通过小鼠单颗粒抓取任务研究运动技能学习

摘要

持续练习可提高协调运动的精确性。 本文介绍一种单颗粒抓取任务，旨在评估小鼠前肢技能的学习与记忆能力。 

摘要

抓取并取回物体需要前肢进行精确且协调的运动。当小鼠被反复训练以抓取并获取放置在特定位置的食物奖励时，其运动表现（定义为准确性和速度）会随着时间推移而逐步提高，并在持续训练后趋于稳定。一旦掌握这种抓取技能，其后续的保持便不再需要持续练习。本文介绍了一种单颗粒抓取任务，用于研究小鼠前肢熟练运动的习得与维持过程。在本视频中，我们首先描述在此学习与记忆范式中常见的小鼠行为，然后讨论如何对这些行为进行分类并量化观察结果。结合小鼠遗传学，该范式可作为一种行为平台，用于探索学习与记忆的解剖基础、生理特性及分子机制。

引言

理解学习与记忆背后的机制是神经科学领域最大的挑战之一。在运动系统中，通过练习获得新的运动技能通常被称为运动学习，而对先前已学会的运动技能的保持则被视为运动记忆¹。学习一项新的运动技能通常表现为所需运动表现随时间逐渐改善，直至达到技能被完全掌握或表现足够稳定的状态。在大多数情况下，已获得的运动记忆可以长期保持，即使不再进行练习。在人类中，使用正电子发射断层扫描（PET）和功能磁共振成像（fMRI）的神经影像学研究显示，初级运动皮层（M1）在运动技能学习的获取阶段其活动会发生变化^2-4，而通过低频经颅磁刺激暂时干扰M1活动会导致运动行为改善的保持显著受损⁵。类似地，在大鼠中进行前肢特异性训练会诱导M1区发生功能性和解剖性可塑性变化，表现为在运动技能学习后期，训练侧前肢对侧M1区的c-fos活性以及突触/神经元比率均增加⁶。此外，类似的训练范式还会增强对侧M1层2/3中与训练前肢相对应区域的横向连接，导致大鼠掌握任务后长时程增强（LTP）降低而长时程抑制（LTD）增强⁷。然而，这种突触修饰在对应于未训练前肢或后肢的M1皮层区域中并未观察到⁸。另外，当M1因中风而受损时，会出现明显的前肢特异性运动技能缺陷⁹。尽管大多数运动行为研究是在人类、猴子和大鼠上进行的^2-8,10-17，但由于小鼠具有强大的遗传学工具和较低的研究成本，现已成为一个极具吸引力的模型系统。

本文介绍了一种针对前肢的特定运动技能学习范式：单颗粒取食任务。在此范式中，小鼠被训练通过一个狭窄的狭缝伸出前肢，抓取并取回位于固定位置的食物颗粒（小米种子），这种行为类似于人类学习射箭、投掷飞镖或投篮的过程。该取食任务是在先前大鼠研究的基础上改进而来的，已有研究表明小鼠 和大鼠¹⁸在该任务中表现出相似的结果。利用双光子经颅成像技术，我们之前的研究长期追踪了训练过程中树突棘（大多数兴奋性突触的突触后结构）的动态变化。我们发现，一次训练即可迅速诱导出新的树突棘，这些树突棘出现在运动皮层中对侧于训练前肢的锥体神经元上。随后对同一取食任务的训练则优先稳定了这些由学习诱导产生的树突棘，使其在训练结束后仍长期存在¹⁹。此外，在重复执行取食任务过程中新形成的树突棘倾向于在树突上成簇出现；而当同时执行取食任务和另一项前肢特异性的运动任务（i.e. 意大利面操作任务）时，所形成的树突棘则不会成簇²⁰。

在本视频中，我们逐步介绍这一行为范式的建立过程，从最初的禁食处理、行为塑造到运动训练。我们还描述了小鼠在执行该行为范式过程中的常见行为，以及这些行为的分类与分析方法。最后，我们讨论了实施此类学习范式时需要注意的预防措施，以及在数据分析过程中可能遇到的问题。

