大脑切片生物素化:一个前体内方法来衡量地区特有的质膜蛋白贩运成年神经元

内吞贩运是微调的各种整合膜蛋白的细胞膜呈现一个无处不在的细胞机制。内吞作用提供重要的营养物质向细胞内环境¹和麻痹受体信号响应受体激活^2。内吞再循环回至质膜可以通过增加蛋白质的表达水平在细胞表面³还增强细胞信号传导。此外，膜运输扰动有牵连的许多疾病和病理条件下^4,5，强调需要调查支配蛋白质内吞贩运分子机制。而许多蛋白质​​利用经典的网格蛋白依赖的内化机制，越来越多的证据，在过去数年证明了多个网格蛋白独立的内吞机制支配的增加数组的内吞潜在蛋白质^6,7。因此，有必要探讨促进生理系统有关拐卖的内吞机制已有很大的增长。

在大脑中，受体，离子通道和神经递质转运蛋白的内吞贩运在建立突触可塑性^8-11和应对滥用药物^12-15，最终影响神经细胞的兴奋性和突触反应的基础性作用。两者都不迄今为止，大多数神经元拐卖的研究都依赖于异源表达系统或原代培养的神经元，可以可靠地反映在作怪成年神经元的机制。在这里，我们报告说，使用表面生物素定量测量表面蛋白水平在成年啮齿类动物源性急性脑切片的方法。使用这种方法，我们提出了证明小鼠纹状体多巴胺转运蛋白迅速内化在数据重响应对佛波酯介导的蛋白激酶C（PKC）的活化。

所有的动物处理和组织收获是按照美国马萨诸塞大学医学院实验动物管理使用委员会大学（IACUC）的指引进行，继批准的协议＃A1506（Melikian，PI）。

所需的解决方案

人工脑脊液（学联） -使每日新鲜

125 mM氯化钠，2.5 mM的氯化钾，1.2毫米的NaH ₂ PO _4，1.2毫摩尔MgCl _2，2.4 mM的_氯化钙 ，26毫米的NaHCO _3，和11毫摩尔葡萄糖

注:准备学联为10倍原液，不含_碳酸氢钠和葡萄糖。每天做从10倍股票1X工作溶液，用新鲜的_碳酸氢钠和葡萄糖补充。

蔗糖补充学联（SACSF） -使每日新鲜

250毫米SUC升，2.5毫米氯化钾，1.2毫米的NaH ₂ PO _4，1.2毫摩尔MgCl _2，2.4 mM的_氯化钙 ，26毫米的NaHCO _3，和11毫摩尔葡萄糖

注:准备SACSF为10倍的贮备液，不含_碳酸氢钠和葡萄糖。每天做从10倍股票1X工作溶液，用新鲜的_碳酸氢钠和葡萄糖补充。

磺基-N-羟基琥珀酰基-SS-生物素 （磺基-NHS-SS-生物素，Pierce化学公司）

储备溶液应为200 mg / ml的DMSO中，并能抵抗多种冷冻/解冻循环。等分试样贮存于-20℃。琥珀酰酯水解迅速在水溶液中，使工作液应立即应用到片前做好准备。

片淬火解决方案

ACSF补充有100mM甘氨酸

RIPA裂解BuffeŘ

的10mM Tris，pH值7.4，150 mM氯化钠，1.0毫摩尔EDTA，1％的Triton-X-100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸盐钠

RIPA与蛋白酶抑制剂（RIPA / PI） -使每日新鲜

RIPA补充了1μM的亮肽素，1μM的胃蛋白酶抑制剂，1μM的抑肽酶和1mM苯甲基磺酰氟。

1。准备脑片

1. 让新鲜的1X SACSF和1x学联
2. 在一个小烧杯寒意SACSF冰上。这将被用于保持新鲜收获小鼠脑。
3. 通过用95％/ 5％的O ₂ / CO _2，20分钟，在冰上鼓泡饱和的ACSF和SACSF与氧气。
4. P30-38的小鼠应使用最佳的组织的生存能力。牺牲动物通过颈椎脱位和断头，迅速取出大脑进入预冷，含氧SACSF。
5. 用振动切片机，使感兴趣区域300μm的脑切片。
6. 如果需要的话，可以将它们进一步回收前解剖以富集特定脑区域或单独的左右半球分别作为对照组和实验的切片使用。
7. 用火抛光的巴斯德吸液管，转移切片网眼底套入24孔板腔。
8. 允许切片恢复为40分钟，31℃，含氧学联，具有持续，温和起泡。

