本文描述了一种利用 C. elegans的缺氧/饥饿模型来模拟缺血/再灌注损伤的实验方案。功能学检测指标包括死亡率升高、GFP标记的神经元突起出现可见异常，以及依赖神经元功能的行为反应受损。
本文内容
摘要
摘要
在遗传学模式生物C. elegans中，缺氧/饥饿实验方案可模拟缺血/再灌注损伤。将线虫从细菌食物中分离，并置于无氧环境中20小时 （模拟缺血），随后转移至含有食物的正常大气环境（模拟再灌注）。该实验范式可导致死亡率升高及神经元损伤，本文介绍了评估生物体存活率、触觉神经元突起形态变化以及触觉敏感性的技术，后者反映了神经功能的行为学输出。最后，本文描述了一种利用常见厨房储物容器构建低氧培养箱的方法。添加质量流量控制装置可调节定制培养箱中的气体混合物，而循环水浴系统则可实现温度控制，并便于检测泄漏。该方法为 commercially available units 提供了一种低成本替代方案。
引言
C. elegans 是一种线虫，自布伦纳引入以来1，已被广泛用作多细胞真核模式生物。它是一种经济、简单且用途广泛的模型，能够便捷地建立基因改变与表型变化之间的关联2。
缺血的特征是组织缺乏营养物质和氧气供应，随后发生再灌注，在此期间会大量产生活性氧，并造成大部分损伤3。2002年，建立了一种在C. elegans中模拟缺血/再灌注（IR）的模型4，该模型使整个线虫经历约20小时的缺氧、营养剥夺和热应激 ，随后在正常条件下恢复24小时 。尽管该模型在技术上属于缺氧-饥饿（AS）条件，但其导致的细胞死亡机制在哺乳动物中是保守的，包括再灌注期间由氧化剂引起的损伤5。此外，与哺乳动物的缺血/再灌注损伤类似，C. elegans中由AS引起的损伤可通过缺血预处理6,7或麻醉预处理8,9加以预防。
以下方案展示了如何利用AS模型在C. elegans中模拟IR，如何评估由AS引起的形态学和行为学异常，以及如何对方案进行改进，使其可通过一种自制且易于构建的替代培养室来实施实验，从而降低初始投入成本。
方案
1. C. elegans 的培养
- 根据标准培养方法，准备接种了OP50细菌的35 mm线虫生长培养基（NGM）琼脂平板1。
- 通过将6只性成熟成虫置于接种NGM平板上以同步化C. elegans。当产下约100个卵后（约3小时），移除成虫。
- 将平板在20 °C下孵育3天，此时线虫已发育至年轻成虫阶段，最适合本实验使用。其他同步化C. elegans的实验方案已在别处描述10。
2. AS 实验材料
- 在实验前30分钟，应使用N2（也可用氩气）对M9缓冲液（22 mM KH2PO4、42 mM Na2HPO4、86 mM NaCl、1 mM MgSO4）进行充氮除氧处理，并将其置于冰中保存。
- 在用于AS实验的1.5 ml 微量离心管盖上打一个直径约3 mm的小孔，以便线虫放置其中时可进行气体交换，同时避免打开管盖导致培养基过度蒸发。
3. 缺氧/饥饿
- 所有实验至少重复三次。
- 加入 1 ml 加入35 mm培养皿中，每皿加入含氧的M9缓冲液 在含有如上所述培养的年轻成虫线虫的培养皿中加入 M9，注意避免将细菌从培养皿中移除（将 M9 加至未接种细菌的培养皿边缘）。约 1 分钟后，线虫应悬浮于 M9 液体中游动。
- 包被一个 1 毫升 用移液器吸取并排出无菌的1% BSA溶液，以预润洗移液器吸头。
- 将含有线虫的M9缓冲液平板小心倾斜，从原先加入M9的位置吸除M9缓冲液，将悬液转移至预先准备好的微量离心管中。置于冰上静置，直至线虫沉降至管底（约1–2分钟）。
- 尽可能多地移除M9溶液，但不要扰动管中的线虫（保留约100 μl），然后加入1 ml 将脱氧并预冷的M9加入离心管中，并将离心管置于冰上，直至线虫再次沉降至管底。重复该步骤3次。最后一次洗涤时，吸除M9溶液，保留约100 μl。 保留在管中。
- 将装有线虫的试管放入缺氧的M9溶液中，并置于厌氧/低氧培养箱内（详见下文第部分说明） 3.6.1）或 alternatively 转移至定制的密封容器中（参见下文第 3.6.2 节说明）。
- 若使用商用无氧/低氧培养箱，在开始步骤3.5之前，将部分已除氧的M9培养基留在培养箱内，并在将线虫放入培养箱后重复步骤3.5。
- 如果要使用定制的培养室，本方案末尾提供了如何构建低成本装置的详细说明，此前已有其他研究团队对此进行过描述。11简要地：
- 在250 毫升 Tupperware 型容器盖，并在上面安装管路连接器。其中一个用于注入气体混合物，另一个则作为气体出口通入水浴中。
- 将线虫放入腔室中，并用盖子密封腔室。
- 氮气恒定的气体2 流速（100 ml/min）。
- 将容器置于26 °C水浴中。确保出口管充分浸入水中，防止空气倒流，并确认系统无泄漏（若反应室本身产生气泡则表明有泄漏）。