方案

本手稿中描述的实验均依照加州大学圣克鲁兹分校机构动物照护与使用委员会制定的指南和规定进行。

1. 实验准备（另见材料列表）

1. 使用小米种子作为食物颗粒。
2. 使用定制的透明聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas ）训练室（外部尺寸高20 cm、深15 cm、宽8.5 cm，聚甲基丙烯酸甲酯厚度为0.5 cm），其包含三个垂直狭缝（“塑形”侧一条狭缝，对侧“训练”边两条狭缝）。垂直狭缝应宽0.5 cm、高13 cm，位于盒子前壁：居中、左侧和右侧各一（图1A）。
3. 使用倾斜托盘盛放在塑形阶段使用的种子。该托盘可由三块载玻片定制制成（图1B）。
4. 准备一个食物平台（长8.5 cm、宽4.4 cm、高0.9 cm）。在训练期间，将此食物平台置于训练室的前侧（面向训练者）。食物平台上有两个用于固定种子的凹槽，分别位于左侧和右侧。凹槽距离长边边缘0.3 cm，距离宽边边缘2.4 cm（图1C）。左、右凹槽分别对应小鼠训练室中的左、右狭缝，用于优势前肢的训练。设置这些凹槽的目的是确保每次抓取尝试时种子均被放置在相同位置。
5. 实验过程中需准备好镊子、电子天平和秒表。

2. 食物剥夺（2 天）

1. 称量每只小鼠的体重，以获得食物剥夺前的基础体重。
2. 对小鼠进行为期2天的食物限制，以启动体重下降。通常情况下，每天给予小鼠每克体重0.1克食物（例如 一只体重为15 g的小鼠，我们通常从1.5 g食物开始）。根据基础体重、体重下降速率、性别和小鼠年龄调整食物量。尽管在塑形阶段期间体重可能继续略有下降，但应维持较低的体重（即 约为原始基础体重的90%）直至整个训练过程结束（图2A 和 2B）。维持小鼠体重所需的食物量通常与限制期间所用的量相同。

3. 成型（3-7 天）

1. 群体环境适应（第1天）：将两只小鼠同时放入训练室中。在训练室内放置约每只小鼠20粒种子供其食用。让小鼠在训练室内停留20分钟，然后将其放回各自的饲养笼中。
2. 个体环境适应（第2天）：设置与步骤 3.1相同，但将小鼠单独放入训练室中。群体和个体环境适应的目的是使小鼠熟悉训练室环境以及小米种子。
3. 前肢优势判定（第3天及之后）：将训练室的单狭缝侧朝下放置（图1D）。在食槽中装入种子。将食槽向上推紧贴训练室前壁，使种子可被小鼠触及。将小鼠单独放入笼中。若小鼠对食槽中的种子表现出足够兴趣，它们会通过狭缝将种子扒入室内，随后拾取并食用种子。当同时满足以下两个标准时，视为“塑形”完成：1）小鼠在20分钟内完成20次抓取尝试；2）超过70%的抓取动作使用同一只前肢完成。

注意事项：

1. 如果小鼠用舌头将种子送入小室，可将托盘稍向后移，略微增加其伸展距离，以避免小鼠使用舌头获取种子，从而促进其前肢抓取行为。
2. 若小鼠在一周内无法完成训练，则将其剔除出实验。

4. 训练（8天以上）

1. 将训练装置的双狭缝侧朝下放置（图1E）。
2. 将小鼠单独放入笼中。将单粒种子放置在食物平台的凹槽内，该凹槽对应于小鼠偏好的爪子一侧（即 对于右利手小鼠，使用小鼠右侧的狭缝）。
3. 观察小鼠的抓取行为，并根据以下类别进行评分：
   1. 成功：小鼠用偏好爪伸向种子，抓住并取回种子，随后将种子送入口中。
   2. 掉落：小鼠用偏好爪伸向种子，抓住种子，但在送入口中前将其掉落。
   3. 失败：小鼠用偏好爪向种子伸去，但未触碰到种子，或将其从固定板上碰落。
4. 每天训练小鼠进行30次抓取尝试或持续20分钟（以先达到者为准），训练其优势肢体。
5. 训练结束后将小鼠放回其饲养笼，并提供每日定量食物。