2。药物治疗（如适用）和生物素片

1. 以下恢复，洗净切片3倍于预热（37℃），含氧学联冒泡不断与95％/ 5％O ₂ / CO _2。
2. 添加测试化合物，并培育具有连续充氧。
   1. 为方便起见，加10倍浓缩的药物一个^1/10量，并通过轻轻颠倒混匀。
   2. 摇板轻轻地在水浴中在所需的温度。
3. 继药物治疗，迅速寒意片在冰冷学联洗3次。

3。表面生物素化的蛋白质

1. 准备1.0毫克/毫升的前夕标签硫代NHS-SS-生物素在冰冷的学联。
2. 添加0.75毫升硫代NHS-SS-生物素片和切片孵育在冰上，45分钟。
3. 用冰冷学联快速洗片三次，然后孵育在冰冰冷学联10分钟。
4. 用冰冷的切片淬灭缓冲液冲洗切片3次，并培育与0.75毫升片骤冷缓冲液2次，25分钟，在冰上骤冷自由磺基-NHS-SS-生物素。

4。准备组织裂解液

1. 在冰冷学联洗净切片三次，用火抛光的巴斯德吸管每片转移到离心管中。
2. 轻轻离心200×g离心1分钟，小心吸出剩余学联沉淀切片。
3. 加入400μl冰冷的RIPA / PI和移液器向上打破了组织，下一次通过P200的点子ETTE。
4. 转移解离片/ RIPA到一个新的管和孵育30分钟，4℃，旋转，完成溶解。
5. 通过离心沉淀细胞碎片，18,000×g离心，15分钟，4°C。
6. 确定裂解物中的蛋白浓度使用BCA蛋白测定法，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准。

5。分离蛋白质生物素

1. 优化珠/总蛋白的比例。
   注:个别蛋白表达水平可以有很大的不同在不同的脑区。除非所有的组织裂解液的一定量的生物素化的蛋白质的被捕获，这是不可能精确地检测在表面上表达的任何潜在的变化。因此，就必须根据经验确定特定蛋白质/大脑区域产生一个新的切片生物素化研究着手之前最佳珠/总蛋白比率。
   1. 孵育25μL链亲和素琼脂糖珠的增加量组织裂解液（大致范围25-200微克），然后第继续进行如下所述的结合，洗涤和洗脱步骤。
   2. 量化所产生的免疫反应带，并选择绑定，这将允许增加或减少蛋白质表面表达准确定量的线性范围珠/裂解液的比例。
2. 准备链霉亲和琼脂糖珠
   1. 确定所需的所有样品总珠体积。准备了充足的珠子体积的金额加上一个额外的（ 即 4个样品在25μL/样本= 100μL珠+一个额外= 125μL珠。
   2. 旋涡链霉亲珠股票和吸管出所需的音量。如果使用的是P200的移液器，切断尖底，以防止堵塞或损坏珠。
   3. 在0.5-1.0毫升RIPA / PI珠洗3次离心18,000×g离心1分钟以去除防腐剂，每RIPA加入后涡旋和清洗间收集珠子，在室温脾气ATURE。
   4. 吸过使用连接到一个保温瓶玻璃巴斯德吸管清洗之间的缓冲区。吸气时，附着在玻璃巴斯德吸管的末端的塑料P200尖提供更精细的控制。它没有必要完全除去所有的缓冲器的第2次洗涤，如它的风险珠吸进移液管。最后一次洗涤后，去除尽可能多的多余的缓冲尽量不吸珠。
   5. 加入RIPA / PI带来珠回到他们原来的音量，上下吹打重悬。避免涡流在这一点上，作为珠会坚持到管壁。
   6. 分装成小珠用P200与尖端的离心管切断。吸管向上和向下采样之间数次，以确保珠保持均匀悬浮分散管中。
3. 结合生物素蛋白链亲和素磁珠
   1. 分发细胞裂解物，以含有的琼脂糖珠的管中。对于实验磨片再多个样品进行比较，确保使用的蛋白质相同数量的每个样品进行精确的比较。
   2. 添加额外的RIPA / PI带给样品200μl的最小体积。这保证了样品将在孵化过程中充分混合，也统一了整个样品的蛋白浓度。
   3. 放置在管的管肩和搅拌过夜，在4℃下
   4. 在单独的管中，分配用于每个样品的总裂解物体积的等效。另外，如果样品体积都高，总裂解物体积的一小部分可以被保留，而不是，以适应在SDS-PAGE凝胶上的最大负载量。这些将被用于归一化的表面表达的总蛋白量。
   5. 加2倍的任一个等于或体积的1/5体积的6倍SDS-PAGE样品缓冲液并任孵育在4℃下，在平行珠的样品，或储存在-20℃直至样品进行了分析。

