脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

摘要

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex vivo）检测表面蛋白表达的快速变化。

摘要

受调控的内吞运输是促进多种神经调节事件的核心机制，可通过动态控制受体、离子通道和转运蛋白在细胞膜表面的表达，在数分钟的时间尺度上发挥作用。 调控内吞运输的机制具有广泛多样性，不同蛋白质的运输过程受到不同机制的控制。研究运输过程分子基础的实验主要依赖细胞表面生物素化技术，以定量检测膜蛋白在细胞表面表达水平对外源性刺激和基因操作的响应变化。 然而，该方法主要局限于培养细胞，而培养细胞可能无法真实反映成年神经元中生理相关的运输机制。 此外，培养细胞的方法可能低估了不同脑区之间运输机制的特异性差异。 本文中，我们描述了一种将细胞表面生物素化技术拓展应用于急性脑片制备的方法。 我们证明，该方法能够高保真地检测成年神经元中膜蛋白表面水平的快速变化。 该方法在神经元内吞运输研究领域具有广泛的应用前景。

引言

胞吞运输是一种普遍存在的细胞机制，可精细调节多种整合膜蛋白在质膜上的表达。 胞吞作用将重要的营养物质递送至细胞内环境¹，并在受体激活后使其信号脱敏²。 此外，胞吞后的再循环返回质膜还可通过增加细胞表面蛋白的表达水平来增强细胞信号传导³。 而且，膜运输的紊乱与多种疾病和病理状态相关^4,5，凸显了研究调控蛋白胞吞运输的分子机制的重要性。 尽管许多蛋白依赖经典的网格蛋白介导的内化机制，但近年来越来越多的证据表明，多种不依赖网格蛋白的胞吞机制调控着日益增多的蛋白的胞吞能力^6,7。 因此，对在生理相关系统中促进运输的胞吞机制进行研究的需求显著增长。

在大脑中，受体、离子通道和神经递质转运蛋白的内吞运输在突触可塑性的建立^8-11以及对滥用药物的反应^12-15中起着关键作用，最终影响神经元的兴奋性和突触反应。 迄今为止，大多数神经元运输机制的研究依赖于异源表达系统或原代培养神经元，而这两种系统均可能无法可靠地反映成年神经元中实际存在的机制。 在此，我们报告了一种利用表面生物素化技术定量测定成年啮齿类动物脑急性切片中膜蛋白水平的方法。通过该方法，我们提供的数据显示，小鼠纹状体多巴胺转运蛋白在佛波酯介导的蛋白激酶C（PKC）激活后会迅速发生内化。

方案

所有动物操作和组织采集均按照马萨诸塞大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行，并遵循批准的方案编号 #A1506（Melikian，项目负责人）。

所需溶液

人工脑脊液（ACSF） - 每日新鲜配制

125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、1.2 mM MgCl₂、2.4 mM CaCl₂、26 mM NaHCO₃ 和 11 mM 葡萄糖

注意：配制人工脑脊液（ACSF）时，先制备不含 NaHCO₃ 和葡萄糖的 10 倍浓缩储备液。每日使用时，将 10 倍储备液稀释为 1 倍工作液，并添加新鲜的 NaHCO₃ 和葡萄糖。

蔗糖补充的ACSF（SACSF）——每日新鲜配制

250 mM 蔗糖，2.5 mM KCl，1.2 mM NaH₂PO₄，1.2 mM MgCl₂，2.4 mM CaCl₂，26 mM NaHCO₃ 和 11 mM 葡萄糖

注意：将SACSF配制成10倍浓缩液，不包含NaHCO₃和葡萄糖。每日用该10倍浓缩液现配1倍工作液，并补充新鲜的NaHCO₃和葡萄糖。

磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-SS-生物素（sulfo-NHS-SS-biotin，Pierce Chemical Company）

储备液应为200 mg/ml的DMSO溶液，可耐受多次冻融循环。分装后于-20 °C保存。丁二酸酯在水溶液中会迅速水解，因此工作液应在使用前立即配制并施加于脑片。

切片淬灭液

添加了100 mM甘氨酸的ACSF

RIPA裂解缓冲液

10 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1.0 mM EDTA，1% Triton-X-100，0.1% SDS，1% 脱氧胆酸钠

RIPA 缓冲液（含蛋白酶抑制剂，RIPA/PI）——需每日新鲜配制

在 RIPA 中添加 1 μM 亮抑酶肽、1 μM 胃蛋白酶抑制剂、1 μM 抑肽酶和 1 mM 苯甲基磺酰氟。

1. 制备脑切片

1. 配制新鲜的1x SACSF和1x ACSF。
2. 将SACSF置于装有冰的小烧杯中冷却。此溶液用于盛放 freshly 收集的小鼠脑组织。
3. 用95%/5% O₂/CO₂混合气体对ACSF和SACSF进行鼓泡充氧，冰上处理20分钟。
4. 为获得最佳组织活性，应使用P30-38阶段的小鼠。通过颈椎脱臼法处死动物并断头，迅速将脑组织取出并放入预冷且充氧的SACSF中。
5. 使用振动切片机在目标脑区切出300 μm厚的脑切片。
6. 如需要，可在恢复前对切片进行进一步解剖，以富集特定脑区，或分离左右半球，分别作为对照组和实验组切片。
7. 使用火焰抛光的巴斯德移液管，将切片转移至置于24孔板中的底部带网格的孵育室中。
8. 在持续轻柔鼓泡的充氧ACSF中，31 °C条件下孵育40分钟，使切片恢复。

