良好起点。
- 溶液 B：将所需体积的 PEI 试剂用无菌水稀释至终体积的四分之一，再用 10% 葡萄糖溶液进一步稀释至终体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。
注意：PEI 试剂的用量决定了复合物中的离子平衡，从而影响转染效率。同样，PEI 溶液的最佳用量也需通过实验确定。在我们的实验条件下，每 1 µg siRNA 对应的最佳 PEI 溶液体积为 0.12 μl。 - 将溶液 A 与溶液 B 一次性混合，轻轻涡旋。
- 混合后的溶液在使用前于室温孵育 15 分钟。该复合物在室温下可稳定 2 小时，在 4 °C 下可稳定 24 小时。
2. 鞘内注射
- 使用3%异氟烷麻醉小鼠，直至其翻正反射消失。 此外，通过检查尾部和/或足垫夹捏反射进一步确认麻醉状态。
- 在动物尾根部后端约2 cm2区域剃毛，以便在针头插入过程中获得更好的视野。
- 将小鼠置于鼻罩中以在操作期间持续给予异氟烷，将其浓度降至1.5%，并用眼用润滑剂覆盖小鼠眼睛。
- 使用连接30 G 0.5英寸针头的25 µl Hamilton注射器，准备即用型siRNA混合溶液。
- 定位L6棘突（应为最突出的棘突），并通过轻压固定该区域的脊柱。
- 小心地将针头插入L5与L6椎骨之间的沟槽，并观察是否出现尾巴抽动，此现象表明针头已成功进入硬膜内腔。
提示：可用指甲触诊定位该沟槽。 - 一旦观察到尾巴抽动，应立即但小心地用一只手固定针头位置，同时用另一只手缓慢注入所需体积的物质。
提示：注入体积在5–10 µl之间为最佳，因体积小于5 µl不可靠，而大于10 µl则会导致压力过高。 - 注射完成后，将小鼠移回笼中，使其从麻醉中恢复。
- 为实现靶基因的最佳下调，每隔24小时重复注射至少2次。
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结果
为了展示一次成功的注射，我们采用快绿FCF染料对成年C57Bl6小鼠（8-10周龄）进行了该技术操作。注射后让动物恢复数分钟，以使染料充分扩散，随后通过过量CO2处死动物。接着解剖脊柱并暴露脊髓。可见蓝色斑点对应扩散的染料，标记了注射位点。未观察到脊髓损伤迹象，证实该技术具有微创性（图1A）。染料从注射部位向头侧扩散，仅在注射后数分钟内即到达脊髓胸段区域（图1B）。此外，染料成功注入硬膜外腔可通过脊髓表面被染色而内部未染色得以证实（图1C）。
此外，该技术结合PEI试剂盒，能够实现siRNA对脊髓的高效体内转染。在进行鞘内注射siRNA（每24小时一次，共3次）后，从腰段L3-L5背侧脊髓组织提取物中检测到靶蛋白（此处为WAVE1）的表达水平在蛋白水平降低至约70%（图2A，n = 20），mRNA水平也出现类似下降（图2B，n = 6）。此外，在腹侧脊髓组织提取物中也观察到...
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讨论
因此，上述描述的鞘内穿刺注射技术具有高效、快速、定位精确且无创的优点。从技术上讲，该操作最关键的环节是穿刺针插入沟槽的位置。实施此操作时必须保持手部极度稳定并具备耐心。与许多外科手术一样，经过训练可提高注射成功的几率。这一点尤为重要，因为在实际实验过程中，该技术无法提供明显的直接指标来确认注射是否成功。唯一可见的正确穿刺指标是观察到作为反射反应的尾巴抽动。
该方法完全保留了鞘内给药相较于其他全身给药途径的优势例如 口服、静脉注射、腹腔注射 等等。），例如脊髓调节的特异性，这使得用药剂量减少并限制了副作用；此外，鞘内注射能够递送通常无法穿过血脑屏障的物质，因为在鞘内注射时，针头被插入硬脑膜与脊髓之间的间隙。然而重要的是，与其他鞘内递送方法相比，鞘内针注射法侵入性最小，可在同一只动物身上进行多次应用，而不会造成明显的组织损伤，也不会因植入外来材料而引发免疫反应。
综上所述，本报告不仅展示了急性鞘内注射的常规逐步操作方法，还提供了一种该技术的改进应用实例，即通过此方法可在活体（in viv...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 体内-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| 对照 siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| 抗-ß-微管蛋白 III 抗体 | Sigma | T2200 | |
| 抗-WAVE1 抗体 | R&D Systems | AF5514 | |
| 快绿染料 | Sigma | F-7252 | |
| 异氟烷 | Baxter | ||
| 异氟烷装置 | Dräger Lübeck | ||
| 剃毛器 | Wella | ||
| Hamilton 耐压注射器 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 英寸 13 mm 针头 | BD Microlance | 304000 | |
| Leica MS5 显微镜 | Leica | ||
| 用于 qRT-PCR 的 WAVE1 正向引物 | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| 用于 qRT-PCR 的 WAVE1 反向引物 | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
参考文献
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重印与许可