注意事项：

1. 在某些情况下，即使食物平台上未放置种子，小鼠也会进行抓取动作。此类抓取被视为 "徒劳的尝试" 且不计入总抓取尝试次数。为防止 "徒劳的尝试"训练小鼠在放置下一颗种子前走回训练室的另一端。类似策略已用于大鼠的相似行为任务中。²¹小鼠有时也会用非偏好爪抓取种子。这类抓取行为被视为“对侧抓取”，不予计数。 对总抓取次数也没有影响。
2. 为减少昼夜节律波动导致的行为差异，所有塑形和训练实验均应在小鼠正常清醒时段的每天同一时间进行。
3. 为避免  由于不同训练者可能导致行为学差异，务必确保同一人在整个实验过程中训练同一批小鼠。
4. 小鼠的注意力对此行为测试至关重要。应在独立且安静的房间内对小鼠进行训练，以尽量减少环境干扰。
5. 小鼠每天可训练超过30次抓取动作（例如 50 次抓取）。增加抓取尝试次数可使研究人员在同一次训练过程中考察行为学改善情况。

5. 数据定量

训练后量化小鼠行为的方法有很多。其中两种最直接的分析方法是：

1. 成功率 = 成功抓取次数除以总抓取尝试次数，以百分比表示。掉落率和失败率可以采用相同方式绘图表示。
2. 成功速度 = 成功尝试次数除以时间，以每分钟成功抓取次数表示。在大多数情况下，即使成功率已达到平台期，成功速度仍会持续增加。

结果

学习曲线：

掌握一项运动技能通常需要长时间持续练习。典型的平均学习曲线包含两个阶段：首先是初始习得阶段，成功率逐步提高；随后是巩固阶段，成功率趋于稳定并达到平台期（图2C）。需要注意的是，不同小鼠的学习曲线存在差异；每只小鼠达到平台期所需天数各不相同，且个体学习曲线通常不如平均曲线平滑。另一种展示小鼠抓取技能进步的方式是成功速度，该指标综合考虑了抓取速度和准确性，反映整体运动表现。通常情况下，小鼠在成功率进入平台期后，成功速度仍会持续提升（图2D）。

除了个体间的表现差异外，部分小鼠无法学会该任务（图2E）。这些“非学习者”小鼠通常会最初尝试抓取种子，但由于未知原因，尽管经过重复训练，表现仍然很差。它们在连续多次尝试失败后，通常会对抓取种子失去兴趣，并在6-8天后停止尝试。相比之下，部分小鼠则表现出过度训练倾向（图2E）。这些体型过大的小鼠通常具有非常高的成功率（>40%），且未带来显著改善（...

讨论

成形阶段的重要性：

由于在陌生环境中会产生更高的焦虑感，小鼠通常很难在新环境中进行训练^21,22。因此，行为塑造的目标是让小鼠熟悉训练室、训练者 （即 降低其焦虑水平）以及任务要求（即 识别小米种子为食物来源）。另一个塑造目标是确定每只小鼠偏好的肢体，以便后续训练使用。在塑造过程中，必须避免过度塑造，因为这可能导致不必要的"抓取练习阶段"，从而在初始学习阶段虚假地提高成功率，导致后续训练中成功率不再提升或提升甚微（图2E）。在这些情况下，过度塑造的小鼠在塑造阶段就已经开始发展抓取技能，而不仅仅是将种子从笼中扒出再拾起食用。唯一能够限制过度塑造的方法是在塑造过程中进行密切观察。过度塑造的小鼠应从数据分析中剔除。另一方面，同样重要的是不能塑造不足。如果小鼠未能识别小米种子为食物来源，或对任务要求不熟悉，和/或焦虑程度过高，则其在训练过程中将遇到困难，并很可能最终成为非学习者（图2E，另见下文"非学习者"部分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透明亚克力训练箱			尺寸信息见 <强>图1A
用于塑形的倾斜托盘			由玻璃载玻片定制而成，参见 <强>图1B
用于训练的食品平台			尺寸信息见 <强>图1C
小米种子			过滤自 “野生鸟类食物 鸽子和鹌鹑混合饲料 野生鸟类食物” （所有生物）
镊子			用于放置种子
一台电子天平			每日体重测量
秒表			用于塑形/训练期间的时间测量