2. 药物处理（如适用）与脑片生物素标记

1. 恢复后，用预热（37 °C）、持续通入95%/5% O₂/CO₂混合气体的ACSF溶液洗涤切片3次₂/CO₂.
2. 加入待测化合物，并在持续供氧条件下孵育。
   1. 为方便起见，加入1/10^th 10 倍浓缩药物的体积，并通过轻柔颠倒混匀。
   2. 将培养板在设定温度的水浴中轻轻振荡。
3. 药物处理后，用冰冻的ACSF冲洗3次，快速冷却切片。

3. 生物素标记表面蛋白

1. 在标记前立即用预冷的ACSF配制1.0 mg/ml的sulfo-NHS-SS-生物素溶液。
2. 将0.75 ml sulfo-NHS-SS-生物素加入脑片中，冰上孵育45分钟。
3. 用预冷的ACSF快速洗涤脑片三次，然后在冰上用预冷的ACSF继续孵育10分钟。
4. 用预冷的脑片淬灭缓冲液洗涤脑片三次，再在冰上用0.75 ml脑片淬灭缓冲液孵育两次，每次25分钟，以淬灭未反应的sulfo-NHS-SS-生物素。

4. 准备组织裂解液

1. 用经火焰抛光的巴斯德移液管将切片转移至预冷的 ACSF 中，清洗三次，然后用同一移液管将每一片切片转移至微量离心管中。
2. 以 200 × g 离心 1 分钟，轻轻沉淀切片组织，并小心吸除残留的 ACSF。
3. 加入 400 µl 预冷的 RIPA/PI 裂解液，用 P200 移液器上下吹打一次，使组织充分分散。
4. 将已分散的切片/RIPA 混合液转移至新的离心管中，在 4 °C 条件下旋转孵育 30 分钟，以完成细胞裂解。
5. 在 4 °C 条件下，以 18,000 × g 离心 15 分钟，沉淀细胞碎片。
6. 采用 BCA 蛋白定量法测定裂解液中的蛋白浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。

5. 分离生物素标记的蛋白质

1. 优化微珠/总蛋白比例。
   注意：不同脑区中各蛋白的表达水平可能存在显著差异。除非能够完全捕获特定组织裂解液中所有的生物素化蛋白，否则无法准确检测表面表达的潜在变化。因此，在开展新的脑片生物素化研究之前，必须通过实验确定特定蛋白/脑区的最佳微珠/总蛋白比例。
   1. 将 25 µl 链霉亲和素琼脂糖微珠与不断增加量的组织裂解液（大约范围为 25–200 µg）共同孵育，然后按照下述方法进行结合、洗涤和洗脱步骤。
   2. 定量分析所得的免疫反应性条带，并选择处于结合线性范围内的微珠/裂解液比例，以便准确量化蛋白表面表达的增加或减少。
2. 准备链霉亲和素-琼脂糖微珠
   1. 确定所有样品所需的微珠总体积。准备足够量的微珠体积，并额外多准备一份（即 4 个样品，每个样品 25 µl = 100 µl 微珠 + 额外一份 = 125 µl 微珠）。
   2. 涡旋混匀链霉亲和素微珠原液，并移取所需体积。若使用 P200 移液器，应剪去吸头末端以防止堵塞或损伤微珠。
   3. 用 0.5–1.0 ml RIPA/PI 缓冲液洗涤微珠 3 次，每次加入 RIPA 后均需涡旋混匀，并在洗涤间期通过离心（18,000 × g，1 分钟，室温）收集微珠。
   4. 使用连接真空泵的玻璃巴斯德吸管在洗涤间期吸除缓冲液。在玻璃巴斯德吸管末端连接塑料 P200 吸头可实现更精确的控制。前两次 洗涤无需彻底去除所有缓冲液，以免将微珠吸入吸管。最后一次洗涤后，应尽可能多地去除多余缓冲液，但避免吸入微珠。
   5. 加入 RIPA/PI 缓冲液，使微珠恢复至原始体积，通过上下吹打重悬微珠。此时避免涡旋，以防微珠粘附于管壁。
   6. 使用剪去末端的 P200 移液器将微珠分装至微量离心管中。在分装过程中多次上下吹打，以确保微珠均匀悬浮并分散于各管中。
3. 将生物素化蛋白与链霉亲和素微珠结合
   1. 将细胞裂解液分配至含有琼脂糖微珠的管中。对于需比较多个样品的实验，应确保每个样品使用相同量的蛋白，以实现准确比较。
   2. 加入额外的 RIPA/PI 缓冲液，使各样品体积达到最小 200 µl。这可确保样品在孵育过程中充分混合，并统一各样品间的蛋白浓度。
   3. 将管子置于旋转混合仪中，于 4 °C 下过夜孵育。
   4. 在另外的管子中，分别保留与每个样品所用裂解液体积相等的体积。或者，若样品体积较大，可改为保留部分总体积，以便适应 SDS-PAGE 凝胶的最大上样量。这些样品将用于将表面表达量标准化为总蛋白量。
   5. 加入等体积的 2x 或 1/5 体积的 6x SDS-PAGE 上样缓冲液，随后与微珠样品平行在 4 °C 下孵育，或储存于 -20 °C，待后续分析时使用。