- 在26 °C下孵育线虫20小时。
4. 模拟再灌注
- 在AS条件下培养20小时后，将试管从培养室中取出，置于室温空气中。
- 使用经BSA包被的吸头（同步骤3.3）将秀丽隐杆线虫（C. elegans）转移至接种了OP50的大肠杆菌、直径为35 mm的NGM平板上。将平板在20 °C条件下培养24小时。此后，线虫即可用于表型评分。
5. 鉴别线虫的死活
- 使用铂金挑针轻轻触碰线虫头部顶端。活体线虫受触碰后会向后移动。若线虫无任何反应，则记为死亡。偶尔，某些线虫虽不向后移动，但可能表现出轻微的左右头部摆动。尽管从技术上讲尚未死亡，但这些线虫极有可能在数小时内死亡，应记为死亡。若计数时间延迟过久，子代可能在体内孵化，形成“虫袋”，并最终破裂，导致尸体难以辨认。
- 计数时应将活体与死亡线虫均从培养皿中移除，以避免重复计数。活体线虫可转移至另一培养皿以进行行为学实验。存活线虫数量占总数的比例以存活率（%）表示（图 1A）。
6. 触碰反应检测
- 该方案的详细描述已发表于Hart, Anne C.（编）. Behavior（2006年7月3日），WormBook，The 秀丽隐杆线虫 科研社区，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.87.1，http://www.wormbook.org
- 为了评估触觉反应，需识别正在移动的线虫，并使用睫毛挑针轻轻触碰线虫头部侧面（靠近咽部中段位置）图 3).
- 如果线虫向后移动，则记为有反应；否则记为无反应（图 1B）。每个线虫重复此步骤 10–15 次，每次间隔 10 秒。每组至少检测 10 条线虫，以获得准确的数据。该实验方法也可用于评估对后部体壁施加轻触刺激后前向运动行为的变化。注意避免触碰线虫的头部或尾部，因为这会引发不同的行为反应。
- 最后，加入遗传对照品系 [N2 布里斯托尔野生型作为阳性对照，mec（机械感觉）突变体作为阴性对照] 例如 CB1338 mec-3 (e1338)IV] 用于校准触碰线虫的力度。刺激过强会在 mec 突变体中引发行为反应，而刺激过弱则无法在野生型 N2 对照中引发反应。
7. 神经元的修饰
- 为了观察AS后神经元的形态变化，可使用一种在触觉响应性mec神经元中表达GFP的品系4,5。这些神经元具有沿体壁延伸的长突起，易于评估其形态学异常。此外，如上所述，形态学信息可与神经元功能的行为学检测指标相结合。可用于此目的的一个品系是TU2583，该品系可从 C. elegans 遗传中心获得，含有uIs25整合型转基因，可在mec-18启动子驱动下表达GFP；或者也可选用TU2562，该品系含有整合的mec-3::GFP融合基因。
- 制备琼脂糖垫。
- 将2%琼脂糖溶于水中，加入10倍浓缩的M9缓冲液配制成1×M9溶液，并将溶液保持在70 °C。
- 取一滴（约20 μl）该溶液置于载玻片（25 mm × 75 mm）上，载玻片应放置在另外两片载玻片之间，每片外侧载玻片的底面贴有一条胶带。
- 将最后一片载玻片垂直置于2%琼脂糖溶液上方，静置于室温冷却。形成的垫层厚度应与胶带厚度一致。
- 移去顶部载玻片，加入10 μl 含0.1%左旋咪唑（tetramisole）的M9溶液，以固定线虫。
- 将约10只活体线虫转移至2%琼脂糖载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下使用100X 物镜及适当的激发光源观察GFP信号。
- 受损神经元在其突起中会呈现细胞质膜“串珠样”结构，表现为多个点状聚集物（图 2A），和/或出现突起断裂样异常（图 2B）。对每只线虫的两个神经元分别计数点状聚集物和异常结构，总共至少检测10只线虫。
8. 实验室自制缺氧室
- 可将一个类似特百惠的可密封、气密容器改装为无氧室。应尽量选择尽可能小的容器，因为较小的容器能更快形成低氧环境，也更容易放入水浴中（图 4）。
- 在盖子上打两个孔（可用螺丝刀或加热镊子后压入盖子完成），插入与管路匹配的塑料或金属接头（图 5A）。使用可在水下使用的胶水，并确保其干燥后能牢固固化，以防止接头移动，从而减少泄漏的可能性（图 5B）。
- 应将容器完全浸入水浴中（图 4）。为使容器沉入水中，可使用瓶重物或潜水配重。
- 其中一个管路接口用于通入混合气体，另一根管路则作为压力释放口，因此应将其保持在水面以下，以确保容器与外部环境完全密封（图 4）。
- 可通过定制气体、质量流量控制器或任何可混合所需气体的装置来调节空气组成。应控制气体流速，因为过高的流速可能导致过度蒸发。例如，在250 ml 的容器中，100 ml/min的气体流速可为线虫提供充足的空间和适宜的气体通量。