1. 通过离心18,000×g离心2分钟，在室温下沉淀的珠子。
2. 吸上清，洗珠三次0.75毫升RIPA。为了尽量减少损失珠，留下缓冲的一个小头体积上面珠洗之间。最后一次洗涤后，除去尽可能多的RIPA尽可能不破坏珠粒料。
3. 通过减少二硫键洗脱生物素蛋白链菌素的磁珠。加25μl的2×SDS-PAGE还原样品缓冲液，涡旋以及与旋转样品30分钟，室温。
   注意:许多膜蛋白具有较高的聚集倾向时，在SDS-PAGE样品缓冲液煮沸，严重影响其电泳迁移率。如果这是正在研究的蛋白质的情况下，避免加热样品，相反，洗脱在室温下缓慢。如果煮沸是绝对必要的（ 例如 ，如果在平行评估的另一种蛋白，需要煮沸），SAMPLë缓冲器可以用2M尿素（终浓度）进行补充，以减少聚集。而有效地减少聚集在某些情况下，尿素往往损害带的外观。
4. 通过免疫印迹分析样品。
5. 解冻总裂解物样品，并旋转的同时，胎圈的样品，30分钟，室温。
6. 分离的蛋白质在SDS-PAGE凝胶。
7. 通过免疫印迹鉴定目的蛋白（S）。
   1. 可以肯定的是，乐队在检测的正确量化的线性范围检测。
   2. 以确保该生物素化试剂并没有通过受损/受损细胞得以进入细胞内的蛋白质。这最好是通过免疫印迹法在平行于特定于被研究的细胞类型的细胞内蛋白质来实现的。
   3. 量化带的密度，并计算相对蛋白质表面密度为总蛋白的表达水平的百分比。

神经元的多巴胺转运蛋白被内响应于PKC活化在细胞系16-20。尽管许多报告表明在各种细胞系和表达系统的PKC诱导的DAT表面的损失，已经具有挑战性证实这一发现在培养的多巴胺能神经元21-23。我们用小鼠纹状体切片直接测试DAT是否内化响应于PKC活化在成年多巴胺能神经元。以下切片制备，切片沿着从相同平面上的中线和切片切成对半收治±1μM佛波醇肉豆蔻酸酯-13乙酸酯（PMA）处理30分钟，37℃。切片迅速冷却和表面蛋白进行生物素化，并作为议定书所述隔离。免疫印迹进行探测为DAT，同时还为酪氨酸羟化酶（TH），并联，以测量生物素化试剂是否获得了在多巴胺能神经元的细胞内的任何访问。如见于图1（ 顶部），我们发现在小鼠纹状体健壮DAT表面表达下基底（载体处理的）的条件下，总的DAT在细胞表面的81.4±5.8％。 PKC活化与1μM的PMA，30分钟，37℃下的DAT表面表达显著下降到60.8±5.2％的总的DAT，其对应于约30％的损失的DAT从质膜。相比之下，只有1.6±0.4％的总TH的生物素化（ 图1，下图），而其细胞内定位和确认该生物素化试剂被排除在多巴胺能神经元的细胞内是一致的。

图1。急性PKC活化降低成年纹状体神经元多巴胺转运体表面的水平。鼠纹状体切片生物素ylation。急性小鼠纹状体切片制备如协议描述和治疗±1微米的PMA，30分钟，37°C。表面蛋白进行共价偶联到生物素并进行分离，批次链霉亲和层析。样品进行SDS-PAGE和免疫印迹法用大鼠抗-DAT和小鼠抗TH抗体。免疫反应带被抓获来自nonsaturating带一个VersaDoc CCD相机成像站和密度，使用数量One软件定量。上图:代表免疫生物素标记的显示和总DAT和TH以下的指示处理。底部:平均数据。生物素化的蛋白质的信号表示为％总数，学生的t检验，p <0.03，N = 6蛋白±标准差*从控制显着差异。

作者没有财务利益，这项工作冲突。