6. 洗脱并分析样品

1. 在室温下以18,000 × g离心2分钟，使磁珠沉淀。
2. 吸除上清液，并用0.75 ml RIPA缓冲液洗涤磁珠三次。为尽量减少磁珠损失，每次洗涤后在磁珠上方保留少量缓冲液体积。最后一次洗涤后，尽可能彻底去除RIPA缓冲液，避免扰动磁珠沉淀。
3. 通过还原二硫键从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记的蛋白质。加入25 µl 2× SDS-PAGE还原上样缓冲液，充分涡旋混匀，室温下旋转孵育30分钟。
   注意：许多膜蛋白在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸时极易发生聚集，严重损害其电泳迁移能力。若所研究的蛋白存在此情况，应避免加热样品，改为在室温下缓慢洗脱。若必须煮沸（例如，同时检测的另一种蛋白需要煮沸），可在上样缓冲液中添加2 M尿素（终浓度）以减少聚集。尽管尿素在某些情况下可有效减少聚集，但常会影响条带形态。
4. 通过免疫印迹分析样品。
5. 解冻总裂解液样品，并与磁珠样品一同在室温下旋转孵育30分钟。
6. 在SDS-PAGE凝胶中分离蛋白质。
7. 通过免疫印迹鉴定目标蛋白。
   1. 确保在检测的线性范围内显影条带，以实现准确的定量分析。
   2. 为确认生物素化试剂未因细胞破损或完整性受损而进入胞内，从而标记胞内蛋白。最有效的方法是同时对所研究细胞类型特异的胞内蛋白进行平行免疫印迹检测。
   3. 定量分析条带密度，并将蛋白相对表面密度计算为总蛋白表达水平的百分比 。

结果

在细胞系中，神经元多巴胺转运体（dopamine transporter）会在蛋白激酶C（PKC）激活后发生内化^16-20。尽管已有大量研究报告了在多种细胞系和表达系统中PKC诱导的多巴胺转运体（DAT）表面表达减少现象，但在培养的多巴胺能神经元中验证这一发现仍具挑战性^21-23。我们采用小鼠纹状体脑片直接检测成年多巴胺能神经元中DAT是否会在PKC激活后发生内化。脑片制备完成后，沿中线将脑片分为两半，取相同平面的脑片分别用或不用1 µM佛波酯-13-乙酸酯（phorbol myristate-13 acetate, PMA）处理30分钟（37 °C）。处理结束后迅速冷却脑片，随后按照《实验方案》中所述方法对表面蛋白进行生物素标记并分离。免疫印迹实验平行检测DAT以及酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH），以评估生物素标记试剂是否进入多巴胺能神经元的细胞内区域。如图1（上图）所示，在基础条件（溶剂处理）下，小鼠纹状体中DAT的表面表达水平较高，细胞表面的DAT占总DAT的81.4±5.8%。经1 µ...

讨论

尽管长期以来已知内吞运输对大脑中的突触信号传导具有关键影响，但在成年神经元中定量测量蛋白质表面表达的变化一直具有挑战性。 在本研究中，我们报道了一种在急性脑切片中对表面蛋白质进行ex vivo标记的可靠方法。 脑切片制备技术长期以来被广泛用于电生理记录，因其可在制备后数小时内维持突触连接和细胞活性。此外，切片策略可被优化，以保留特定脑区之间的突触连接。

先前研究脑组织来源样本中神经元蛋白质转运的工作，主要依赖于突触体和原代培养神经元。急性脑片生物素标记方法相较于这两种方法具有多项优势：突触体已从轴突上物理分离，可能缺乏真实再现完整神经元蛋白质转运过程所必需的分子因子。 此外，突触体样本中常混杂有膜碎片，可能影响实验结果的准确性。 原代神经元培养通常来源于发育不成熟的神经元，这些神经元可能尚未充分分化为表达细胞特异性转运机制的成熟神经元表型。 相比之下，急性切片具有较高的细胞存活率，且来源于成年动物。 此外，可对表面运输情况进行比较 体内

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磺基-NHS-SS-生物素	Pierce	21331
链霉亲和素琼脂糖	Pierce	20347
免疫球蛋白G无、蛋白酶无的牛血清白蛋白	Sigma	A3059
振动式切片机	多种
摇动水浴箱	多种
Millicell 背景网状小室（8 µm 孔径）	Millipore	PI8P 012 50	可手洗后重复使用