- 管路长度应尽量缩短，因为管路材料可能对气体具有通透性，导致O2进入。应避免使用硅胶或Tygon管，这些材料易于发生气体交换。我们更倾向于使用聚丙烯或尼龙管。玻璃或金属管路对气体的阻隔性良好，但操作难度较高。
结果
如第 3.6.2 节所述，在自制的培养室中将 C. elegans 暴露于 26 °C 下持续 20 小时的热应激（AS），导致显著的死亡率（图 1A）5。随后对存活个体中 GFP 标记的神经突触的点状结构和断裂进行荧光成像，证实了存在形态学异常（图 2）。这些存活个体对轻度体壁触碰的反应也明显减弱（图 1B）。该模型已被多个研究团队用于研究遗传易感性、药物干预以及代谢可塑性如何影响热应激依赖性结果4-6,8,9,12,13。
图1. C. elegans 在AS后的生存率和触碰反应。 A) AS后24小时存活的线虫百分比。N2品系为野生型遗传背景，KWN85品系含有一个整合的转基因，可使mec神经元表达GFP标记。 B) 活体C. elegans（N2品系）在AS后对触碰刺激的反应。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. AS后触觉神经元的改变。 在AS处理后存活的麻醉 C. elegans 中观察触觉神经元（PLML和PLMR）的异常，例如轴突扭曲和断裂（A），或轴突中GFP聚集体的积累（B）。
图3. 睫毛挑取工具。 组装好的睫毛挑取工具。插图中显示了粘附在牙签木端的睫毛细节。
图 4. 水浴中自制的缺氧室。 一个已准备就绪、可开始实验的密闭容器。箭头指示气体的入口和出口，以及用于防止容器上浮的配重瓶。
图 5. 容器盖内部与外部结构细节。A) 容器盖外部，显示连接在预先打好的孔上的管及其连接器。B) 容器盖外部，显示连接在预先打好的孔上的管连接器。
讨论
AS 已被广泛用于 C. elegans 中模拟缺血再灌注（IR）损伤。本实验方案中需强调几个关键点：C. elegans 对多种损伤具有较强抗性，因此需要同时施加三种损伤刺激（高温、饥饿和缺氧），才能在此系统中诱导死亡。在该时间窗口内，单独缺氧本身并不足以杀死线虫14。此外，温度升高是一种额外的应激因素，因此必须密切监测。严格来说，饥饿本身对观察到的死亡率影响并不显著7，per se，但它似乎能够降低实验重复间的变异性。鉴于实验结果可能存在较大的日间差异，必须将样本进行平行对照比较，并在多个不同日期重复实验。通常，每种实验条件下使用三个独立培养皿，每个培养皿包含 50–100 条线虫，结果取平均值作为一次独立的实验重复。一般而言，进行七到九次重复实验足以判断或排除统计学显著性。
实验所用线虫的发育阶段也需要仔细监测，因为不同阶段对AS损伤的敏感性存在显著差异15,16。通常采用年轻成虫，而幼虫阶段（L3和L4）的线虫对AS损伤作用表现出更强的抗性（未发表数据）。
本方案提供了两种实验操作方法：一种使用实验室自制装置（采用乐扣盒类容器和气体输入11），另一种使用商用低氧培养箱4,6。缺氧状态也可通过其他耗氧方式实现，如其他文献所述13,17。采用不同技术构建低氧环境可能会影响AS处理所需时间，从而影响预期死亡率的达成。以约20%存活率为靶目标是研究保护性干预措施的理想起点，而约80%存活率则适用于研究加重AS有害效应的干预措施。另一个重要的注意事项是观察者判定线虫死亡/存活的时间点。若分析时间超过24小时，数据可能产生误导，因为死亡线虫将越来越难以识别。这可能是由于线虫尸体随时间推移逐渐变得透明，同时也可能是因为受精胚胎可在尸体内部继续发育并在孵化时破坏尸体结构所致。
通过替换表达相应基因编码标记物的线虫品系，可将神经元形态学分析方法用于检测蛋白质表达模式18、细胞核断裂4及其他参数19。最后需要注意的是，在将线虫放置于载玻片上后，应在30分钟内完成神经元突起的观察。长时间处于麻醉状态下的线虫可能会出现与AS无关的损伤。应根据追踪和分析所需时间调整每张载玻片上的线虫数量。
披露
作者无任何披露信息。
致谢
图1 和 2 此前发表于 自由基生物学 & 医学 (Queliconi 等5）的版权由Elsevier持有。本工作得到了 圣保罗研究基金会（FAPESP）、国家生物医学氧化还原过程科学与技术研究所、生物医学氧化还原过程研究支持中心、美国公共卫生服务基金 NS064945（K.N.）以及美国公共卫生服务基金 GM087483（K.N.）。B.B.Q. 是获得 FAPESP 奖学金资助的博士研究生。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| N2 菌株 | CGC | 野生型菌株。 http://www.cbs.umn.edu/CGC/ | |
| TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC | TU2583 | 用于标记触觉神经元的整合型荧光转基因 http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| CB1338 mec-3 (e1338IV | CGC | CB1338 | 触觉不敏感的经典 mec-3 突变体。 http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| 微量离心管 | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 尼康Eclipse TE2000-U显微镜 | 尼康美国 | TE2000-U | |
| 低温培养箱 | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
| 睫毛镊 | 可用以下方法制备睫毛挑针：将 将一根睫毛粘到一根木制牙签上，然后将牙签固定在玻璃巴斯德移液管中（<强>图3). | ||
| 缺氧室 | 郊狼 | 8307030 | 配备钯催化剂和 CO 的缺氧手套箱2 控制器 |
参考文献
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Maine, E. M. Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference. Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).
- Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia. Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).
- Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2. Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).
- Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion. Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).
- Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).
- Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans. Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).
- Jia, B., Crowder, C. M. Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans. Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).
- Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport. PloS One. 6 (12), e28287(2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans. J. Vis. Exp. (65), e4088(2012).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS. PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).
- Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).
- Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).
- Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).
- Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury. PloS One. 6 (2), e16288(2011).
- Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development. Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).
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