透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

摘要

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。

摘要

长期使用 果蝇 作为细胞与发育生物学的研究模型，已衍生出一系列研究工具。这些技术共同实现了从多种方法学角度对细胞与发育生物学过程的分析。活体成像是一种用于观察细胞动态过程（如细胞分裂或细胞运动）的新兴方法。在鉴定出一些功能未知的细胞周期相关蛋白的突变后，观察有丝分裂过程变得尤为关键 原位 使用活体成像。大多数活体成像研究在 黑腹果蝇 主要关注那些由于体积小且具有光学透明性而便于操作和观察的胚胎阶段。然而，在这些阶段中，细胞周期较为特殊，缺少一个或两个间隙期。相比之下，蛹期翅的细胞 黑腹果蝇 具有典型的细胞周期，并经历一段持续约20小时蛹期发育的快速有丝分裂阶段。易于识别并分离出处于适当发育阶段的蛹，以观察有丝分裂。 原位将完整的蛹进行封片固定，在成像过程中提供了最佳的操作性和耐久性组合，可使实验持续数小时，同时对细胞和个体的活性影响最小。该方法能够观察到小至果蝇染色体或更小的结构。通过调整显微镜参数及优化封片细节，可进一步拓展该技术以观察相邻细胞的膜动力学过程以及荧光标记蛋白（如微管蛋白）的动态变化。该方法适用于所有经测试的荧光蛋白，能够在多种时间尺度下捕捉亚微米级别的结构特征。尽管使用常规共聚焦显微镜时观察深度仅限于蛹体外层约20 µm范围内，但该方法仍为研究蛹期组织中蛋白质与细胞动态过程提供了一种有效手段。 体内 在这些组织的细胞与发育生物学研究中可能具有普遍应用价值。

引言

醋蝇， 黑腹果蝇是研究生物学多个方面的成熟模型。 果蝇 基因实验研究具有悠久的历史，能够实现包括基因表达、基因敲低和基因突变在内的多种复杂基因操作。随着荧光蛋白标记技术的出现，研究手段进一步拓展，可对活体动物中的细胞和蛋白质进行研究。果蝇胚胎是开展此类研究的理想体系，因其体积小且光学通透性好，便于进行深层、高分辨率的成像观察 在体^1-3果蝇发育的其他阶段已被证明较难处理，需要进行麻醉。⁴，解剖与短期培养^5,6或在角质层上创建用于成像的窗口^7,8这些操作通常会从长远上影响动物的发育，或以其他方式对动物造成影响，从而限制成像只能在较短时间内进行。

为了研究与细胞周期调控因子基因相似的基因中的新突变，必须找到一种合适的样本，以观察细胞周期的时间进程和保真度。由于大多数胚胎期的细胞周期是截短的（S-M 或 S-G2-M），且所研究的突变体直到后期才表现出缺陷，因此在蛹期组织中观察细胞周期显得尤为重要。蛹期的上皮细胞具有更典型的 G1-S-G2-M 细胞周期，且此阶段的蛹无法进行肌肉运动⁹。实验操作的初始材料包括完整表达组蛋白2AV-GFP（Histone2AV-GFP）的整个蛹。尽管蛹壳看似不透明，但这种完整的制备样本被证明非常适合长期的活体（in vivo）成像。该技术足够简单，本科生研究人员 routinely 使用它来研究果蝇（Drosophila）的细胞生物学和发育生物学问题，同时其分辨率又足够高，能够分辨微米级的结构特征。通过调节时间序列参数，利用该方法可在数小时、数分钟或数秒内对生物学事件进行连续观察。目前已成功制备了使用蓝色、绿色、黄色、橙色和红色荧光蛋白或其组合的视频。重要的是，只要注意尽量降低激光强度，即使是长期成像也不会对动物的发育或存活产生影响。

方案

1. 果蝇实验

1. 在室温下，将果蝇饲养于标准的玉米粉-琼脂-糖蜜-酵母培养基中¹⁰。
2. 进行杂交时，需在羽化后6小时内挑选处女蝇。与目标基因型的雄蝇交配后，每隔3至4天将果蝇转移至新的培养瓶中。

注意：本实验中使用 Gal4 品系 A9 在翅中驱动转基因的表达。果蝇品系可从布卢明顿（Bloomington）品系中心获取。本实验所用的品系包括 A9-Gal4（Bl#8761）、His2Av-GFP（Bl#5941）、Sco/CyO HsCre（Bl#1092）、UAS-ChRFP-Tub（Bl#25773）、lollibow¹¹。

2. 蛹的选取与固定

1. 可通过收集白色预蛹（WPP）并在25 °C下培养至适当龄期，或根据形态学标准¹²来确定蛹的发育阶段。
2. 为观察细胞分裂，应选择刚完成头部外翻的蛹。从此时起直至羽化前（>96 小时），蛹体保持静止，便于进行长时间的延时观察。
3. 取出蛹时，先用蘸水的画笔轻触蛹体，等待约一分钟使水分软化粘性物质 ，然后轻轻推动使其滑落到画笔上。
4. 用画笔在水中轻轻拨动所选的蛹，对其进行清洗，以去除唾液腺分泌的粘性物质及食物残渣。
5. 将清洁后的蛹转移至底部带有盖玻片（1 ½ 号盖玻片）的25 mm培养皿中。
6. 使用细条状的油泥或牙科蜡作为支撑物，将蛹固定，使待观察的组织最靠近盖玻片。
   注意：本研究中观察的组织包括蛹翅、蛹足、腹部组织母细胞或背部notum。实践中，任何位于蛹壳表面20 µm范围内的组织均可被观察到。
7. 小心调整蛹的方向，使目标组织与玻璃盖玻片表面平行。
8. 蛹固定后，用画笔将一层薄薄的硫代二甘醇（TDG）涂抹于蛹体与盖玻片之间的空隙中。

注意：TDG 可减少表面散射，匹配油的折射率，并允许氧气渗透组织¹³。不建议使用油，因为它们容易使组织缺氧，导致细胞行为迅速停止。

3. 成像

注意：成像时可能必须使用共聚焦显微镜，因为共聚焦特性可消除因强烈照射蛹壳而产生的大部分干扰背景信号。

1. 调整共聚焦显微镜的设置，以尽量减少照明对蛹发育和存活率的影响。为此，需在激发光强度与信号采集灵敏度之间取得平衡。使用Leica SP5进行成像时的典型配置包括：采用共振扫描器（8,000 Hz），激光功率设为2%（20%功率下的透射率为10%），针孔设为120 µm，线平均设为8。具体设置需根据实验条件进行调整。

注意：为分辨精细尺度特征，本方法中也成功使用了40X 和63X 油浸物镜（0.1 mm工作距离），但会限制焦深。

4. 分析

为分析图像帧、z轴层叠图像或视频，可将数据文件导入FIJI软件，该软件具备有效工具，用于查看、测量和修改文件以供展示¹⁴。例如，通过采样时间间隔和多维图像浏览器逐帧观察细胞从前期到末期的过程，可测量有丝分裂完成所需的时间。可使用测量工具对x、y 和z维度进行测量。有关该软件及其使用的详细说明，请参见：http://fiji.sc/Fiji。

结果

在假复层上皮中，例如发育中的Drosophila眼睛或发育中脊椎动物中枢神经系统的室层，细胞核会随着细胞周期发生被称为“核间期迁移”的运动。当细胞核位于或靠近基底表面时进行DNA复制，而当细胞核到达顶端表面时则进入有丝分裂^15,16。在头节外翻后的最初几个小时内，蛹翼细胞形成一个快速分裂的单层上皮。从早期蛹翼样本中以xyzt模式采集数据，每隔1分钟采集一次，每次切片间隔2 µm。在生成的三维影像中，有丝分裂仅在顶端表面被观察到（图1A）。在更偏基底位置的切片中未见有丝分裂的迹象（图1B），但可见新分裂产生的细胞核从顶端表面返回时发生的核运动。

讨论

为了观察、测量和量化分裂细胞的特征，需要建立一种简单的方法，通过共聚焦分析表达 His2AvGFP 的细胞，以观察活体果蝇（Drosophila ）翅芽上皮中的有丝分裂过程。该方法被用于证实翅芽中的细胞周期与假复层上皮中的细胞周期具有显著相似性：细胞核会移向上皮的顶端表面，并在此进入有丝分裂；在分裂末期（telophase）之后，细胞核再退回上皮层内部。因此，这种看似单层且非分层的上皮细胞表现出有限的有丝分裂间期核迁移现象。

对为果蝇（Drosophila）中脑虹（brainbow）类型活体成像而构建的公开可用品系和品系进行成像¹⁷¹¹，表明该技术可推广应用于其他生物学现象的研究。本文所述技术已用于生成时长从数分钟至10小时不等的视频。在一定程度上，显微镜参数随实验而变化。例如，延时成像的采样率必须与所观察生物学现象的特性相匹配：对于观察从前期到末期通常约需12分钟的细胞分裂过程，每分钟采集一组图像堆栈是合适的；而若要观察同一细胞中丝状伪足的行为，则需以更短的时间间隔（3秒）采集光学切片或图像...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇操作垫	Genesee Scientific	59-114	用于果蝇麻醉
CO2 气体	Airgas South	CD50	用于果蝇麻醉
调节阀	Airgas South		CO2 调节阀
果蝇培养管	Genesee Scientific	32-113RLBF	果蝇培养
Drosophila 品系：A9-Gal4 (Bl#8761)，His2Av-GFP (Bl#5941)，Sco/CyO HsCre (Bl#1092)，UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
玻璃底培养皿 #1 1/2	WillCo Wells BV		用于显微成像
硫代二甘醇	Fluka	88559	封片剂
油灰	美术用品商店		用于固定蛹的位置
画笔	美术用品商店		用于操作果蝇
精细镊子，Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
计算机	任意		用于图像/视频分析，需配备 8 GB 内存
Fiji 软件		免费软件 http://fiji.sc/Fiji	图像分析软件
共聚焦显微镜			任何快速扫描共聚焦显微镜均可满足需求
20X 干镜，以及 40X 或 63X 油镜	任意		用于组织、细胞及亚细胞结构的成像
浸油（非荧光）
体视显微镜	任意		用于果蝇操作